張 琴

(上海野生動物園，上海，201399)

袋鼠傳染性腹瀉病的病原分離與鑒定

張 琴

(上海野生動物園，上海，201399)

稿件運(yùn)行過程

袋鼠； 傳染性腹瀉； 大腸桿菌 O9； O79菌株

袋鼠(Macropusspp.)是袋鼠目(Diprotodontia)袋鼠科(Macropodidae)的有袋動物，主要分布于澳大利亞大陸和巴布亞新幾內(nèi)亞的部分地區(qū)。上海野生動物園飼養(yǎng)的主要是東部灰大袋鼠(Macropusgiganteus)和赤大袋鼠(Macropusrufus)兩個種類，種群大小隨著發(fā)病次數(shù)的增多而下降。開園以來先后發(fā)生過5次傳染性腹瀉病，平均發(fā)病率達(dá)32.7%，死亡率高達(dá)72.9%，對袋鼠的生命健康造成極大的威脅，也給上海野生動物園造成極大的損失。為了找到發(fā)病的病原，預(yù)防此類疾病的再次發(fā)生，我們總結(jié)了每次流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果、臨床診查特征、病理剖檢情況以及實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，確診為引起本病的病原為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，并對菌體抗原進(jìn)行鑒定，結(jié)果為O9菌株和O79菌株。此病例在國內(nèi)未見報道，只有徐麟木等報道過袋鼠球蟲和大腸桿菌混合感染的病例[1]，而上海野生動物園發(fā)病的病原純?yōu)榇竽c桿菌感染，并且通過制作自家苗免疫后，取得了理想的防治效果?，F(xiàn)將診斷的經(jīng)過報告如下。

1 發(fā)病情況

上海野生動物園袋鼠自開園以來發(fā)生過5次傳染性腹瀉病的流行(表1)。發(fā)病季節(jié)主要是在春季(3～4月)和秋季(10～11月)。春季發(fā)病有2批，分別在2003年和2010年；秋季發(fā)病的有3批，分別在2002年、2009年和2011年。從表中可以看出春季發(fā)病都是連著前一年秋季的，且春季發(fā)病率(19.4%、22.7%)要比秋季(31.8%、30.4%、68.2%)的低。前后共發(fā)病48頭次，死亡35只(15♂20♀)，平均發(fā)病率32.7%，致死率達(dá)72.9%。發(fā)病不分年齡和性別，但分種類。根據(jù)日期劃分，前面3次發(fā)病和死亡的都是赤大袋鼠(文中簡稱赤大)，死亡共計23只，平均死亡率為80.9%(3次死亡率為85.7%、85.7%、71.4%)。后面2次死亡的全是東部灰大袋鼠(文中簡稱灰大)，共計12只，平均死亡率為60%(2次死亡率都為60%)。此病每次流行時間為7～14 d。

表1 5次發(fā)病情況的數(shù)據(jù)統(tǒng)計

Tab.1 The data statistics on the incidence of the diseases in 5 times

注：發(fā)病率=動物發(fā)病數(shù)/動物存欄數(shù)，死亡率=動物死亡/動物發(fā)病數(shù)

Note：Morbidity=Numbers of disease kangaroo/ Numbers of all kangaroo，Mortality=Numbers of dead kangaroo/ Numbers of disease kangaroo

2 臨床癥狀與治療

赤大袋鼠發(fā)病時主要臨床癥狀為食欲廢絕，而后呈水樣便腹瀉，嚴(yán)重時呈黑色稀水樣便或血便，且至后期呈脫水狀態(tài)，精神萎靡、呆立，糞失禁；體溫在病初輕度升高為37℃左右或正常，正常(35.8±1.2)℃，個別升高至39.9℃，而后溫度變化不大，除了在臨死之前；病程一般在2～5 d死亡，最急性的病例第一天晚食欲與糞便都正常，第二天晨發(fā)現(xiàn)死亡；白細(xì)胞嚴(yán)重降低，發(fā)現(xiàn)不食時白細(xì)胞都極端偏低，在1 000個/mm3左右，正常為(4 970±1 870)個/mm3，最低的達(dá)到500個/mm3。

灰大袋鼠發(fā)病時的臨床癥狀和赤大袋鼠基本相同，體溫在病初輕度升高為36.5℃左右，正常(35.3±1.6)℃，個別也升高至39.9℃。灰大袋鼠剛發(fā)病時白細(xì)胞降低或不變，正常為(6 250±3 210)個/mm3，而后隨著病程的發(fā)展，白細(xì)胞迅速地降低，最低的達(dá)到500個/mm3。有的尿液隱血。

治療原則是以抗菌消炎、止瀉止血，平衡補(bǔ)液支持療法。根據(jù)死亡動物培養(yǎng)出的細(xì)菌而選擇的高敏抗生素治療，但治療效果極差，致死率較高。

3 剖檢病變

赤大袋鼠剖解的主要病變集中在腹腔。腹膜呈大面積條狀或斑點(diǎn)狀出血(圖1)，腸系膜嚴(yán)重出血(圖2)。胃壁菲薄，黏膜充血出血，特別是在胃的近幽門處有大面積的黏膜脫落和出血，病程長的胃壁有多處出血性潰瘍灶(圖3)。十二指腸、空腸和回腸段腸壁菲薄、腸黏膜脫落，腸內(nèi)充滿暗紅色腸液。結(jié)腸靠近直腸段有多處壞死段，壞死部分外觀為暗紅色(圖4)，切開有暗紅色偽膜，腸壁呈縱條狀增厚約1～2 cm，增厚后局部隆起呈紐扣狀。病程長的可達(dá)月余，但終以死亡轉(zhuǎn)歸，腸壁嚴(yán)重增生，堵塞腸腔，形成類似香腸樣病變。腸系膜淋巴結(jié)嚴(yán)重的腫大、出血，呈暗紅色；頜下淋巴結(jié)、肩前淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)腫大、出血、呈暗褐色，淋巴結(jié)周圍呈膠凍樣浸潤、水腫、出血。肝臟色澤深暗，有的表面有大量的針尖樣出血點(diǎn)，有的邊緣出血。腎臟質(zhì)地軟，嚴(yán)重的水腫、瘀血，皮質(zhì)呈暗紅色出血；心肌基本正常，少數(shù)有大小不一的出血點(diǎn)。肺有不同程度瘀血。

圖1 腹部大面積斑點(diǎn)狀出血Fig.1 Massive abdominal hemorrhage

圖2 回腸系膜大面積出血Fig.2 Congestion in the mesentery

圖3 胃壁有多處出血性潰瘍灶Fig.3 Multiple hemorrhagic ulcer in the stomach

灰大袋鼠剖解的主要病變和赤大袋鼠基本相同，但灰大袋鼠的一部分病例的肝臟表面散在彌漫性的針尖狀白色結(jié)節(jié)。

圖4 腸段呈暗紅色壞死段Fig.4 Ileum was dark red and necrosis

4 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌取肝、脾、腎、心、頜下淋巴結(jié)分別進(jìn)行普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)；無菌取血液在增菌雙相液進(jìn)行培養(yǎng)；無菌取脾、肝、腸內(nèi)容物分別接種于厭氧培養(yǎng)基上，進(jìn)行厭氧單皿法培養(yǎng)。再分別從每個培養(yǎng)皿內(nèi)長出的菌落取2～3個可疑菌落再分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、沙門氏菌篩選顯色培養(yǎng)基和大腸桿菌O157篩選顯色培養(yǎng)基。上述各培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶都37℃培養(yǎng)18～24 h。各種培養(yǎng)基是由上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司生產(chǎn)。

各個臟器培養(yǎng)出的菌落眼觀基本一致。普通培養(yǎng)基上可見圓形、濕潤、隆起、光滑而邊緣整齊的、露珠樣的菌落。血平皿上可見生長為圓形、濕潤、光滑的不溶血的菌落。厭氧培養(yǎng)基上可見針尖樣小菌落。增菌液內(nèi)培養(yǎng)的血，可見明顯的均勻渾濁，液面管壁有菌環(huán)，管底有黏性沉淀。脾、肝在厭氧培養(yǎng)基上可見密集細(xì)小的菌落生長，腸內(nèi)容物在厭氧培養(yǎng)基上也有密集細(xì)小的菌落生長，偶有個別的袋鼠同時有大菌落生長，染色為革蘭氏陽性桿菌。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成黑色帶金屬光澤的圓形菌落。麥康培養(yǎng)基上形成粉色圓形菌落。沙門氏菌篩選顯色培養(yǎng)基上長有淡藍(lán)色的菌落，未見粉紫色菌落，故非為沙門氏菌。在大腸桿菌O157篩選顯色培養(yǎng)基上呈鐵藍(lán)色菌落，未見紫紅色菌落，故非為大腸桿菌O157。

每批次發(fā)病后所培養(yǎng)的結(jié)果高度一致，只是個別個體還有其他細(xì)菌混合感染。而且個別急性發(fā)病袋鼠的脾和腎培養(yǎng)未見任何菌落生長。

4.2 染色鏡檢

在普通培養(yǎng)基、血培養(yǎng)基和厭氧培養(yǎng)基上挑取可疑菌落2～3個，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果基本一致?？梢妰啥寺陨畹?、多數(shù)散在排列，偶爾有2～3個連在一起的革蘭氏陰性無芽孢的中等大小的直桿菌。

4.3 生化試驗(yàn)

挑取麥康凱培養(yǎng)基上的可疑菌落再接種于普通培養(yǎng)基，37℃，18～24 h培養(yǎng)后，用白金耳挑取2～3個菌落于0.85%生理鹽水2 mL內(nèi)，制成McFarland(麥?zhǔn)媳葷岱?0.5濁度的菌懸液。再用滅菌滴管接種于生化發(fā)酵管內(nèi)，其中精氨酸及其對照培養(yǎng)基、賴氨酸和鳥氨酸及其對照管培養(yǎng)基，在接種后各加滅菌液狀石蠟0.5 mL。35～37℃培養(yǎng)18～24 h后判定。氧化酶試驗(yàn)紙條用蒸餾水浸濕后，再用白金環(huán)挑取菌落，涂抹于試紙上，根據(jù)顏色反應(yīng)與否判斷。每次生化結(jié)果基本一致(表2)。

表2 此菌生化反應(yīng)結(jié)果

Tab.2 Results of biochemical reaction of the bacteria

根據(jù)革蘭氏陰性桿菌新編碼鑒定手冊[2]，結(jié)果鑒定為大腸埃希氏菌。

4.4 血清學(xué)鑒定

4.4.1 “O”抗原的制備

將純培養(yǎng)的被檢菌株分別接種在普通瓊脂培養(yǎng)基和LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，用0.5%石炭酸生理鹽水2～3 mL洗下普通瓊脂培養(yǎng)物，放在試管中制成懸液，然后與液體培養(yǎng)物一起置于120℃，高壓2 h，以破壞“K”抗原，制備成高壓抗原。將制得的菌體再用無菌生理鹽水洗滌，以8 000 rpm離心10 min，棄去上清液。最后將菌體用0.5%石炭酸生理鹽水稀釋成含菌109個/mL的菌懸液，置4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4.4.2 “O”因子血清的稀釋

多價血清的配制：將不同大腸埃希氏菌因子血清混合溶解在10 mL 0.5%的石炭酸生理鹽水中，混勻后分裝入1.5 mL指形管中，置于2～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

單因子血清的配制：將一種大腸埃希氏菌因子血清溶解在5 mL 0.5%的石炭酸生理鹽水中，混勻后分裝入1.5 mL指形管中，置于2～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4.4.3 菌株“O”抗原的鑒定

分離菌株的血清型鑒定參照參考文獻(xiàn)[3-4]所述方法進(jìn)行。用接種環(huán)挑取一環(huán)多價血清后，再挑取一環(huán)制備好的抗原于玻板上，將多因子血清與高壓滅活的抗原在玻板上進(jìn)行混勻后，觀察其凝集反應(yīng)，半分鐘內(nèi)能夠出現(xiàn)明顯凝集反應(yīng)即為“陽性”反應(yīng)。若為陽性，再選取多因子血清所對應(yīng)的單因子血清與此抗原進(jìn)行玻板凝集反應(yīng)；同時以高壓滅活抗原與0.5%的石炭酸生理鹽水混合物作為對照，觀察有無自凝現(xiàn)象。

4.4.4 鑒定結(jié)果

根據(jù)玻板凝集反應(yīng)，最終確定大腸埃希氏菌為O9和O79兩個血清型。

4.5 藥敏試驗(yàn)

把制成McFarland(麥?zhǔn)媳葷岱?0.5濁度的菌懸液，用滅菌棉簽涂抹普通瓊脂，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥敏結(jié)果以抑菌圈直徑(mm)作為判定標(biāo)準(zhǔn)，20以上判定為極敏，15～20判定為高敏，10～14判定為中敏，10以下判定為低敏，0判定為不敏。由于發(fā)病5次，每次都有不同藥物藥敏記錄，且結(jié)果不統(tǒng)一。所以記錄格式為(幾次高敏幾次中敏幾次低敏幾次不敏/總共做了幾次：簡稱n極n高n中n低n不/N)。

GRNN神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的第一層為徑向基網(wǎng)絡(luò)層，||dist||表示這一層的權(quán)值函數(shù)，它是歐幾里德距離度量函數(shù)，用來計算網(wǎng)絡(luò)輸入與第一層的權(quán)值iIW1,1之間的距離。圖中符號“·*”表示||dist||的輸出值與閥值b1的元素之間的乘積關(guān)系，并將結(jié)果形成凈輸入n1，傳送到傳遞函數(shù)。徑向基網(wǎng)絡(luò)層的傳遞函數(shù)一般使用用高斯函數(shù)Ri(x)=exp(-||x-ci||/2σi2)。σi被稱為光滑因子，σi越大基函數(shù)越平緩。

丁胺卡那(1極1高1中2不/5)，慶大(1高3中1不/4)，恩諾沙星(1高1中1不/3)，呋喃妥因(3高1不/4)，頭孢三嗪(1極1高1不/3)，頭孢他啶(1極1高1不/3)，頭孢唑林(2高2不/4)，諾氟沙星(1極3不/4)，頭孢噻肟(1極2不/3)，氧哌嗪青霉素(1高1中1不/3)，氯霉素(1極2不/3)，哌拉西林鈉(1低/1)，頭孢哌酮(1低/1)，阿奇霉素(1低/1)，阿莫西林(1低/1)，妥布霉素(1低/1)，復(fù)合磺胺(4不/4)，頭孢呋辛、克林、環(huán)丙沙星、氧氟沙星均(2不/2)，青霉素、四環(huán)素、紅霉素、鏈霉素、利福平、萬古霉素、奧羅西林、林可、依諾沙星均(1不/1)。

4.6 動物試驗(yàn)

采用生化試驗(yàn)鑒定為大腸桿菌的菌落，移接于普通肉湯培養(yǎng)基中，恒溫37℃，18～24 h，進(jìn)行增菌培養(yǎng)，所得的增菌純培養(yǎng)液作為動物試驗(yàn)的病原。由于本病例是多次發(fā)病的原因，共做過3次小白鼠毒力試驗(yàn)，3次結(jié)果高度一致。2次兔子毒力試驗(yàn)，結(jié)果也是高度一致。

實(shí)驗(yàn)小白鼠購買于上海西普爾-必凱試驗(yàn)動物有限公司，云南系，24只(體重20 g)，12♂12♀，雌雄各半，分為6組，每組4只。取肉湯增菌純培養(yǎng)液0.3 mL給予A組腹腔注射，B組口服，C組皮下注射，D組腹腔注射空白肉湯0.3 mL，作為對照組。E組小鼠腹腔注射滅菌生理鹽水0.3 mL，作為空白對照。20只小白鼠均隔離飼養(yǎng)72 h，定期觀察，記錄小白鼠發(fā)病，死亡情況(表3)。

對A組死亡小鼠剖解，結(jié)果為從十二指腸至回腸段腸壁變薄而黃，充滿氣體，剖開腸壁內(nèi)可見黃綠色液體，其余個別小鼠有肺充血，肝呈暗綠色，腹腔內(nèi)臟器壁層充血。取死亡小鼠心血、肝、腎進(jìn)行分離培養(yǎng)，經(jīng)鑒定，分離菌同原感染菌完全相同。

實(shí)驗(yàn)兔6只購于市場，年齡為1歲，3♂3♀，雌雄各半，分為2組。采購回來飼養(yǎng)3 d后，A組給予腹腔注射肉湯增菌純培養(yǎng)液4 mL，B組給予口服肉湯增菌純培養(yǎng)液4 mL。腹腔注射生理鹽水4 mL，作為對照。每天觀察以及采血記錄(表4)。

表3 大腸埃希氏菌對小白鼠攻毒試驗(yàn)的結(jié)果

Tab.3 The results of escherichia coli poisoning attack test in mice

表4 大腸埃希氏菌對兔攻毒試驗(yàn)的結(jié)果

Tab.4 The results of escherichia coli poisoning attack test in rabbits

4.7 其他病原檢測

4.7.1 寄生蟲的檢測

刮取多段出血腸段的內(nèi)容物，置于載玻片直接壓片觀察，未見可疑的蟲卵。

4.7.2 其他可能毒素的動物試驗(yàn)

取出血的回腸段腸內(nèi)容物，與等量的生理鹽水混合離心后，分別取其上清液5 mL給2只實(shí)驗(yàn)兔口服，觀察3 d，體溫食欲都無異常。同時取其上清液3 mL給2只實(shí)驗(yàn)兔分別肌注，觀察3 d。第二天體溫升高至40.5℃，第三天恢復(fù)，期間食欲無異常。

4.7.3 病毒檢測

主要病變臟器經(jīng)過電鏡掃描未見可疑病毒。

5 討論

5.1 根據(jù)流行病學(xué)的調(diào)查、臨床癥狀、剖檢病變的分析，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷，上海野生動物園袋鼠傳染性腹瀉的病原為大腸埃希氏菌，并根據(jù)其菌體抗原鑒定為O9菌株和O79菌株。

5.2 大腸埃希氏菌，俗稱大腸桿菌，是人和溫和動物腸道內(nèi)正常菌群的主要成員之一，為條件性致病菌。根據(jù)菌體抗原(O)的不同，大腸桿菌分為166型，但致病性的血清型數(shù)量是有限的，常引起腹瀉。根據(jù)毒力因子與發(fā)病機(jī)制的不同，與動物疾病有關(guān)的病原性大腸桿菌可分為5類，其中EHEC(腸出血性大腸桿菌)中O157最為典型癥狀為出血性腹瀉，嚴(yán)重者可并發(fā)急性腎病。此次病例雖然排除了O157存在，但出現(xiàn)的臨床癥狀和其非常相似，特別是腸出血和部分腎的病變，尤其接種的實(shí)驗(yàn)小鼠剖解的結(jié)果也高度一致。葛樹剛等撰寫的腸出血性大腸桿菌的研究進(jìn)展中提到EHEC包括O26、O111、O121等10余種血清型，但未見O79菌株是否也屬于EHEC[5]，有待于進(jìn)一步證實(shí)。而O9菌株已被證實(shí)屬于ETEC(產(chǎn)腸毒素大腸桿菌)[6]，易引起人和幼畜腹瀉最常見的病原性大腸桿菌。但這次病例感染于袋鼠卻不分年齡，這是個特異之處，也是說明此次細(xì)菌的來勢兇猛，以及袋鼠可能比較敏感此大腸桿菌。

5.3 鑒于此次發(fā)病情況的調(diào)查，赤大袋鼠比灰大袋鼠發(fā)病數(shù)量多，且按發(fā)病的時間可看出，前面3次都是赤大發(fā)病，后面2次才是灰大。而后面2次發(fā)病時赤大的存欄數(shù)相比灰大來說要少得多，也許這是后面2次只是灰大發(fā)病的又一重要原因。從表1還可以得出赤大平均死亡率為80.9%，而灰大平均死亡率為60%，明顯赤大的死亡率高于灰大。是否赤大比灰大更易感此大腸桿菌，有待于以后進(jìn)一步探究。

5.4 此次病例對藥敏結(jié)果不統(tǒng)一，且對大多數(shù)抗生素不敏感，對暫時敏感的抗生素也很快產(chǎn)生耐藥性，故臨床治療效果很差。此藥敏結(jié)果和賀丹丹等對不同動物源大腸桿菌的耐藥性調(diào)查結(jié)果一致[7]。本病病程短，病情劇烈，一旦發(fā)病死亡率高，鑒于多次經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，在防治上改變過去的單純依賴抗生素的方法，采用從分離到的菌株作為抗原，制備成自家滅活苗免疫袋鼠預(yù)防，預(yù)防至今未出現(xiàn)新的病例，達(dá)到了預(yù)期預(yù)防的良好效果。

5.5 上海野生動物園的袋鼠是大場地的半開放式飼養(yǎng)，所以對環(huán)境的控制比較差，容易引起大規(guī)模的疾病發(fā)生，因此筆者認(rèn)為建立完善的消毒制度也是非常重要的，特別是在易發(fā)病季節(jié)每年的春季和秋季。每次發(fā)病多發(fā)生于長時間陰雨或者游客量較大以后，應(yīng)激因素是本病發(fā)生的誘因，應(yīng)減少動物的應(yīng)激，提高動物的抵抗力可減少和防止本病的發(fā)生。

致謝：非常感謝同事徐春忠、吳昆、馮永其、段俊堂、姜傳坤、徐靜、王艷君等提供的前后多次發(fā)病原始資料和實(shí)驗(yàn)資料；特別感謝揚(yáng)州大學(xué)的陳素娟老師的幫助。

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Kangaroo； Infectious diarrhea；Escherichiacoli； O9 strain and O79 strain

袋鼠(Macropus)傳染性腹瀉病在上海野生動物園先后發(fā)生過5次，平均發(fā)病率為32.7%，致死率為72.9%，造成了巨大損失。通過總結(jié)每次發(fā)病的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果、臨床診查特征、病理剖檢情況、實(shí)驗(yàn)室分離鑒定以及動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確診引起本病的病原為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，并根據(jù)菌體O抗原鑒定為O9菌株和O79菌株。由于此大腸桿菌對許多抗菌藥不敏感，或?qū)簳r敏感的抗生素也很快產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果極差。因此通過此次病原的分離確診，得以用制作自家苗的免疫方法，預(yù)防了袋鼠傳染性腹瀉病的再次發(fā)生。

Isolation and Identification of the Infectious Diarrhea Disease Pathogen in Kangaroo

Zhang Qin

(Shanghai Wild Animal Park，Shanghai，201399，China)

There have been five outbreaks of infectious diarrhea among Kangaroo at Shanghai Wild Animal Park and these caused enormous losses.The morbidity and mortality due to diarrhea were 32.7% and 72.9%，respectively.By summarizing the epidemiological survey，clinical symptoms，pathological alteration，laboratory examination and animal experiment of each outbreak，we confirmed that the diarrhea was caused by pathogenicEscherichiacolithat we identified as the O9 strain and O79 strain according to the bacteria O antigen test.The treatment effect was very poor because thisE.colistrain is resistant to many antibiotics，or temporarily sensitive to some antibiotics but soon resistant.We formulated our own vaccine by isolation of the pathogeny to protect kangaroos from infectious diarrhea.

張琴，女，42歲，學(xué)士，中級獸醫(yī)師；主要從事野生動物臨床診斷和治療研究。E-mail：zhangqin555333@qq.com

2016-09-28

S858.9

A

修回日期：2016-11-10

發(fā)表日期：2017-05-10

2310-1490(2017)02-300-06