楊光勇 郭海濤 劉茜明 劉莉莉 何光志

重組 IL-4R蛋白對(duì) SD大鼠過敏性哮喘干預(yù)作用的研究

楊光勇 郭海濤 劉茜明 劉莉莉 何光志

目的 探索重組IL-4R蛋白對(duì)過敏性哮喘動(dòng)物模型的干預(yù)作用。方法 選擇6周齡SD大鼠60只，采用安全隨機(jī)分組法分成哮喘模型組、IL-4R組、布地奈德組和對(duì)照組，每組15只。哮喘模型組在腹部選取3處于皮下注射10%雞卵清白蛋白（OVA）混合液1ml（OVA 100mg、氫氧化鋁100mg及滅活的百日咳桿菌5×109個(gè)）進(jìn)行致敏，1周后用上述同樣藥物再進(jìn)行致敏，第2次致敏1周后將大鼠分別放入不完全封閉的箱中，用5%OVA與0.9%氯化鈉混合溶液，連續(xù)10d超聲霧化激發(fā)30min。IL-4R組和布地奈德組同法造模，但每次霧化激發(fā)前30min，IL-4R組腹腔注射重組IL-4R蛋白稀釋液（400μg/d）。布地奈德組腹腔注射布地奈德稀釋液（400μg/d），對(duì)照組用0.9%氯化鈉溶液連續(xù)10d超聲霧化激發(fā)30min。取4組大鼠肺組織作HE染色的光鏡病理切片，觀察肺組織病理變化。建立間接ELISA方法，檢測實(shí)驗(yàn)中4組大鼠肺泡灌洗液中的IL-4和IFN-γ的含量。結(jié)果 哮喘模型組大鼠肺組織有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，對(duì)照組大鼠肺組織幾乎無嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，IL-4R組和布地奈德組大鼠肺組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤明顯少于哮喘模型組。IL-4R組和布地奈德組肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ的含量明顯高于哮喘模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 研究結(jié)果提示IL-4R蛋白對(duì)過敏性哮喘有良好的干預(yù)作用。

IL-4R IFN-γ ELISA 過敏性哮喘

過敏性哮喘占所有哮喘患者的70%，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前認(rèn)為過敏性哮喘主要是由多種炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等細(xì)胞因子共同參與，導(dǎo)致慢性過敏性氣道炎癥性疾病，而IL-4和IFN-γ等細(xì)胞因子在過敏性哮喘發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用[1]。IL-4受體（IL-4R）與IL-4特異性結(jié)合后可使IL-4無法發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，通過抑制IL-4和IL-4R抗體（IL-4Rα）對(duì)過敏性哮喘起到有效地免疫調(diào)節(jié)作用[2-3]，并有望成為治療過敏性哮喘的有效途徑。本研究使用重組IL-4R蛋白干預(yù)過敏性哮喘SD大鼠動(dòng)物模型并檢測肺泡灌洗液中的IL-4和IFN-γ的含量，探索重組IL-4R蛋白對(duì)過敏性哮喘動(dòng)物模型的干預(yù)作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 6周齡SD大鼠60只，雌雄各30只，購自重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司（批號(hào)：500903559023203）；重組IL-4R蛋白（批號(hào)：LC08AP1102）購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；大鼠IL-4 ELISA Kit（批號(hào)：20130013）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；大鼠IFN-γELISA Kit（批號(hào)：20130013），杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；滅活的百日咳桿菌原液，北京天壇生物制品股份有限公司；雷諾考特（布地奈德鼻噴霧劑，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字J20090079，瑞典阿斯利康公司）；抗IL-4陽性標(biāo)準(zhǔn)樣本和陰性標(biāo)準(zhǔn)樣本、抗IFN-γ陽性標(biāo)準(zhǔn)樣本和陰性標(biāo)準(zhǔn)樣本各1份均由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠建模與分組參考文獻(xiàn)[4]，采用安全隨機(jī)分組法分成哮喘模型組、IL-4R組、布地奈德組和對(duì)照組，每組15只。哮喘模型組在腹部選取3處于皮下注射10%的雞卵清白蛋白（OVA）混合液1ml（OVA 100mg、氫氧化鋁100mg及滅活的百日咳桿菌5×109個(gè)）進(jìn)行致敏，1周后用上述同樣藥物再進(jìn)行致敏，第2次致敏1周后將大鼠分別放入不完全封閉的箱中，用5%OVA與0.9%氯化鈉溶液混合，連續(xù)10d超聲霧化激發(fā)30min。IL-4R組和布地奈德組與哮喘模型組造模方法處理一致，但每次霧化激發(fā)前30min，給IL-4R組大鼠腹腔注射治療劑量的重組IL-4R蛋白稀釋液（400μg/d）[5]，布地奈德組大鼠腹腔注射治療劑量的布地奈德稀釋液（400μg/d），對(duì)照組用0.9%氯化鈉溶液連續(xù)10d超聲霧化激發(fā)30min。觀察4組大鼠臨床癥狀和體征。

1.2.2 大鼠肺泡灌洗液收集及肺組織病理檢查收集 4組大鼠最后一次激發(fā)后的肺泡灌洗液，將其于4℃環(huán)境下離心（1 500r/min）10min，收集離心后的上清液，于4℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。在用藥結(jié)束后，采用股動(dòng)脈放血法處死大鼠。取右肺中下葉和副葉，以4%甲醛溶液固定制成標(biāo)本，并作病理切片（HE染色），在顯微鏡下觀察。

1.2.3 大鼠肺泡灌洗液中的IL-4和IFN-γ含量檢測 （1）測定標(biāo)準(zhǔn)品IL-4和IFN-γ濃度梯度及肺泡灌洗液最佳稀釋倍數(shù)：按大鼠IL-4 ELISA Kit和大鼠IFN-γELISA Kit試劑盒說明書操作，分別測定最佳稀釋倍數(shù)，以抗IL-4陰性標(biāo)準(zhǔn)品和陽性標(biāo)準(zhǔn)品濃度/梯度（P/N）范圍的OD450比值所對(duì)應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。（2）間接ELISA法檢測OD450值：參考ELISA試劑盒說明書操作，建立檢測IL-4和IFN-γ的OD450值。（3）測定IL-4和IFN-γ酶標(biāo)二抗最佳工作濃度：酶標(biāo)二抗按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32作倍比稀釋，檢測已知IL-4陰性標(biāo)準(zhǔn)品和陽性標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)而確定酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度。IFN-γ的酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定方法同IL-4。（4）IL-4和IFN-γ陰陽臨界值的確定：另選擇5份同批次正常SD大鼠肺泡灌洗液進(jìn)行ELISA檢測。按照ELISA Kit試劑盒說明書設(shè)置IL-4和IFN-γ的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品。計(jì)算出本批次SD的大鼠OD450的均數(shù)（） 和標(biāo)準(zhǔn)差（s），按±3s公式計(jì)算陰陽臨界值。（5）特異度實(shí)驗(yàn)：本次試驗(yàn)建立IFN-γ間接ELISA方法的特異度驗(yàn)證，通過試劑盒中的IgE、IL-4標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品來鑒定；采用試劑盒中的IgE、IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)陽性品鑒定本次實(shí)驗(yàn)建立IL-4間接ELISA方法的特異度。（6）IL-4和IFN-γ檢測：采用以上各組檢測結(jié)果最終計(jì)算出4組樣本肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠肺組織病理檢查 見圖1。

圖1 4組大鼠肺組織HE染色病理切片（a：對(duì)照組大鼠肺泡大小正常，未見炎性細(xì)胞浸潤；b：哮喘模型組出現(xiàn)區(qū)域間質(zhì)水腫，存在數(shù)量多范圍廣的嗜酸性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤；c：IL-4R組觀察到肺泡變得大小不等，肺泡隔增寬，炎性細(xì)胞分布以血管周較多，其余區(qū)域較少；d：布地奈德組炎性細(xì)胞以血管周圍分布較多，其余區(qū)域較少，HE染色，×200）

由圖1可見，哮喘模型組大鼠肺組織有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，對(duì)照組大鼠肺組織幾乎無嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，IL-4R組和布地奈德組大鼠的肺組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤明顯少于哮喘模型組。

2.2 IL-4、IFN-γ抗體標(biāo)準(zhǔn)品梯度、肺灌洗液最佳稀釋倍數(shù)及酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定（OD450值） 見表1。

表1 IL-4、IFN-γ抗體標(biāo)準(zhǔn)品梯度、肺灌洗液最佳稀釋倍數(shù)及酶標(biāo)二抗最佳工作濃度測定結(jié)果（OD450值）

由表1可見，肺灌洗液稀釋倍數(shù)、抗IL-4抗體標(biāo)準(zhǔn)品和抗IFN-γ陽性標(biāo)準(zhǔn)品均作1∶8倍稀釋為最佳工作濃度。在陰、陽性對(duì)照差異最大時(shí)，IL-4的酶標(biāo)二抗的稀釋度即為最佳工作濃度，此時(shí)IL-4酶標(biāo)二抗1∶4的稀釋濃度為最佳工作濃度；而IFN-γ酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為1∶8的稀釋濃度為最佳工作濃度。

2.3 IL-4和IFN-γ陰陽臨界值確定（OD450值） 見表2。

表2 IL-4和IFN-γ陰陽臨界值確定（OD450值）

由表2可見，各組OD450值按x±3s公式計(jì)算出IL-4臨界值為0.236，IFN-γ陰陽臨界值為0.166。

2.4 特異度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用含有IgE、IL-4的標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品對(duì)IFN-γ進(jìn)行特異度驗(yàn)證，其結(jié)果全為陰性；采用含有IgE、IFN-γ的標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品對(duì)IL-4進(jìn)行特異度驗(yàn)證，其結(jié)果全為陰性。說明本次試驗(yàn)建立的ELISA方法具有較強(qiáng)的特異度。

2.5 4組大鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的ELISA檢測（OD450值） 見表3。

表3 4組大鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的ELISA檢測（OD450值）

由表3可見，哮喘模型組細(xì)胞因子IL-4高于對(duì)照組，IFN-γ低于對(duì)照組，IL-4R組、布地奈德組IL-4低于哮喘模型組，IFN-γ高于哮喘模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=37.594、33.89，均P＜0.05）。

3 討論

IFN-γ是一種Th1細(xì)胞分泌的活性糖蛋白，具有免疫調(diào)節(jié)作用，并能增強(qiáng)抗病毒能力。IFN-γ可以抑制IL-4的合成及IL-4誘導(dǎo)的免疫球蛋白轉(zhuǎn)換和Th2細(xì)胞的增殖，從而抑制IgE的產(chǎn)生[6-7]。Th細(xì)胞包括Th1和Th2，是過敏性哮喘關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞。Th2分泌IL-13和IL-4等細(xì)胞因子能促進(jìn)IgE的合成，引起哮喘的發(fā)生、發(fā)展，因而抑制IL-13和IL-4的分泌或作用可以治療哮喘[8]。在過敏性哮喘急性發(fā)作期Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，Th1細(xì)胞功能低下，使得IgE大量產(chǎn)生從而導(dǎo)致肥大細(xì)胞釋放嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子和血小板活化因子等，這些因子能引起支氣管平滑肌痙攣和黏膜水腫等使得支氣管腔狹窄、氣流受限，從而加重哮喘癥狀[9]。臨床檢測也表明，患者體內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞增加、IL-4水平升高、IFN-γ水平降低與兒童支氣管哮喘的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)系[10]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，在使用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、布地奈德及多種中藥方劑等藥物治療后，外周血中IFN-γ/IL-4的比值升高的患者過敏性哮喘癥狀明顯改善[11-14]。如在過敏性哮喘豚鼠實(shí)驗(yàn)中使用地氯雷他定顯著的改善了其肺組織的病理變化，明顯降低肺組織IL-4R mRNA表達(dá)水平從而抑制IL-4與IL-4R發(fā)揮正常作用，緩解哮喘癥狀[15]。國內(nèi)外的學(xué)者們認(rèn)為抑制IL-4與IL-4R結(jié)合使其不能發(fā)揮正常作用是緩解和治療哮喘的一種有效途徑[16-17]，因此IL-4與IL-4R的拮抗劑的開發(fā)研究成為目前的研究熱點(diǎn)之一[18]?？扇苄灾亟MIL-4R蛋白具有與IL-4結(jié)合的高度特異度和親和力，是IL-4R一種理想的拮抗劑。

本研究通過利用可溶性重組IL-4R蛋白作為IL-4R拮抗劑對(duì)大鼠過敏性哮喘模型進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，IL-4R組大鼠在癥狀體征及肺組織病理觀察上明顯較哮喘模型組輕，且體內(nèi)IL-4和IFN-γ含量與哮喘模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），研究結(jié)果表明重組IL-4R蛋白能降低過敏性哮喘動(dòng)物模型肺灌洗液中IL-4，提高IFN-γ的含量，IFN-γ/IL-4比值升高。檢測結(jié)果顯示IFN-γ/IL-4比值升高，提示重組IL-4R蛋白能夠抑制大鼠過敏性哮喘的形成，明顯干預(yù)其發(fā)展。

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Intervention of allergic asthma with recombinant IL-4R in rats

YANG Guangyong,GUO Haitao,LIU Ximing,et al.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002,China

Objective To investig ate the effectofrecomb inant IL-4R on allerg ic asthma in rats.Methods Sixty SD rats in 6 wk ofag e were rand omly d ivid ed into mod elg roup,IL-4R g roup,b ud esonid e g roup(as p ositive control)and controlg roup with 15 in each.Asthma mod elwas ind uced with sub cutaneous injection of ovalb umin(OVA).Rats in IL-4R g roup，b udesonide group and controlg roup were g iven intrap eritonealinjection of recomb inant IL-4R(400μg/d),b ud esonid e(400μg/d)or normalsaline, resp ectively.The p atholog ical chang es of lung tissues were ob served with HE staining,the contents of IL-4 and IFN-γ in alveolar lavag e fluid were d etected b y ind irect ELISA method. Results Larg e amount of eosinop hilinfiltration in the lung tissue was ob served in asthma mod elg roup,which were sig nificantly attenuated in IL-4R b ud esonid e g roup s.The contents of IL-4 and IFN-γin alveolar lavag efluid of IL-4R and b ud esonid e g roup s were sig nificantly lower than those of asthma mod elg roup(P＜0.05). Conclusion The results sug g estthatrecomb inant IL-4R can effectively intervene allerg ic asthma in rats.

IL-4R IFN-γ ELISA Allerg ic asthma

2015-11-13）

（本文編輯：楊麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.17.2015-1352

2011年貴州省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目［黔科合SY字（2011）3020］、貴州省委組織部高層次人才科研條件特助經(jīng)費(fèi)（TZJF-2011年28號(hào)）

550025貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

何光志，E-mail：heguangzhi7711@sina.com