吳 悅 吳人照 龍華晴 馬津真 聶曉靜 陳 宇 戴關(guān)海 陳 璇 童曄玲 任澤明

1 浙江中醫(yī)藥大學 浙江 杭州 310053 2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

實驗研究

養(yǎng)胃舒與葉酸片治療亞硝基胍誘發(fā)慢性萎縮性胃炎模型大鼠的萎縮逆轉(zhuǎn)作用觀察*

吳 悅1吳人照2#龍華晴1馬津真1聶曉靜1陳 宇2戴關(guān)海2陳 璇2童曄玲2任澤明2

1 浙江中醫(yī)藥大學 浙江 杭州 310053 2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

目的：探討?zhàn)B胃舒、葉酸片治療亞硝基胍（MNNG）誘發(fā)慢性萎縮性胃炎（CAG）模型大鼠的體重恢復(fù)及胃黏膜萎縮逆轉(zhuǎn)作用。方法：Wistar大鼠自由飲用167μg/ml蒸餾水濃度的飲用液，實驗造模12周。確定成模后，將大鼠分為模型組、養(yǎng)胃舒組、葉酸片組，另設(shè)同齡正常對照組。并分別給予藥物干預(yù)后，觀察大鼠體重、胃組織病理組織學情況。結(jié)果：①體重：治療第8周,養(yǎng)胃舒組體重丟失恢復(fù)顯著高于模型組（P＜0.05）,葉酸片組體重丟失有恢復(fù)趨勢，但無顯著性（P＞0.05）。②病理：養(yǎng)胃舒組腸化顯著減輕（P＜0.05），葉酸片組胃黏膜炎癥等級、腺體萎縮、不典型增生均顯著減輕（P＜0.05，P＜0.01）。模型組雄1發(fā)生腫瘤，各治療組未見腫瘤。結(jié)論：養(yǎng)胃舒對CAG模型大鼠在減輕體重丟失，減輕腸化方面有較好治療作用；葉酸片對CAG模型大鼠在胃黏膜炎癥等級、腺體萎縮、不典型增生方面有較好的治療作用。

慢性萎縮性胃炎 養(yǎng)胃舒 葉酸 病理 大鼠

阻斷乃至逆轉(zhuǎn)胃黏膜萎縮和腸化生的發(fā)展進程，對慢性萎縮性胃炎（CAG）治療至關(guān)重要。中西藥聯(lián)合治療CAG有著一定的優(yōu)勢，養(yǎng)胃舒與葉酸片均為臨床可選藥物，但未見系統(tǒng)的比較研究文獻。本研究采用亞硝基胍（MNNG）誘發(fā)大鼠CAG模型，客觀評價養(yǎng)胃舒與葉酸片對CAG的治療效果，觀察各組大鼠體重丟失恢復(fù)情況和病理改變情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：正常Wistar大鼠70只，雌雄各半，體重160～190g，動物合格證編號：0228546。均購買于上海斯萊克實驗動物有限公司，其實驗動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK(滬)2013-0016。實驗動物均飼養(yǎng)于本院25±2℃的屏障實驗室內(nèi)，每12小時光照明暗交替，實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)20090122。

1.2 實驗藥物：①養(yǎng)胃舒顆粒：顆粒劑，每袋10g，內(nèi)含黨參、陳皮、黃精、山藥、玄參、烏梅、山楂、北沙參、干姜、菟絲子、白術(shù)（炒）等。由合肥神鹿雙鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，臨床人體用藥量20g/日。批號：1506215，有效期3年。②葉酸片：依據(jù)《中國慢性胃炎共識意見》，葉酸可以改善CAG，預(yù)防胃癌［1］，本實驗采用了CAG以及胃癌前病變相對比較公認有一定療效的西藥葉酸片，每片5mg。批號：1603007，有效期3年。

1.3 實驗儀器：RM2235 LEICA病理切片機、EG1150C LEICA生物組織冷凍機、EG1150H LEICA生物組織包埋機、ASP200 LEICA生物組織自動脫水機：德國萊卡公司；BX41OLYMPUS顯微鏡：日本OLYMPUS（オリンパス）株式會社；Nikon ECLIPSE Ti顯微攝像系統(tǒng)：日本Nikon株式會社。

1.4 實驗試劑：MNNG：5g/瓶，上海藍季生物公司購買，由日本東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn)，批號：75F71-TF；甲醛溶液：500ml/瓶，上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20130610。

1.5 MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠造模方法：6周齡的Wistar大鼠：70只，雌雄各半，50只開始造模：在飲水中加入MNNG。每周1次用蒸餾水配成1g/L濃度的儲存液，避光冷藏保存。同時配成167μg/ml蒸餾水濃度的飲用液，將其裝入外用黑色塑料袋包裹著的水瓶，讓大鼠自由飲用。本次實驗造模12周。

1.6 MNNG誘發(fā)CAG模型大鼠的治療：造模完成時，隨機選取4只模型動物與4只正常動物胃組織做病理組織學檢查，確定成模后，按照實驗的分組要求（每組12只，雌雄各半）分組并開始給藥。模型組給生理鹽水，養(yǎng)胃舒顆粒給養(yǎng)胃舒顆粒4.0g/kg/日灌胃，葉酸組給葉酸片5.0mg/kg/日灌胃，此外，取12只相同條件的大鼠作為空白（未造模）對照組。在給藥第8周完成時，4組大鼠均麻醉，迅速將胃摘出，福爾馬林固定，石蠟包埋，做4μm切片，用HE、AB染色，進行組織學檢查。

1.7 病理組織學檢查方法：標本：大鼠均麻醉，迅速將胃摘出，標本為全胃，上段留0.5cm食管，下段留1.5cm十二指腸；沿胃大彎剪開，生理鹽水沖洗，浸于10%中性福爾馬林中。取材范圍：從前胃一直到十二指腸縱向全長、全層。包埋切片：石蠟包埋，作4μm切片。染色：HE染色、AB染色。光鏡觀察：①胃黏膜炎癥情況：采用半定量法。后在胃組織的胃竇部取10個視野，具體參照在1994年美國休斯頓所提出的胃炎診斷標準。②胃黏膜腺體厚度：每張胃組織切片中，選取胃竇部黏膜5個視野，測出在每個視野下胃竇黏膜腺體厚度，得出每張切片5個視野平均值(μm)。③胃腺體數(shù)目：選取100倍鏡下，找到每只大鼠胃組織的幽門環(huán)0.2～1.2mm（200～1200μm）之間（即1mm范圍）胃竇固有的腺體總個數(shù)，單位通常以“個/mm”來表示。④不典型增生：在每張切片中，取5個高倍鏡視野，觀察胃黏膜上皮細胞，明確有無細胞核多形性和腺體不典型增生的變化（采用輕、中、重級別報告）。⑤主細胞、壁細胞數(shù)目：選取400倍鏡下，取5個視野平均值。⑥腸上皮化生表現(xiàn)：參照《中藥新藥治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究指導(dǎo)原則》及2006中國上海慢性胃炎共識意見。

1.8 統(tǒng)計學方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組均數(shù)比較采用F檢驗，其中兩組比較計量資料采用LSD-t和Dunnett T3檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異顯著。

2 實驗結(jié)果

2.1 體重：治療前模型大鼠體重較正常大鼠顯著下降（P＜0.01）。造模完成后，在治療前各治療組間體重情況無顯著差異（P＞0.05），具有可比性。各治療組治療后體重較模型組體重丟失有一定程度恢復(fù)。治療第8周時養(yǎng)胃舒組大鼠體重丟失較模型組有顯著恢復(fù)（P＜0.05），葉酸片組大鼠體重丟失較模型組有恢復(fù)趨勢，但無顯著性（P＞0.05）。養(yǎng)胃舒與葉酸片體重丟失恢復(fù)比較無顯著性（P＞0.05）。見表1、圖1。

2.2 病理：養(yǎng)胃舒組腸化（“++”“+++”只數(shù)）5/11（45.45%）（治療8周后養(yǎng)胃舒組存活11只），與模型組腸化（“++”“+++”只數(shù)）10/12（83.33%）比較，有顯著差異（P＜0.05）。養(yǎng)胃舒組炎癥、腺體數(shù)量、腺體厚度、主細胞、壁細胞、輕度不典型增生與模型組比較，有改善但無顯著性（P＞0.05）。葉酸片組炎癥、腺體數(shù)量、腺體厚度、輕度不典型增生與模型組比較，有顯著差異（P＜0.01，P＜0.05）,腸化方面有改善，但無顯著性（P＞0.05）。模型組還有1只動物（雄1號）發(fā)生腫瘤，為十二指腸漿膜面胃腺癌，其他各治療組未發(fā)生腫瘤。在炎癥方面，葉酸片比養(yǎng)胃舒顯著改善（P＜0.05）。詳見表2、表3。

結(jié)合表1的體重丟失恢復(fù)療效，以及模型組還有1只動物發(fā)生腫瘤，進行綜合分析，養(yǎng)胃舒對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠體重丟失、腸化有顯著改善作用。在一定程度上有改善炎癥等級、胃黏膜萎縮、不典型增生的療效。葉酸片對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠體重丟失有恢復(fù)趨勢，能顯著改善胃黏膜炎癥等級、萎縮、不典型增生的病變情況。在炎癥（等級）方面，葉酸片比養(yǎng)胃舒顯著改善。養(yǎng)胃舒與葉酸片治療CAG的療效表現(xiàn)在不同方面，但對CAG的治療都有較好效果。

表1 養(yǎng)胃舒與葉酸片對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周體重影響（±s,g/只）

表1 養(yǎng)胃舒與葉酸片對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周體重影響（±s,g/只）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

分組養(yǎng)胃舒組(n=12、11)葉酸片組(n=12)正常組(n=12)模型組(n=12)治療第8周226.18±37.24*206.17±28.46 292.83±61.88**171.08±32.23治療前170.33±33.17 168.75±29.74 259.42±51.93**167.77±38.23

圖1 養(yǎng)胃舒、葉酸片對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周大鼠體重（g/只）

表2 養(yǎng)胃舒與葉酸片對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周胃組織不典型增生、腸化觀察（只）

表3 養(yǎng)胃舒與葉酸片對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周胃組織萎縮病理觀察（±s）

表3 養(yǎng)胃舒與葉酸片對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周胃組織萎縮病理觀察（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與葉酸組比較，#P＜0.05。

組別養(yǎng)胃舒組葉酸片組正常組模型組壁細胞(個/視野) 178.02± 44.76 156.07± 52.27 285.00±113.21**184.42±102.81例數(shù)11 12 12 12炎癥 (等級) 0.77±0.28#0.50±0.28**0.23±0.20**0.88±0.38腺體數(shù)量(個/mm) 38.55±5.45 39.83±6.95*45.83±7.16**33.67±4.58腺體厚度(um) 240.41±37.7 262.53±64.42*254.91±38.97*212.02±41.83主細胞(個/視野) 200.23±139.8 185.23±117.76 319.42±121.35*205.75±118.12

3 討論

CAG是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，且已明確為癌前疾病。中醫(yī)學將其歸屬為“胃脘痛”“嘈雜”“胃痞”等范疇。CAG的病因，現(xiàn)代醫(yī)學認識尚不十分明確。目前多認為CAG的發(fā)生是多病因綜合作用、漫長、多階段、多基因變異的積累過程，主要有Hp感染、胃黏膜微循環(huán)改變、黏膜營養(yǎng)因子缺乏、膽汁反流、精神壓力、心理異常等。其主要病機是中焦?jié)駸?，瘀血?nèi)阻。治宜益氣活血、溫養(yǎng)脾胃為主。

養(yǎng)胃舒顆粒內(nèi)含黨參、陳皮、黃精、山藥、玄參、烏梅、山楂、北沙參、干姜、菟絲子、白術(shù)（炒）等。黨參有益氣健脾之功，陳皮有理氣開胃、燥濕化痰之功，北沙參、玄參有養(yǎng)陰清肺、益胃生津之功，黃精、山藥、白術(shù)（炒）有補氣健脾、滋腎潤肺之功，菟絲子有滋補肝腎之功，烏梅、山楂、砂仁有消食健胃、溫補脾陽、活血行氣、收斂止痢之功，干姜有溫中散寒、燥濕消痰、溫肺化飲之功?，F(xiàn)代藥理研究已經(jīng)證實，黨參有提高機體免疫力，通過擴張末梢血管達到改善胃黏膜微循環(huán)的作用，還有利于促進蛋白質(zhì)合成，有促使胃黏膜細胞、腺體細胞修復(fù)和再生的功能［2］；白術(shù)不僅具有提高機體免疫力、對抗腫瘤細胞毒性的作用，還具有雙向調(diào)整胃腸運動，抗胃黏膜損傷，改善局部病變的綜合作用［3］。北沙參的提取物能夠抑制脂質(zhì)的過氧化作用，也可以抑制促癌物質(zhì)滲入磷脂中，有抑制腫瘤生成的作用［4］。以上藥物綜合運用，具有提高機體免疫、改善消化功能、調(diào)節(jié)胃腸道動力、抗胃黏膜損傷等作用。已有研究證實養(yǎng)胃舒可以有效改善胃黏膜損傷，促進胃黏膜修復(fù)和再生［5］。

葉酸片對細胞維持正常功能和增殖至關(guān)重要。近年來，越來越多的研究表明葉酸具有抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤細胞中癌基因的表達［6］。有研究者發(fā)現(xiàn)胃腺癌患者的手術(shù)標本中，組織葉酸水平明顯降低。當葉酸在一定濃度范圍時，對胃癌細胞表現(xiàn)出良好的抑制作用［7］。在消化系統(tǒng)疾病中，葉酸代謝紊亂的狀況同樣存在，高緯等［8］觀察葉酸片干預(yù)CAG患者后結(jié)果顯示，葉酸片的供甲基作用在一定程度上對于CAG的惡變有預(yù)防作用。

關(guān)于養(yǎng)胃舒顆粒與葉酸治療萎縮性胃炎進行作用特點比較的實驗研究，未見文獻報告?；诖?，本實驗選用單用養(yǎng)胃舒、葉酸片分別治療CAG，觀察CAG大鼠體重丟失恢復(fù)及胃組織病理情況。研究結(jié)果顯示：從本實驗研究結(jié)果看，養(yǎng)胃舒組對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周具有顯著減輕體重丟失，顯著改善腸化的作用，對胃黏膜炎癥（等級）、萎縮情況有一定程度改善作用。葉酸片對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周具有顯著改善胃黏膜炎癥（等級）、萎縮、不典型增生作用，在一定程度上有減輕體重丟失趨勢和改善腸化作用?？偠灾?，養(yǎng)胃舒、葉酸片治療CAG的療效表現(xiàn)在不同方面，但對CAG的治療都有一定效果。

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2017-05-18

國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制項目鐵皮楓斗顆粒治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究，編號：2016ZX09101069；浙江省自然科學基金項目鐵皮楓斗顆粒有效成分治療慢性萎縮性胃炎的分子機理實驗研究，編號：LY15H280011；浙江省重大科技專項項目鐵皮楓斗顆粒治療慢性萎縮性胃炎的研究——擴大適應(yīng)癥研究，編號：2009C13032

# 通訊作者：吳人照，E-mail：wufeng03@126.com