魏 升 王建康 蔡旭東 鐘光輝

浙江省寧波市中醫(yī)院 浙江 寧波 315010

泄化濁瘀方總皂苷對(duì)痛風(fēng)及高尿酸血癥HK-2細(xì)胞有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的影響*

魏 升 王建康 蔡旭東 鐘光輝#

浙江省寧波市中醫(yī)院 浙江 寧波 315010

泄化濁瘀方 總皂苷 痛風(fēng) 高尿酸血癥 HK-2細(xì)胞 有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 基因表達(dá)

泄化濁瘀方臨床主要用于痛風(fēng)及高尿酸血癥（痰瘀痹阻證）的治療，臨床療效確切。前期實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明[1]，其具有抑制黃嘌呤氧化酶的活性，抑制尿酸生成，促進(jìn)尿酸排泄，降低血尿酸水平的作用，能明顯改善痛風(fēng)及高尿酸血癥的臨床癥狀。本研究以有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OATs）尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為切入點(diǎn)，探討泄化濁瘀方治療高尿酸血癥（痰瘀痹阻證）的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品：泄化濁瘀方（土茯苓30g，萆薢、薏苡仁各15g，牛膝、澤蘭、澤瀉、當(dāng)歸、桃仁、紅花各10g），組方由寧波市中醫(yī)院提供，藥物購(gòu)于浙江省立同德醫(yī)院中藥房。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室提取、分離、純化，得泄化濁瘀方總皂苷，含量為62.24%。

1.2 主要試劑：苯溴馬隆片（德國(guó)赫曼大藥廠(chǎng)，批號(hào)：1600695）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，批號(hào)：00350176）；OAT1、OAT2、OAT3引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］；熒光定量 PCR試劑盒（Promega，批號(hào)：0000163908）。

1.3 主要儀器：xCELLigence RTCA DP多功能實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀［艾森生物（杭州）有限公司］；E-Plate 16檢測(cè)板［艾森生物（杭州）有限公司，批號(hào)：20160310］；7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司)；TC-20細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Bio-Rad公司）。

1.4 xCELLigence RTCA DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)泄化濁瘀方總皂苷對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）細(xì)胞增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml，先在E-Plate板上每孔放入50μl培養(yǎng)基測(cè)基線(xiàn)，隨后加入100μl細(xì)胞懸液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，xCELLigence RTCA DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)記錄細(xì)胞指數(shù)（CI）。精密稱(chēng)取樣品泄化濁瘀方總皂苷，先用二甲基亞砜（DMSO）溶解，再用培養(yǎng)液稀釋?zhuān)来蜗♂尩?00、250、125、62.5、31.25、15.63μg/ml，DMSO終濃度≤1‰。設(shè)上述6個(gè)濃度皂苷組、正常對(duì)照組和1‰DMSO對(duì)照組，24h后加入上述不同濃度泄化濁瘀方總皂苷，每組3復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)96h，記錄CI。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)48h HK-2細(xì)胞OAT1、OAT2、OAT3 mRNA表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，接種于6孔板中，3復(fù)孔，每孔2.5ml，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加藥，分成5組，即DMSO對(duì)照組（含1‰DMSO）、泄化濁瘀方總皂苷高劑量組（100μg/ml）、總皂苷中劑量組（50μg/ml）、總皂苷低劑量組（25μg/ ml）、苯溴馬隆組（100μg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)48h，細(xì)胞用于提取RNA。用Trizol法提取總RNA，并測(cè)定總RNA的含量。逆轉(zhuǎn)錄采用10μl體系，加總RNA 0.5μg，隨機(jī)引物0.2μl，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量分析方法（2-ΔΔCt法）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 xCELLigence RTCA DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)泄化濁瘀方總皂苷對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響：xCELLigence RTCA DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)連續(xù)記錄120h的CI值，正常對(duì)照組和1‰DMSO對(duì)照組的細(xì)胞增殖曲線(xiàn)相似，表明1‰濃度的DMSO對(duì)HK-2細(xì)胞無(wú)毒性；泄化濁瘀方總皂苷500、250、125、62.5、31.25、15.63μg/ml 6個(gè)劑量組的細(xì)胞增殖曲線(xiàn)呈劑量相關(guān)。其中給藥后24h、48h、72h的CI值見(jiàn)表1，正常對(duì)照組和1‰DMSO對(duì)照組的24h、48h、72hCI值均無(wú)差異，表明1‰濃度的DMSO對(duì)HK-2細(xì)胞無(wú)毒性。總皂苷500和250μg/ml組的24h CI值均顯著低于正常對(duì)照組和1‰DMSO對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）；總皂苷500、250、125、62.5、31.25μg/ml組的48h CI值與正常對(duì)照組和1‰DMSO對(duì)照組相比明顯降低（P＜0.01），并呈劑量相關(guān)；總皂苷500、250、125、62.5、31.25、15.63μg/ml組的72h CI值均顯著低于正常對(duì)照組和1‰ DMSO對(duì)照組（P＜0.01）。72h IC50為16.9μg/ml。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)48h HK-2細(xì)胞OAT1、OAT2、OAT3 mRNA表達(dá)：由表2可見(jiàn)，與1‰DMSO對(duì)照組相比，泄化濁瘀方總皂苷100、50、25μg/ml對(duì)OAT1和OAT3基因表達(dá)有明顯的上調(diào)作用，對(duì)OAT2基因表達(dá)有明顯的下調(diào)作用（P＜0.01）。

表1 泄化濁瘀方總皂苷對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 泄化濁瘀方總皂苷對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與1‰DMSO對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對(duì)照組1‰ DMSO對(duì)照組總皂苷500μg/ml組總皂苷250μg/ml組總皂苷125μg/ml組總皂苷62.5μg/ml組總皂苷31.25μg/ml組總皂苷15.63μg/ml組例數(shù)3 3 3 3 3 3 3 3 24h CI 1.619±0.299 1.651±0.094 0.556±0.055**##1.107±0.159*#1.849±0.135 1.592±0.374 1.737±0.418 1.665±0.347 48h CI 2.570±0.160 2.665±0.143 0.303±0.049**##0.417±0.091**##0.549±0.049**##1.075±0.205**##1.342±0.148**##2.628±0.458 72h CI 3.875±0.420 4.023±0.263 0.059±0.014**##0.068±0.022**##0.056±0.017**##0.264±0.072**##1.115±0.108**##2.617±0.369**##

表2 泄化濁瘀方總皂苷對(duì)HK-2細(xì)胞OATS基因相對(duì)表達(dá)水平的影響（±s）

表2 泄化濁瘀方總皂苷對(duì)HK-2細(xì)胞OATS基因相對(duì)表達(dá)水平的影響（±s）

注：與1‰DMSO對(duì)照組比較，**P＜0.01。

組別1‰DMSO對(duì)照組總皂苷高劑量組總皂苷中劑量組總皂苷低劑量組苯溴馬隆組OAT3 1.000 23.358±0.408**14.271±0.151**10.880±0.396**21.539±0.227**OAT1 1.000 2.533±0.071**3.259±0.057**7.585±0.213**5.570±0.135**OAT2 1.000 0.743±0.047**0.555±0.020**0.396±0.013**2.648±0.037**

3 討論

筆者認(rèn)為痛風(fēng)的病因病機(jī)乃濁毒瘀滯使然，主張痛風(fēng)病診斷一經(jīng)明確，治療便應(yīng)恪守泄化濁瘀方這一大法。臨床常以泄化濁瘀方為基礎(chǔ)方，取降泄?jié)岫九c化瘀活血藥物進(jìn)行配伍，如此可促進(jìn)濁毒之泄化，解除瘀結(jié)之機(jī)轉(zhuǎn)，推陳致新，增強(qiáng)療效。本研究立足于總皂苷的研究，土茯苓[2]除了含有黃酮類(lèi)成分外，皂苷是其主要成分之一。另外方中的萆薢[3]，也有報(bào)道[2]其含體皂苷，包括螺甾烷皂苷、孕甾烷昔、甾體苷元等。研究發(fā)現(xiàn)，泄化濁瘀方總皂苷100、50、25μg/ml對(duì)OAT1和OAT3基因表達(dá)有明顯的上調(diào)作用，對(duì)OAT2基因表達(dá)有明顯的下調(diào)作用（P＜0.01）。OATs功能主要是轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)內(nèi)源性及外源性有機(jī)陰離子，尿酸是主要在腎小管通過(guò)OAT1和OAT3轉(zhuǎn)運(yùn)的一種內(nèi)緣性有機(jī)陰離子。OAT1和OAT3的腎臟中表達(dá)的下調(diào)，可以產(chǎn)生腎臟炎癥，從而減少腎臟的分泌和增加有機(jī)陰離子的積累。近年研究發(fā)現(xiàn)腎臟尿酸排泄減少與尿酸有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)，OATs表達(dá)及功能缺陷可能為原發(fā)性高尿酸血癥重要的發(fā)病機(jī)制之一[4]。

藥物及其體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，通過(guò)與OAT1和OAT3相互作用產(chǎn)生毒性，其中大部分藥物是因?yàn)樽鳛镺AT1和OAT3的內(nèi)、外源性底物，且相互之間存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，導(dǎo)致能夠產(chǎn)生毒性的物質(zhì)蓄積于體內(nèi)，從而對(duì)機(jī)體造成損害。研究發(fā)現(xiàn)，較長(zhǎng)時(shí)間（48h、72h）中高濃度總皂苷組CI值均顯著低于正常對(duì)照組和1‰DMSO對(duì)照組（P＜0.01），對(duì)HK-2細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性。兩者是否存在一定關(guān)聯(lián)，有待進(jìn)一步證實(shí)。此外，研究發(fā)現(xiàn)泄化濁瘀方總皂苷可下調(diào)OAT2表達(dá)，影響OAT2活性是否能引起相應(yīng)底物的藥效學(xué)與藥動(dòng)學(xué)變化尚需要進(jìn)一步研究。OAT2轉(zhuǎn)運(yùn)不同藥物能力差別較大，臨床上可觀(guān)察到很多藥物影響OAT2的表達(dá)與活性，但其通過(guò)何種信號(hào)通路調(diào)控研究較少，仍需進(jìn)一步深入探索。

[1]魏升，伍云洲，蔡旭東，等.中西醫(yī)結(jié)合治療痛風(fēng)性腎病45例療效觀(guān)察[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2016，23（6）：718-720.

[2]徐婷婷，承志凱，尹蓮，等.土茯苓抑制黃嘌呤氧化酶活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究[J].中藥材，2012，35（4）：582-585.

[3]蘇筠霞.中藥“萆薢提取物”對(duì)尿酸性腎病保護(hù)作用的研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[4]Otani N，Ouchi M，Hayashi K，et al.Roles of organic anion transporters(OATs)in renal proximal tubules and their localization[J].Anat Sci Int，2016，92 (2)：200-206.

2017-03-10

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目泄化濁瘀方總皂苷對(duì)黃嘌呤氧化酶活性和OATs基因表達(dá)的影響，編號(hào)：2015ZB103

# 通訊作者：鐘光輝，E-mail：zgh20040712@126.com