鐘遠平，張 超，王 義，任娟娟，朱昭瓊

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 麻醉科;2.遵義醫(yī)學院 貴州省麻醉與器官保護基礎(chǔ)研究重點實驗室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學研究

新生期多次吸入七氟烷后大鼠腦脊液/海馬Tau蛋白的變化

鐘遠平1,2，張 超2，王 義2，任娟娟2，朱昭瓊1,2

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 麻醉科;2.遵義醫(yī)學院 貴州省麻醉與器官保護基礎(chǔ)研究重點實驗室，貴州 遵義 563099)

目的探究新生期大鼠間斷重復吸入七氟烷后，新生期、成年期腦脊液(CSF)、海馬Tau蛋白的變化。方法健康新生SD大鼠48只，雌雄不拘，隨機分為實驗組(Sev組，n=24)、對照組(Con組，n=24)，Sev組大鼠于出生7、14、21 d(記錄為P7、P14、P21)分別予2.6%七氟烷吸入麻醉2 h。運載氣體是比例為1∶1的混合氣體(1L/min Air+1L/min O2)，Con組在同時間點分別吸入運載氣體2 h，兩組大鼠各隨機取半數(shù)于新生期(P21)、成年期(P97)進行CSF及海馬組織取材，分別采用ELISA及免疫組化檢測CSF及海馬Tau蛋白。結(jié)果新生期：大鼠CSF Tau蛋白含量兩組差異不明顯(P>0.05)，Sev組海馬Tau蛋白平均光密度均高于Con組(P<0.05)；成年期：CSF Tau蛋白含量Sev組較Con組低(P<0.05)，海馬Tau蛋白平均光密度兩組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論大鼠新生期多次吸入七氟烷后新生期Sev組海馬Tau蛋白平均光密度升高、成年期Sev組CSF Tau蛋白含量降低，CSF和海馬中Tau蛋白含量在不同時期變化不同步，尚不能依據(jù)CSF 中Tau蛋白的變化作為反應海馬Tau蛋白變化的參考指標。

七氟烷；腦脊液；海馬；Tau蛋白

小兒全麻手術(shù)量逐年增多，七氟烷是最常使用的小兒全麻藥，但近年來有報道七氟烷可引起腦、CSF生物標記物的改變，從而影響學習、記憶功能[1],本研究通過研究新生期大鼠間斷重復吸入七氟烷后，新生期和成年期CSF、海馬Tau蛋白的變化，從而探討能否用CSF替代海馬行生物標記物檢測，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 SD孕鼠6只，由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供(許可證號：SCXK渝2012-0005)。孕鼠在SFP級動物房飼養(yǎng)產(chǎn)仔，獲得健康新生SD大鼠48只。七氟烷，山東魯南貝特制藥有限公司；Tau ELISA試劑盒，美國MyBioSource公司(批號：201401103)；免疫組化檢測試劑盒，基因科技(上海)有限公司(批號：2014100901)； Drager Julian麻醉機、氣體監(jiān)測儀，上海德爾格醫(yī)療設備有限公司；自制吸入麻醉箱。

1.2 動物分組及處理 健康新生SD大鼠48只，雌雄不拘，采用隨機數(shù)字表法分為兩組，即實驗組(Sev組，n=24)與對照組(Con組，n=24)，每組按大鼠年齡分為新生期(0～21d，n=12)、成年期(60～90 d，n=12)。Sev組大鼠于出生7、14、21 d(記錄為P7、P14、P21)分別給予2.6%七氟烷吸入麻醉2 h，運載氣體是比例為1∶1的空氧混合氣體(1 L/min Air+1L/min O2)；Con組在同時間點分別吸入運載氣體2 h。兩組大鼠各隨機取半數(shù)于新生期(P21)、成年期(P97)進行CSF及海馬組織取材。

1.3 Tau蛋白檢測 ①兩組大鼠于P21即第3次吸入七氟烷蘇醒2 h后分別隨機取12只予1%戊巴比妥鈉0.1 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后立即行CSF取材，將取材成功的CSF按試劑盒說明書要求標記后置于-80 ℃冰箱中冷凍保存，備用。采用ELISA試劑盒說明書要求測OD值，并計算出CSF Tau蛋白的濃度。②CSF取材完畢后立即斷頭取腦，冠狀平面切面暴露海馬組織輪廓，取海馬4%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋切片，通過免疫組化SABC法觀察海馬切片Tau蛋白平均光密度。③其余大鼠自然飼養(yǎng)至P97，按照前述方法行相同取材及處理。

2 結(jié)果

2.1 模型建立 吸入七氟烷麻醉過程中大鼠呼吸平穩(wěn)，皮膚色澤紅潤，無麻醉致死，蘇醒良好。實驗過程中無大鼠死亡。各生長周期兩組大鼠發(fā)育良好，體重隨時間增加而增加，組間比較無統(tǒng)計學意義(見表1)。

表1兩組大鼠各生長期體重情況(g,n=24)

組別新生期成年期Sev47.0±9.0234.2±55.9Con42.2±6.5235.8±24.4

組間比較，差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 各生長期CSF中Tau蛋白濃度變化(見表2)。

表2各生長期CSF中Tau蛋白的濃度比較(ng/mL，n=24)

組別新生期成年期Sev18.3±7.628.9±6.1aCon21.4±13.242.6±12.5

成年期Sev組較Con組降低，aP<0.015。

2.3 各生長期海馬Tau蛋白的變化 (1)海馬組織染色后，可見海馬內(nèi)細胞排列緊密，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細胞核圓形或橢圓形，呈藍色，Tau蛋白的表達呈現(xiàn)棕黃色，染色較深，廣泛分布于胞漿及樹突。(2)Tau蛋白平均光密度的比較(見表3)：①新生期：Sev組于Con組比較，在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)，Sev組Tau蛋白平均光密度均高于Con組，差異有明顯顯著性(P>0.01)；②成年期：Sev組與Con組比較，在海馬各區(qū)Tau蛋白平均光密度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3各生長期兩組大鼠海馬Tau蛋白平均光密度比較

部位新生期(n=12)Sev組Con組成年期(n=12)Sev組Con組CA10.233±0.032a0.189±0.0210.222±0.0260.211±0.025CA20.259±0.023b0.237±0.0230.276±0.0320.312±0.053DG0.221±0.034a0.180±0.0130.179±0.0260.186±0.020

新生期Sev組較Con組升高，aP<0.05bP<0.01。

3 討論

手術(shù)必須實施麻醉，七氟烷因其并發(fā)癥比較少、蘇醒快、患者容易接受，在小兒麻醉手術(shù)中是一種比較理想的麻醉藥物[2]。然而近年來有研究發(fā)現(xiàn)，在腦發(fā)育的關(guān)鍵時期，吸入麻醉藥物可能引起急性腦損傷，造成未成熟神經(jīng)細胞發(fā)育異常、成熟神經(jīng)細胞凋亡增加，最終可能引起學習記憶的認知水平下降[3]，嬰幼兒期接受多次手術(shù)麻醉者的學習記憶能力較同齡兒童差[4]，同時，研究發(fā)現(xiàn)七氟烷具有神經(jīng)毒性[5]，能引起發(fā)育未成熟大腦的腦細胞凋亡[6]，導致認知功能的改變。

Tau蛋白作為目前檢測動物認知功能較有效的生物學標志物，是一種相對分子質(zhì)量較小的微管蛋白，在調(diào)節(jié)細胞骨架的結(jié)構(gòu)和完整性方面起重要作用，多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變都出現(xiàn)了與Tau蛋白相關(guān)的特征性病理改變，有研究認為吸人全麻藥可以引起較高的POCD發(fā)生率[7-8]，這或與其可通過激活老齡大鼠海馬組織的PKA、GSA-3β激酶，使Tau蛋白Ser396，Ser262位點產(chǎn)生一定程度磷酸化相關(guān)[9]，Tau蛋白發(fā)生高度磷酸化后將失去對微管的穩(wěn)定作用，使神經(jīng)纖維退化及功能喪失，影響神經(jīng)細胞的學習記憶功能[10]。本實驗中大鼠新生期間斷吸入七氟烷后新生期海馬組織Tau蛋白平均光密度Sev組各區(qū)均高于Con組，而成年期各區(qū)Tau蛋白平均光密度比較無明顯差異，推測為多次七氟烷麻醉后或許存在神經(jīng)元損傷及自我修復，并可能對遠期存在持續(xù)性潛在影響。

臨床工作中，腦脊液(CSF) 因其取材相對簡單，常用于各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的實驗室檢查，而CSF蛋白的檢查對某些CNS的診斷及病情的評估有一定價值。腦脊液中Tau蛋白水平可能是被視為軸突損傷和神經(jīng)元變性、壞死程度的一個指標，并在認知功能障礙出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前出現(xiàn)改變[11]。本實驗結(jié)果顯示新生期間斷吸入七氟烷后大鼠新生期CSF中Tau蛋白含量與對照組相比無明顯改變，而成年期表現(xiàn)為對照組含量明顯升高(P<0.05)，考慮為腦組織中Tau蛋白異常磷酸化并沉積，故而導致CSF中Tau蛋白含量相對降低，因本實驗未檢測CSF P-Tau蛋白的含量，故具體原因有待進一步研究。

綜上所述，大鼠在新生期間斷多次吸入七氟烷后海馬區(qū)Tau蛋白的變化提示可能有神經(jīng)元損害的存在，從而影響學習記憶能力。CSF Tau蛋白含量與海馬中Tau蛋白含量在各個時期變化無明顯相關(guān)性，提示尚不能依據(jù)CSF代替腦組織判斷其生物學標志物改變情況，CSF生物學標志物檢測僅能反應病理學改變，確切診斷仍需要依靠腦組織病理學檢查。

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(編輯：譚秀榮)

Changes of Tau protein levels in rats CSF and hippocampus after multiple inhalation of sevoflurane at neonatal stage

Zhong Yuanping1，2,Zhang Chao2,Wang Yi2,Ren Juanjuan2,Zhu Zhaoqiong1,2

(1.Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;2.Guizhou Key Laboratory of Fundamental Research on Anesthesiology and Organ Protection, Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo investigate the changes of Tau protein levels in CSF and hippocampus of neonatal and adult rats after intermittent repeated inhalation of sevoflurane at neonatal stage.Methods48 healthy newborn SD rats with either sex,were randomly divided into experimental group (group Sev,n=24) and control group (group Con,n=24).The rats in the Sev group were

2.6% sevoflurane inhalation anesthesia for 2 h in the 7th(P7),14th(P14),and 21thday (P21),respectively.The carrier gas consisted of oxygen and air (1 L/min Air + 1 L/Min O2).The Con group was inhaled the carrier gas on the same way as the Sev group.Half of rats in the two groups were randomly selected in the neonatal (P21) and adult (P97) period to collect CSF and hippocampus.ELISA and immunohistochemistry were used to test the level of Tau protein.ResultsCompared to the Con group,there was no statistically significant change (P>0.05) of Tau protein level in the neonatal rat CSF,and the average optical density of Tau protein in the neonatal rat hippocampus was higher (P<0.05).In the adult period,the concentration of Tau protein in CSF of the Sev group was lower than the Con group (P<0.05),however,no significant difference in the average optical density was found between the hippocampus of the two groups (P>0.05).ConclusionRepeated inhalation of sevoflurane in neonatal stage can lead to a rise in the average optical density of Tau protein in the neonatal rat hippocampus,while significantly decrease the levels of Tau protein in the adult rat CSF.The changes of Tau protein in CSF and hippocampus were not synchronous at different stages,and the change of Tau protein in CSF is not enough to be a reference index for Tau protein change in hippocampus.

Sevoflurane;CSF;hippocampal;Tau protein

國家自然科學基金資助項目(NO:81660193)；貴州省科技廳聯(lián)合資金資助項目(NO:黔科合J 字LKZ〔2012〕04)。

朱昭瓊，女，博士，主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：吸入麻醉，血液保護， E-mail:13595200340@163.com。

R614.2

A

1000-2715(2017)04-0398-03

[收稿2017-05-11;修回2017-07-12]