張 琳，郭 強(qiáng)，李杉杉，毛培春，田小霞，孟 林

(北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京 100097)

長穗偃麥草EeHKT1;4基因的克隆與植物表達(dá)載體構(gòu)建

張 琳，郭 強(qiáng)，李杉杉，毛培春，田小霞，孟 林

(北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京 100097)

采用RT-PCR方法從長穗偃麥草(Elytrigiaelongata)中克隆得到高親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，命名為EeHKT1;4，全長cDNA序列為1 977 bp，開放閱讀框1 722 bp，編碼573個(gè)氨基酸，與一粒小麥(Triticummonococcum)TmHKT1;4-A2的氨基酸同源性為94%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，EeHKT1;4與單子葉植物HKT1;4親緣關(guān)系較近。利用In-Fusion技術(shù)，成功構(gòu)建了pBI121-35S-EeHKT1;4-Nos植物表達(dá)載體，為長穗偃麥草EeHKT1;4的耐鹽功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

長穗偃麥草；高親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HKT)；In-Fusion技術(shù)；載體構(gòu)建

長穗偃麥草(Elytrigiaelongata)又名長穗薄冰草，是禾本科偃麥草屬小麥族(TriticeaeDumort)多年生根莖疏叢型草本植物，生境為海濱和鹽堿草甸，具有較強(qiáng)的耐鹽性。既是重要的優(yōu)質(zhì)牧草資源，又是防風(fēng)固沙、水土保持、改良鹽堿地的理想植物[1-2]，同時(shí)是小麥(Triticumaestivum)的近緣種，可成為改良小麥不可缺少的野生基因庫[3-5]。

高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(High Affinity K+Transporter，HKT)是植物遭受鹽脅迫傷害時(shí)，提高植物耐鹽的關(guān)鍵[6-7]。Schachtman和Schroeder首次從小麥(Triticumaestivum)中克隆得到TaHKT2;1蛋白[7]，隨后相繼在其他植物中也發(fā)現(xiàn)了HKT類蛋白[7-14]。根據(jù)異源表達(dá)結(jié)果將HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為家族I和家族II[15]，其中HKT I類蛋白家族是Na+選擇性的轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要參與木質(zhì)部Na+的卸載及韌皮部中Na+回流[16-18]，以降低植物地上部Na+濃度，維持植株地上部K+的穩(wěn)態(tài)，提高植物地上部的K+/Na+，避免植物葉片遭受鹽脅迫的傷害[19]。HKT Ⅱ類蛋白家族，是K+/Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)體，在K+、Na+選擇性吸收中起重要的作用[6]。有研究表明，擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtHKT1;1的作用是從植株葉木質(zhì)部導(dǎo)管中將Na+卸載到其周圍的薄壁細(xì)胞組織中，通過韌皮部再循環(huán)至根，降低葉片中Na+濃度[16]。水稻(Oryzasativa)OsHKT1;5的主要功能是從植株根木質(zhì)部中卸載Na+，從而參與Na+的再循環(huán)[20]。一粒小麥(Triticummonococcum)TmHKT1;5主要參與根木質(zhì)部中的Na+卸載，以降低植株地上部Na+的積累，從而維持較高的K+/Na+[21]；TmHKT1;4能夠從葉鞘和根木質(zhì)部汁液中卸載Na+，從而防止葉片中的Na+積累至毒害水平[22]。

長穗偃麥草具有極強(qiáng)的抗逆性，蘊(yùn)含豐富的抗逆性基因，又是小麥的近緣種，既可以改良鹽堿地，又可以成為改良小麥的野生基因庫。有研究報(bào)道，HKT1;4具有較強(qiáng)的耐鹽性，與植物耐鹽機(jī)制密切相關(guān)[6-7,25]，為了深入了解長穗偃麥草EeHKT1;4的生物學(xué)特性和耐鹽機(jī)制，采用RT-PCR方法從長穗偃麥草(Elytrigiaelongata)中克隆HKT蛋白基因cDNA，利用In-Fusion技術(shù)構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過PCR方法實(shí)現(xiàn)載體線性化，自由克隆基因，實(shí)現(xiàn)完美的無縫連接，成功構(gòu)建EeHKT1;4植物表達(dá)載體，為繼續(xù)深入研究其生物學(xué)特性和耐鹽機(jī)制奠定科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

以4 周齡長穗偃麥草幼苗的鮮根為植物材料，種子采自北京市農(nóng)林科學(xué)院小湯山草資源試驗(yàn)基地，感受態(tài)E.coliCompetent Cells DH5α購自TaKaRa公司，植物表達(dá)載體pBI121購自鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2主要試劑

TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(貨號：R060A)，限制性內(nèi)切酶，In-Fusion○RHD Cloning Kit(貨號：639649)購自寶生物工程(大連)有限公司。SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(貨號：B518131-0050)，SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(貨號：B518191-0050)等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。其他生化試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA的提取與cDNA的合成 從4周齡長穗偃麥草幼苗的鮮根(經(jīng)200 mmol/L NaCl處理24 h)中提取總RNA，參照TaKaRa總RNA提取試劑盒(貨號：9769)操作。cDNA第1鏈的合成按照TaKaRa試劑盒(貨號：6110A)操作進(jìn)行。

1.3.2EeHKT1;4基因目的片段的獲得 通過Primer 5軟件設(shè)計(jì)特異引物ORF-F、ORF-R，采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增長穗偃麥草EeHKT1;4基因，使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 1 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，68℃ 1 min，30循環(huán)。使用1.2%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物連接到pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中，在含有50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取轉(zhuǎn)化白斑菌株，經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定確認(rèn)為陽性克隆后，送至上海生工測序。

引物信息：

ORF-F：5′-ACGGGGGACTCTAGAATGCAAC TCCCAAGTCATAA-3′

ORF-R：5′-AGGGACTGACCACCCGGGCTAA CTAAGCTTCCAGGTCC-3′

1.3.3 pBI121載體片段獲得 將pBI121質(zhì)粒進(jìn)行XbaⅠ、SmaⅠ雙酶切，酶切體系：pBI121 10 μL，10×T Buffer 5 μL，0.1% BSA 5 μL，XbaⅠ (10 U/μL) 1.5 μL，SmaI (10 U/μL) 1.5 μL，dH2O 27 μL，Total 50 μL。酶切條件為：37℃酶切4 h。使用1%凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，并回收載體片段，命名為pBI121 Vector。

1.3.4 重組載體獲取 使用In-Fusion○R HD Cloning Kit試劑盒進(jìn)行無縫連接。In-Fusion反應(yīng)體系：5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL，pBI121 Vector 1 μL，EeHKT1;4 3 μL，dH2O 4 μL，Total 10 μL。In-Fusion反應(yīng)條件：50℃孵育15 min，于冰上終止反應(yīng)。命名為pBI121-35S-EeHKT1;4-Nos。

1.3.5 重組載體pBI121-35S-EeHKT1;4-Nos的轉(zhuǎn)化 將重組載體pBI121-35S-EeHKT1;4-Nos轉(zhuǎn)化到E.coliCompetent Cells DH5α中，將轉(zhuǎn)化體涂布于含有Kan(50 mg/L)的LB培養(yǎng)基平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑選陽性菌株，PCR檢測陽性菌株，以pBI121F1/5’HKT1;4WR1為引物，使用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取陽性菌株質(zhì)粒，使用XbaⅠ、SmaⅠ對陽性菌株進(jìn)行雙酶切檢測，以保證構(gòu)建載體的準(zhǔn)確性。

引物信息：

pBI121F1：5′-ATCTCCACTGACGTAAGG-3′

HKT1;4WR1：5′-GTCTCATCATCGGCGGTA GTCG-3′。

1.3.6 生物信息學(xué)分析 序列的比較、翻譯和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析分別在DNAMAN 6.0、Primer 5.0和MEGA 6.0軟件上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1EeHKT1;4基因目的片段獲得

以長穗偃麥草幼苗根部mRNA為模板，使用ORF框引物，通過RT-PCR方法克隆EeHKT1;4，測序結(jié)果表明，得到含1 722 bp的EeHKT1;4開放閱讀框(圖1)。

2.2EeHKT;4基因生物信息學(xué)分析

圖1 EeHKT1;4基因PCR片段Fig.1 PCR products of EeHKT1;4 fragment

克隆EeHKT1;4獲得1 722 bp的開放閱讀框，可以編碼573個(gè)氨基酸，推測分子質(zhì)量為62.92 ku，等電點(diǎn)為9.73。經(jīng)多重序列比較表明，EeHKT1;4與其他植物HKT1氨基酸序列同源性達(dá)65%以上，其中與一粒小麥TmHKT1;4-A2、硬粒小麥TdHKT1;4-1的氨基酸同源性分別為94%、85%；特別是，長穗偃麥草EeHKT1;4氨基酸序列上存在編碼P-loop A區(qū)域的一段保守序列LFFTAVSAATVSSMSTV，紅色箭頭所指的S(絲氨酸)為P-loop A區(qū)域特異選擇性位點(diǎn)，與Na+轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，長穗偃麥草EeHKT1;4與單子葉植物HKT1;4親緣關(guān)系較近，而與其他植物HKT2類蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。以上結(jié)果表明，EeHKT1;4編碼高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

圖2 長穗偃麥草EeHKT1;4與一粒小麥TmHKT1;4-A2、硬粒小麥TdHKT1;4-1氨基酸的多重比較Fig.2 Amino acid sequence alignment of EeHKT1;4 with those from TmHKT1;4-A2，TdHKT1;4-1注：箭頭所指的S(絲氨酸)為P-loop A區(qū)域特異選擇性位點(diǎn)

2.2線性載體pBI121獲得

使用XbaⅠ與SmaⅠ雙酶切植物真核表達(dá)載體pBI121，待雙酶切反應(yīng)結(jié)束后，用1%凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，獲得pBI121線性載體(圖4)，大小14 745 bp的片段，將pBI121線性載體進(jìn)行膠回收純化。

2.3pBI121-35S-EeHKT1;4-Nos重組載體獲得

根據(jù)In-Fusion無縫連接技術(shù)將EeHKT1;4基因片段與pBI121線性載體連接，得到pBI121-35S-EeHKT1;4-Nos重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliCompetent Cells DH5α中，將得到的陽性菌株進(jìn)行pBI121F1/5’HKT1;4WR1引物PCR檢測以及XbaⅠ、SmaⅠ雙酶切檢測，PCR檢測產(chǎn)物與雙酶切產(chǎn)物如圖2.5，2.6所示，經(jīng)測序結(jié)果分析顯示，該單克隆菌為帶有EeHKT1;4目的基因的陽性克隆，證實(shí)已成功獲取重組載體pBI121-35S-EeHKT1;4-Nos。

3 討論

圖3 EeHKT1;4與其他植物HKT1;4的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of EeHKT1;4 and HKT 1;4 from other plants注：AtHKT1(擬南芥，Arabidopsis thaliana)；BdHKT1;4、BdHKT1;5(二穗短柄草，Brachypodium distachyon)；EcHKT1(桉樹，Eucalyptus)EeHKT1;4(長穗偃麥草，Elytrigia elongata)；GmHKT1;5(大豆，Glycine max)；HvHKT1;4、HvHKT2;1(大麥，Hordeum vulgare)；OsHKT1;4、OsHKT1;5、OsHKT2(水稻，Oryza sativa)；PhaHKT1;5(蘆葦，Phragmites australis)；PtHKT1;5(毛果楊，Populus trichocarpa)；PutHKT2;1(小花堿茅，Puccinellia tenuiflora)；SbHKT1;4(高粱，Sorghum bicolor)；SiHKT1;4、SiHKT1;5(小米，Setaria italica)；SsHKT1(鹽地堿蓬，Suaeda salsa)；TaHKT2;1(小麥，Triticum aestivumLinn)；TdHKT1;4-1(硬粒小麥，Triticum durum)；TmHKT1;4-A2、TmHKT1;5(一粒小麥，Triticum monococcum)；ZmHKT1(玉米，Zea mays)。

圖4 pBI121載體酶切產(chǎn)物Fig.4 Enzyme-digested product of pBI121 vector

圖5 pBI121-35S-EeHKT1;4-Nos載體PCR鑒定Fig.5 PCR identification of pBI121-35S-EeHKT1;4-Nos vector.Note: 3～6 : PCR products

隨著土壤鹽漬化日益加劇，鹽脅迫給植物生長造成的傷害主要是Na+毒害[26-28]。在面臨環(huán)境脅迫的條件下，植物通過限制Na+內(nèi)流、Na+外排、Na+區(qū)域化等防御手段穩(wěn)定植物細(xì)胞內(nèi)較低濃度的Na+及高K+/Na+比以抵制Na+毒害，從而提高植物的耐鹽性[16,20,29-37]。相關(guān)研究報(bào)道，HKT在植物耐鹽中發(fā)揮著重要作用[6]，其中HKT I類蛋白主要是Na+選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)候選基因，在植物體內(nèi)主要參與木質(zhì)部Na+的卸載以及韌皮部Na+的回流[17-18]。有研究表明，擬南芥AtHKT1;1通過木質(zhì)部Na+卸載、韌皮部Na+向根部的回流，降低植物內(nèi)部Na+濃度，以提高植物耐鹽性[38]。小麥TaHKT1是高親和K+/Na+同向轉(zhuǎn)運(yùn)載體[39]，主要介導(dǎo)Na+內(nèi)流，參與根部Na+的吸收，植物主要通過降低其表達(dá)量來限制Na+內(nèi)流，從而降低植物體內(nèi)Na+濃度[40]。硬粒小麥耐鹽品系149由Nax1與Nax2通過調(diào)控木質(zhì)部Na+外排來減少Na+從根部向地上部的運(yùn)輸，同時(shí)也可促進(jìn)K+的吸收，另外Nax1 主要通過消除葉鞘(葉片末端)木質(zhì)部中Na+的聚集，阻止Na+在葉片中過量積累[41]。一粒小麥中Nax1與Nax2的候選基因TmHKT1;4、TmHKT1;5通過木質(zhì)部Na+外排，阻止Na+過量積累[42]。水稻OsHKT1;5主要在植物根中表達(dá)，是Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要特異性調(diào)節(jié)Na+的內(nèi)流，可以從根的木質(zhì)部中將過多的Na+卸載到周圍薄壁細(xì)胞中，促進(jìn)Na+的卸載，提高植株地上部組織中的K+/Na+[43-44]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，OsHKT1;5的功能與AtHKT1;1的功能一致[16]。因此，HKT I類蛋白主要通過限制根部Na+的吸收，增加Na+外排，以維持植物體內(nèi)，特別是地上部低的Na+濃度和高的K+/Na+比，是高等植物耐鹽性的關(guān)鍵[45]。

此次研究從長穗偃麥草中克隆出EeHKT1;4基因，經(jīng)多重序列比較發(fā)現(xiàn)，EeHKT1;4與其他植物HKT1;4核酸序列的同源性均在85%以上，而氨基酸序列的同源性則在80%以上，特別是與一粒小麥TmHKT1;4 氨基酸同源性高達(dá)94%。研究表明，HKT1類蛋白第1個(gè)P-loop區(qū)域含有一段高度保守片段(FFTAVSAATVSSMS)，均具有一個(gè)絲氨酸離子選擇性位點(diǎn)[46]。長穗偃麥草EeHKT1;4的P環(huán)結(jié)構(gòu)中也存在LFFTAVSAATVSSMSTV片段，且有絲氨酸位點(diǎn)，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，EeHKT1;4主要與單子葉植物HKT1;4親緣關(guān)系較近。這表明，EeHKT1;4是一個(gè)特異的Na+離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可能將Na+從葉鞘組織及根木質(zhì)部汁液中卸載，以防止植物光合組織中的Na+積累至毒害水平，從而在維持植株地上部K+、Na+穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。

4 結(jié)論

長穗偃麥草是小麥的近緣種，經(jīng)過長期的研究發(fā)現(xiàn)，其自身蘊(yùn)含了豐富的耐鹽基因，可作為小麥改良中的野生基因庫，也是改良鹽堿地的理想植物。研究利用In-Fusion技術(shù)成功構(gòu)建了pBI121-35S-EeHKT1;4-Nos植物表達(dá)載體。為EeHKT1;4耐鹽功能鑒定及遺傳穩(wěn)定性的評價(jià)奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而揭示EeHKT1;4在長穗偃麥草Na+轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，這將對農(nóng)作物和優(yōu)良牧草的耐鹽遺傳改良提供理論依據(jù)和應(yīng)用價(jià)值。

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GenecloningandconstructionofplantexpressionvectorofEeHKT1;4inElytrigiaelongata

ZHANG Lin,GUO Qiang,LI Shan-shan,MAO Pei-chun,TIAN Xiao-xia,MENG Lin

(BeijingResearchandDevelopmentCenterforGrassandEnvironment,BeijingAcademyofAgricultureandForestryScience,Beijing100097,China)

A high-affinity K+transporter gene was cloned fromElytrigiaelongatausing the RT-PCR technique.This Gene was designated asEeHKT1;4,and contained a 1 722 bp open reading frame and encoded 573 amino acids residues.The length of cDNA was 1 977 bp.The gene shared 94% of homology withTmHKT1;4-A2 from wheat (Triticummonococcum).The gene has a closer genetic relationship with the HKT1;4 from other monocotyledons using phylogenetic tree analyzing.In addition,the pBI121-35S-EeHKT1;4-Nos vector was constructed successfully using the In-Fusion technology.This would provide the important basis for further study in salt tolerance ofEeHKT1;4 inElytrigiaelongata.

Elytrigiaelongata;high-affinity K+transporter gene;In-Fusion technology;construction of expression vector

2016-12-27；

：2017-01-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272489)；北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)(KJCX20140103)資助

張琳(1988-)，女，河北邱縣人，碩士研究生。 E-mail：zl827935831@126.com 孟林為通訊作者。

S 512

：A

：1009-5500(2017)04-0001-07