高原，丁萬隆，李勇

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

·中藥農(nóng)業(yè)·

人參銹腐菌Cylindrocarpon destructans侵染早期人參根尖顯微及超微結(jié)構(gòu)變化△

高原，丁萬隆，李勇*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：研究人參銹腐菌Cylindrocarpondestructans接種后人參根尖顯微及超微結(jié)構(gòu)的變化情況。方法：采用石蠟切片法研究人參根尖顯微結(jié)構(gòu)，透射電鏡研究人參根尖超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：與對照相比，銹腐菌接種7 d后人參根尖表皮細胞細胞壁明顯增厚，表皮細胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒物沉積，部分表皮細胞的細胞壁出現(xiàn)破裂，細胞發(fā)生解體，且根內(nèi)髓部同樣出現(xiàn)顆粒物。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組人參根尖細胞形狀規(guī)則，內(nèi)含物豐富，細胞器清晰可辨；接種人參銹腐菌后人參根尖細胞形態(tài)異常，細胞內(nèi)含物減少，細胞器因解體消失而無法辨別。結(jié)論：人參銹腐菌可能是先侵染人參表皮細胞，再通過細胞間隙進入木質(zhì)部，阻礙水分和無機鹽運輸，導(dǎo)致人參發(fā)病死亡。

人參；人參銹腐菌；侵染；顯微結(jié)構(gòu)；超微結(jié)構(gòu)

人參PanaxginsengC.A.Meyer為五加科人參屬多年生草本植物，主產(chǎn)于我國東北地區(qū)，具有抗衰老、抗氧化、增強免疫力等功效，市場需求量巨大。人參栽培周期較長，土傳病害發(fā)生較為普遍，嚴(yán)重影響人參產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。由人參銹腐菌Cylindrocarpondestructans引起的人參銹腐病是人參產(chǎn)區(qū)發(fā)生最為普遍，危害性最大的病害之一。Rahman和Punja[3]在研究人參銹腐菌侵染寄主時發(fā)現(xiàn)，病菌菌絲直接穿透人參表皮細胞并在皮層細胞內(nèi)生長，隨后細胞分解并伴有酚類化合物大量積累。Kim等[4]發(fā)現(xiàn)接種人參銹腐菌后，人參會出現(xiàn)細胞壁增厚，以及接種部位周皮損傷的現(xiàn)象。這些研究表明銹腐菌侵染會導(dǎo)致人參內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變。人參銹腐菌和寄主互作研究主要集中在銹腐菌侵染后人參防御酶的變化[5]，但對于人參銹腐菌的侵染方式以及病菌侵染后人參內(nèi)部組織、細胞器變化的研究鮮有報道。本研究使用盆栽接種實驗，利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡，觀察人參銹腐菌侵染后人參根尖的顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)變化，旨在明確人參銹腐菌侵染對人參內(nèi)部組織和細胞形態(tài)的影響，為研究人參銹腐菌與寄主植物人參的互作機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1供試材料

植物材料為三年生人參苗，取自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所實驗田。致病菌人參銹腐菌Cylindrocarpondestructans由課題組分離、保存。

1.2植物材料接種方法及樣品采集

選取三年生健康人參苗，用50%多菌靈800倍稀釋液浸泡10min滅菌，再用蒸餾水沖洗3次。將人參苗移栽到裝有無菌石英砂的塑料盒中，每盒36株，光周期為16/8h，25℃室溫環(huán)境下培養(yǎng)，參考李勇等[6]采用Hoagland營養(yǎng)液提供人參苗生長所需養(yǎng)分。待人參苗葉片完全展開后，處理組接種濃度為3.9×107cfu·mL-1的病原菌孢子懸浮液250mL，對照組噴施等量Hoagland營養(yǎng)液。接種1d，4d，7d后分別收集對照組和處理組人參幼根，先用無菌水沖洗3次，再用無菌濾紙吸干水分備用，每個時間點取10份根尖樣品。

1.3石蠟切片制作

用手術(shù)刀片切取5mm人參幼苗根尖，將材料置于福爾馬林-醋酸-酒精(FAA)中固定2h以上，放置備用。參考陳長寶[7]的方法制作石蠟切片，包埋材料分別縱切和橫切，以厚度10μm進行連續(xù)切片，依次用番紅、固綠對不同部位染色，切片烘干后用Leica DM2500型光學(xué)顯微鏡觀察處理組與對照組根尖細胞橫切面、縱切面的顯微結(jié)構(gòu)，拍照留存。

1.4電鏡觀察

用手術(shù)刀片從對照組和處理組切取1mm3人參幼苗根尖樣品，用2.5%戊二醛固定3h，樣品固定后送至中國農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡室制作超薄切片，利用JEM-1400透射電鏡觀察人參根尖細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，拍照留存。

2 結(jié)果與分析

2.1病菌接種后人參根部的癥狀

接種1d后，人參根表出現(xiàn)微弱銹色斑點，表皮完好。接種4d后，有機械損傷的根部出現(xiàn)銹斑，表皮仍完好。接種7d后，銹斑擴大，易被觀察到，表皮有失水現(xiàn)象出現(xiàn)(圖1)。

注：A.對照組人參根表；B.接菌1 d后的人參根表癥狀；C.接菌4 d后人參根表癥狀；D.接菌7 d后人參根表癥狀；a.根表有微小銹斑出現(xiàn)；b.根部有機械損傷或結(jié)點部位出現(xiàn)銹斑；c.根表細胞失水圖1 銹腐菌接種后人參幼根部位的癥狀

注：A1.對照組人參根尖橫切面(10×10倍放大)；B1.接菌7 d后人參根尖橫切面(10×10倍放大)；A2.對照組人參根尖橫切面(10×40倍放大)；B2.接菌7 d后人參根尖橫切面(10×40倍放大);a.表皮細胞壁增厚；b.髓腔內(nèi)顆粒物沉積圖2 人參銹腐菌接種后人參根尖橫切面的顯微結(jié)構(gòu)

注：A1.對照組人參根尖縱切面(10×10倍放大)；B1.接菌7 d后人參根尖縱切面(10×10倍放大)；A2.對照組人參根尖縱切面(10×40倍放大)；B2.接菌7 d后人參根尖縱切面(10×40倍放大)；a.細胞內(nèi)充滿顆粒物；b.細胞內(nèi)有菌絲侵入圖3 人參銹腐菌接種后人參根尖縱切面的顯微結(jié)構(gòu)

2.2人參銹腐菌接種對人參根尖細胞顯微結(jié)構(gòu)的影響

在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組人參幼根表皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，人參銹腐菌接種7d后人參根尖表皮細胞壁出現(xiàn)明顯增厚，細胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒物沉積，部分表皮細胞胞壁破裂以及發(fā)生細胞解體。且根內(nèi)髓部同樣有顆粒物出現(xiàn)，推測菌絲已侵入木質(zhì)部，阻礙了根內(nèi)水分和無機鹽的運輸，最終導(dǎo)致表皮失水(圖2)。

如圖3所示，由人參根尖縱切面顯微結(jié)構(gòu)可見，對照組人參根尖表皮細胞和韌皮部細胞結(jié)構(gòu)正常，界限分明，表皮細胞排列緊密，且絕大部分細胞的細胞核清晰可見。接種人參銹腐菌7d后人參根尖表皮細胞排列混亂，且表皮細胞出現(xiàn)顆粒物沉積，部分根尖細胞的細胞核難以辨識。在10×40倍視野中，部分細胞內(nèi)充滿菌絲，病變細胞開始溶解。

2.3人參銹腐菌接種對人參根尖細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照組人參根尖細胞形狀規(guī)則，內(nèi)含物豐富，細胞中心有1個大液泡，細胞核及其他細胞器在細胞邊緣，貼近細胞壁分布。接種人參銹腐菌后，人參根尖細胞形態(tài)出現(xiàn)異常，細胞內(nèi)含物減少，細胞器因解體消失而無法辨別(圖4)。

注：A.對照組人參根尖細胞；B.處理組人參根尖細胞；CW.細胞壁；N.細胞核；V.液泡；C.d.人參銹腐菌圖4 人參銹腐菌接種前后人參根尖超微結(jié)構(gòu)

3 討論

病原菌與植物間存在互作反應(yīng)，植物感受到病菌侵染后，會在細胞壁與質(zhì)膜間沉積形成胞壁沉積物以抵御病菌入侵[8]。病菌侵染早期，植物內(nèi)部通過信號傳遞激活效應(yīng)器，使抗病基因表達上調(diào)，做出防衛(wèi)反應(yīng)[9]。病原真菌侵染植物的方式較多，如分泌酶類消化細胞壁[10-11]、物理穿透或者二者兼有[12]。立枯絲核菌侵染水稻時產(chǎn)生胞壁降解酶，導(dǎo)致水稻葉鞘細胞膜透性改變，組織結(jié)構(gòu)損傷，以及細胞壁破裂，從而易于病斑形成[13-14]。立枯絲核菌侵染馬鈴薯時，則先形成附著胞，再形成侵染墊緊貼在寄主表面，通過表皮細胞或細胞間隙進入寄主組織內(nèi)，侵染順序為：芽-莖-根-匍匐莖-塊莖[15]。疫霉菌侵染大豆幼苗時，先形成附著胞，然后產(chǎn)生入侵結(jié)構(gòu)，從表皮細胞間隙侵入寄主組織，通過細胞間隙向皮層組織擴展。有些病菌在菌絲突破表皮蠟質(zhì)層后未繼續(xù)入侵，而是在蠟質(zhì)層和表皮細胞壁之間擴展[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，接種銹腐菌4d后人參根尖開始出現(xiàn)銹斑，表明銹腐菌侵染迅速，人參對銹腐菌的侵染應(yīng)答可能發(fā)生在病菌侵染后1～4d內(nèi)。銹腐菌接種7d后人參根尖出現(xiàn)明顯的銹斑癥狀，表皮細胞明顯增厚并出現(xiàn)顆粒物，表明菌絲主要由表皮細胞侵入。韌皮部細胞基本完好，細胞間隙偶見菌絲，木質(zhì)部髓腔內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒物，推測菌絲通過細胞間隙侵入木質(zhì)部阻塞導(dǎo)管，阻礙了人參根部對水分和無機鹽的運輸，最終導(dǎo)致人參失水腐爛，死亡。本研究未觀察到附著胞與侵染墊，推測侵染結(jié)構(gòu)可能在接菌后2～3d內(nèi)形成，有關(guān)人參銹腐菌致病機理以及菌絲侵入途徑，有待進一步研究。

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MicrostructureandUltrastructureChangesofPanaxginsengRootsInfectedbyCylindrocarpondestructansatEarlyStage

GAO Yuan，DING Wanlong，LI Yong*

(Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College，Beijing 100193，China)

Objective：To study the microstructure and ultrastructure changes ofPanaxginsengroots infected byCylindrocarpondestructans.Methods：The paraffin section was used to observe the microstructure of root tips ofP.ginseng.The superfine slice was used to observe the ultrastructure of root tips ofP.ginseng.Results：Microstructure showed that the morphology and structure of epidermal cells ofP.ginsengwere regular in control.However，epidermal cell wall became thicker 7 days post inoculation ofC.destructans，and particles deposition in cells as well as in pith parts was shown.The cell walls were broken，cells began to disintegrate.Ultrastructure showed that morphology of root cells ofP.ginsengwas regular in control.Cells had abundant contents，and organelles were easy to observe.On the contrary，morphology of cells was abnormal and contents in cells were decreased when infected byC.destructans.The organelles were break up，and some of them were disappeared.Conclusion：The hypha invaded the epidermal cells ofP.ginsengmaybe the first step ofC.destructansinfection.Then hypha entered into xylem of ginseng root through the intercellular space，which obstructed the transport of water and inorganic salt，and finally lead to the death of root cells.

Panaxginseng；Cylindrocarpondestructans；infection；microstructure；ultrastructure

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201407005)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程(2016-I2M-3-017)

] 李勇，研究員，研究方向：藥用植物病害生物防治；E-mail：liyong@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.023

2016-11-30)

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