孟慶達，周新虎，陳翔，堵國成, 4，陳堅, 5，方芳*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫， 214122) 2(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫， 214122) 3(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇 宿遷， 223800) 4(糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫， 214122) 5(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫， 214122)

白酒釀造過程酒醅中尿素的控制與減少

孟慶達1, 2，周新虎3，陳翔3，堵國成1, 2, 4，陳堅1, 2, 5，方芳1, 2*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫， 214122) 2(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫， 214122) 3(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇 宿遷， 223800) 4(糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫， 214122) 5(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫， 214122)

尿素是白酒釀造過程酒醅中含有的氨基甲酸乙酯的主要前體之一，對濃香型白酒中氨基甲酸乙酯含量影響較大，通過降低酒醅中尿素含量可以控制或減少白酒中氨基甲酸乙酯的含量。采用產脲酶菌株或其粗酶與酒醅混合，可在發(fā)酵過程中降低尿素含量。 從大曲中篩選到3株產脲酶的腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus,S.saprophyticus)在酒醅固態(tài)發(fā)酵中去除尿素效果不顯著，產酸性脲酶的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri,L.reuteri)全細胞及其粗酶對酒醅中尿素均有很好的去除效果。通過與商品脲酶比較，羅伊氏乳桿菌所產脲酶粗酶對酒醅中尿素去除效果更佳，尿素去除率可達100%。當羅伊氏乳桿菌添加量高于107CFU/g酒醅時，尿素去除率在97.3% 以上，粗酶加入量高于25 U/kg酒醅時，尿素去除率在77.4% 以上。羅伊氏乳桿菌能較好地去除白酒酒醅中尿素。

白酒；氨基甲酸乙酯；尿素；脲酶；羅伊氏乳桿菌；腐生葡萄球菌

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)是許多發(fā)酵食品中普遍存在的2A類致癌物質[1]，可導致肺癌、淋巴癌、肝癌等疾病[2]。其形成途徑主要是由相關前體物質在食品發(fā)酵或貯藏過程中反應生成。EC前體物質有尿素、乙醇、氰化物、氨甲酰磷酸、瓜氨酸等[3]。研究發(fā)現，酒精飲料中氨基甲酸乙酯[4-5]的主要前體有2種：第1種是氰化物[6-7]，第2種是與尿素循環(huán)有關的物質，如尿素、精氨酸、瓜氨酸等[8]。在黃酒和清酒中，尿素是最主要的EC前體物質，對EC含量影響較大，相關方面的研究較多[9-11]。OUGH[12]早在1976年就證明尿素與乙醇溶液于室溫下反應72 h即可生成EC，同時也發(fā)現葡萄汁發(fā)酵過程中EC的主要來源是由精氨酸分解而來的尿素[13]。前期研究表明，以五糧為原料生產的白酒，酒醅中含有的氨基甲酸乙酯主要前體有尿素和瓜氨酸。二者在蒸酒過程和儲酒過程可與體系中存在的乙醇反應生成氨基甲酸乙酯[14]。其中尿素與氨基甲酸乙酯的變化趨勢基本同步，二者具有一定的相互關系[15-16]。為了降低酒精飲料中尿素含量，從而減少EC的產生，科研工作者嘗試了許多方法，其中包括使用酸性脲酶降解尿素[17-19]、調控氮代謝獲得不積累或少積累尿素的釀酒酵母[3, 20-22]、對原料進行精加工[10, 23]等。目前，對于白酒發(fā)酵中尿素抑制策略的研究還較少。由于白酒是我國特有的傳統(tǒng)酒種，這類問題還需要我國科研工作者的自主研究才能解決[7]。

白酒釀造工藝復雜[24]，涉及到許多關鍵的原料處理過程。釀造原料如小麥、玉米、大米、高粱、糯米等均含有一定量尿素[14]，原料處理過程中一般無法將尿素去除，工藝改變則會對釀造產品產生影響。酒醅中尿素主要由原料帶入[14, 25]。在發(fā)酵過程中，隨著乙醇的生成，尿素與乙醇緩慢反應[12, 26-27]，生成EC。酒醅蒸餾出酒時，不但會加快尿素與乙醇反應生成EC[23, 28-29]，還會使更多的EC進入原酒中[30-31]，增加白酒中EC含量。由于EC性質穩(wěn)定，在白酒中直接去除較難實現，適用于黃酒、清酒、葡萄酒等低度酒的方法[32-33]不適用于白酒。通過在蒸酒和儲酒前降低其前體尿素的含量來減少EC產生的方法較為可行。楊宇清等[34]應用食品級脲酶降解黃酒中尿素，效果顯著，有效降低了尿素在黃酒煎酒滅菌和貯存過程中對EC生成的影響。由于白酒與黃酒發(fā)酵方式和發(fā)酵體系的較大差異，應用酶法在白酒釀造過程中降低尿素含量仍需要新的探索。

本研究以濃香型白酒的窖內發(fā)酵過程為研究對象，以降低酒醅中尿素的含量為目的，利用脲酶在白酒發(fā)酵過程中將尿素去除。通過比較不同來源的產脲酶微生物菌株或粗酶的作用，對全細胞和脲酶去除固態(tài)發(fā)酵酒醅中尿素進行探究，選出降低尿素效果較好的菌株或脲酶。運用酶法降低尿素，進而減少EC的產生，安全高效，為降低白酒中有害物質氨基甲酸乙酯的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌種

StaphylococcussaprophyticusM3，StaphylococcussaprophyticusM26，StaphylococcussaprophyticusM39(本研究)；LactobacillusreuteriCICC6124 (購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，CH3COONa 2，KH2PO42，NaCl 5，尿素20，用HCl(1.5 mol/L)調節(jié)pH至4.0。

篩選培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母提取物5，KH2PO42，NaCl 5，CH3COONa 2，尿素 20，溴百里酚藍(終濃度0.005 g/L)，瓊脂 20，pH 5.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母提取物5，KH2PO42，NaCl 5，CH3COONa 2，MnSO4·4H2O 0.05，NiSO4·H2O 0.05，pH 6.8。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉浸膏8，酵母提取物4，吐溫80 1，C6H5O7(NH4)32， K2HPO42，CH3COONa 5，MgSO4·7H2O 2，MnSO4·4H2O 0.05，山梨醇單油酸酯1 mL。

1.1.3 其他原料

高溫大曲和入窖酒醅，取自江蘇洋河酒廠股份有限公司。

1.2試劑及儀器

主要試劑：9-羥基占頓醇(≥99.0%)，色譜純，Sigma-Aldrich公司；商品脲酶、溶菌酶，上海生工股份有限公司；尿素，上海生工股份有限公司；濃鹽酸、濃硫酸、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、無水硫酸鈉(分析純)，上海國藥集團試劑公司。

儀器設備： MP-FastPrep樣品處理系統(tǒng)，美國MP；Sonic超聲破碎儀，南京新辰生物科技有限公司；高效液相色譜儀(Agilent-1260)，美國安捷倫公司；紫外分光光度計，日本島津公司；臺式高速離心機，德國Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1 產脲酶菌株的分離

采用改良的篩選產酸性脲酶菌株的方法[17]。將大曲和無菌生理鹽水混合后接種富集培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)24 h。稀釋涂布篩選培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)48 h。選取陽性菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)24 h，測定脲酶活性。

1.3.2 菌株屬種鑒定

提取微生物的基因組，用細菌16S rDNA的通用引物27F、1492R擴增得到的產物送上海生工進行測序。將16S rDNA序列在NCBI(GenBank)數據庫中進行BLAST比對分析鑒定。

1.3.3 菌懸液和脲酶粗酶液制備

菌懸液制備：將羅伊氏乳桿菌純培養(yǎng)物劃線接種在MRS固體培養(yǎng)基上，30 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接入MRS液體培養(yǎng)基，30 ℃厭氧培養(yǎng)72 h，將菌液8 000 r/min離心2 min，去除上清液，用無菌生理鹽水重新懸浮至OD600為10左右，備用。將3株腐生葡萄球菌純培養(yǎng)物分別劃線接種在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃ 220 r/min搖床培養(yǎng)24 h，將菌液8 000 r/min離心2 min，去除上清液，用無菌生理鹽水重新懸浮至OD600為10左右，備用。菌懸液可用無菌生理鹽水稀釋至5×105～5×109CFU/mL。

脲酶粗酶液制備：羅伊氏乳桿菌在液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，用PBS緩沖液(pH 7.0)洗滌3次，重新懸浮，加入終質量濃度為5 mg/mL的溶菌酶后30 ℃水浴處理1 h，超聲破碎20 min，4 ℃ 15 000 r/min離心10 min，取上清液作為脲酶粗酶液。腐生葡萄球菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，細胞破壁取上清液作為脲酶粗酶液。以脲酶粗酶液為母液，4 ℃保存?zhèn)溆?。商品脲酶購買于上海生工股份有限公司(編號A003885)，用PBS緩沖液溶解并稀釋至相應濃度。脲酶粗酶液用PBS緩沖液稀釋至30～500 U/L。

1.3.4 模擬窖內發(fā)酵

固態(tài)發(fā)酵：取300 g即將入窖的酒醅(現取現用，如果在-30 ℃保存一段時間后，需要按工廠工藝重新添加大曲)，添加60 mL相應濃度的純菌液或粗酶液，攪拌均勻，分裝至三角瓶中，用發(fā)酵栓封口。以添加等體積無菌水的入窖酒醅作對照，無添加的入窖酒醅為空白對照，30 ℃發(fā)酵70 d。模擬發(fā)酵實驗流程如圖1所示。

圖1 模擬窖內發(fā)酵實驗示意圖Fig.1 The schematic diagram of simulating the alcoholic fermentation in pits

1.4分析檢測

1.4.1 脲酶活性測定

脲酶活性測定采用Berthelot reaction比色法[35]，即：取1 mL粗酶液和1 mL超純水，各加入1 mL 40 g的尿素溶液。37 ℃恒溫水浴反應15 min后加入1 mL 100 g/L三氯乙酸終止反應，振蕩混勻。分別加入1 mL的顯色劑I和1 mL顯色劑II，混勻后于37 ℃水浴20 min。顯色反應結束后用超純水定容至10 mL，于分光光度計625 nm處測定吸光值。

顯色劑I：將30 g苯酚和1.25 g亞硝基鐵氰化鈉溶于超純水，定容至500 mL；

顯色劑II：將26.25 g氫氧化鈉和15 mL次氯酸鈉溶于超純水，定容至500 mL；

終止劑：稱取50 g三氯乙酸溶于超純水，定容至500 mL；

酶活定義：在常壓、37 ℃、pH 7.0的條件下，每分鐘分解尿素生成1 μmol氨所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

(1)

式中：ΔOD625，樣品與空白對照吸光值之差，nm；n，酶液稀釋倍數；k，標準曲線斜率倒數；15，反應時間，min。

1.4.2 尿素測定

采用HPLC-FLD測定尿素含量[36-37]。取固態(tài)發(fā)酵酒醅20 g，加入30 mL無菌水，混勻，超聲20 min，離心取上清液測定尿素含量。

測定所需試劑：

占頓醇：稱取0.198 g 9-羥基占頓醇溶于50 mL甲醇(0.02 mol/L)， 4 ℃避光保存。

鹽酸溶液：濃鹽酸用超純水稀釋成1.5 mol/L。

流動相A：1.640 g無水乙酸鈉溶于1 000 mL純水，濃度為0.02 mol/L，用體積分數1%乙酸溶液調節(jié)pH至7.2，溶液用0.22 μm水系濾膜過濾。

流動相B：乙腈(HPLC)。

衍生化反應：取待測樣品400 μL，加600 μL占頓醇溶液，加100 μL鹽酸溶液，混勻后，暗反應30 min。反應后溶液過0.22 μm有機濾膜，HPLC進樣測定。

色譜條件：色譜柱為 Gemini-NX 5u C18(250 mm×4.6 mm)；柱溫35 ℃；流速設定為1 mL/min；流動相A為0.02 mol/L乙酸鈉溶液，流動相B為乙腈，流動相C為純水。

2 結果分析

2.1產脲酶菌株的分離篩選及鑒定

從大曲中分離到204株菌，通過篩選獲得3株有脲酶活性的菌株。通過分子生物學鑒定，確定3株菌均是腐生葡萄球菌，系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖2所示。

圖2 菌株M3、M26和M39基于16S rDNA的系統(tǒng)進化樹Fig.2 The evolutionary tree of strains M3, M26 and M39 build based on their 16S rDNA

2.2產脲酶菌株及其粗酶對酒醅中尿素的降解

將產脲酶的3株腐生葡萄球菌和羅伊氏乳桿菌及其粗酶分別添加到酒醅中進行固態(tài)發(fā)酵，考察其對發(fā)酵過程酒醅中尿素的降低效果。分別取發(fā)酵15 d和70 d酒醅樣品測定尿素含量，作用效果如圖3所示。羅伊氏乳桿菌去除尿素效果顯著(圖3a)，發(fā)酵15 d即可將酒醅中尿素去除，去除率達100%。發(fā)酵終點時(70 d)，酒醅中有少量尿素生成，可能是在發(fā)酵中后期由釀酒酵母代謝產生。3株腐生葡萄球菌在發(fā)酵終點時對酒醅中尿素去除率為15%～23%(圖3a)。腐生葡萄球菌在模擬窖內發(fā)酵時期對尿素的降解效果不如羅伊氏乳桿菌，M39是去除尿素效果最好的菌，發(fā)酵終點時酒醅中尿素去除率為23.2%。添加菌株產的脲酶粗酶液的酒醅中尿素去除效果與菌株類似：羅伊氏乳桿菌的粗酶對酒醅中尿素降低效果非常顯著，在發(fā)酵前期尿素去除率達100%(圖3b)。發(fā)酵至70 d，酒醅尿素含量沒有明顯增加。腐生葡萄球菌所產脲酶粗酶在窖內發(fā)酵時對尿素去除率不如羅伊氏乳桿菌所產脲酶粗酶，其中M3所產脲酶去除尿素效果最好，發(fā)酵終點時尿素去除率為15.43%。3株腐生葡萄球菌雖來源于大曲，但其所產脲酶對酒醅中尿素的去除效果不顯著。羅伊氏乳桿菌所產脲酶曾被用于黃酒中尿素的去除，效果顯著，其在酒醅中的尿素降低效果亦是如此。由此可見，在模擬發(fā)酵條件下，羅伊氏乳桿菌所產脲酶比3株腐生葡萄球菌更適合于酒醅中尿素的去除。

a-酒醅中添加菌液；b-酒醅中添加脲酶粗酶；對照-起始，即發(fā)酵0 d對照；對照-終點，即發(fā)酵15 d或70 d對照；M3-腐生葡萄球菌M3；M26-腐生葡萄球菌M26；M39-腐生葡萄球菌M39圖3 不同產脲酶菌株或脲酶粗酶降解酒醅中尿素效果對比Fig.3 Degradation of urea in fermented grains by bacteria and their urease

2.3羅伊氏乳桿菌脲酶與商品脲酶降解酒醅中尿素的對比

將羅伊氏乳桿菌及其所產脲酶粗酶分別與商品脲酶進行了降解酒醅中尿素效果的比較。在酒醅中脲酶含量為200 U/kg酒醅的條件下，發(fā)酵15 d，羅伊氏乳桿菌全細胞及其脲酶粗酶對酒醅中尿素降解率達100%，而商品脲酶無明顯降解效果(圖4)。將加入酒醅的商品脲酶含量增加至10 000 U/kg酒醅時，尿素去除率為35.2%。由此說明，羅伊氏乳桿菌所產脲酶在模擬發(fā)酵中降低酒醅尿素時，性能優(yōu)于商品脲酶。

對照-起始，即發(fā)酵0 d對照；對照-終點，即發(fā)酵15 d對照；對照-空白，即發(fā)酵15 d空白對照；200-酶濃度200 U/kg；10 000-酶濃度10 000 U/kg圖4 商品脲酶或羅伊氏乳桿菌產脲酶對酒醅中尿素降解效果比較Fig.4 Degradation of urea in fermenting grains by urease or Lactobacillus reuteri

2.4羅伊氏乳桿菌菌濃和脲酶粗酶對酒醅中尿素含量的影響

添加不同濃度的羅伊氏乳桿菌菌液和粗酶液于酒醅，固態(tài)發(fā)酵15 d，取樣測定尿素含量，結果如圖5所示。

a-酒醅中添加不同酶液；b-酒醅中添加不同菌液；對照-起始，即發(fā)0 d對照；對照-終點，即發(fā)酵15 d對照；對照-空白，即發(fā)酵15 d空白對照圖5 脲酶添加量和菌濃對酒醅中尿素降解效果的影響Fig.5 Effect of urease activity and bacteria concertation on urea degradation in fermented grains

接菌量在107CFU/g酒醅及以上時，酒醅中尿素基本能完全去除，接菌量在106CFU/g酒醅時，尿素去除率為34.05%。接菌量過低，尿素去除效果較差，過高可能會對發(fā)酵產生更多影響，所以，羅伊氏乳桿菌在模擬發(fā)酵中對酒醅中尿素去除的最佳接種濃度為107CFU/g酒醅。當加酶量為12.5 U/kg酒醅時，酒醅中尿素去除率達56%，當加酶量達到50 U/kg酒醅時，酒醅中尿素基本能完全去除。所以，羅伊氏乳桿菌粗酶在模擬發(fā)酵中去除酒醅中尿素的最佳濃度為50 U/kg酒醅。

對比圖5中菌濃度和粗酶，根據制備粗酶時菌懸液濃度進行換算，酶濃度50 U/kg酒醅相當于菌濃度5×108CFU/g酒醅。由圖5尿素去除效果可以看出，羅伊氏乳桿菌全細胞比粗酶降低酒醅中尿素效率更高。這可能是因為微生物細胞能夠持續(xù)不斷合成脲酶或者對脲酶具有一定的保護作用，脲酶活性相對穩(wěn)定，促進酒醅中更多尿素的分解。

3 討論

本論文以降低酒醅中尿素為目的，利用產脲酶菌全細胞或粗酶減少酒醅中的尿素含量?？紤]到外源菌株可能對白酒發(fā)酵體系產生干擾，產脲酶菌優(yōu)先從大曲中篩選分離。將篩選到的3株產脲酶腐生葡萄球菌與已知產酸性脲酶的羅伊氏乳桿菌分別添加到酒醅中進行固態(tài)發(fā)酵，對比尿素去除效果。羅伊氏乳桿菌所產脲酶對酒醅中尿素具有很好的去除效果，去除率在89%以上；從大曲中篩選的3株腐生葡萄球菌，其所產脲酶在酒醅中沒有顯著降低尿素。對比羅伊氏乳桿菌和腐生葡萄球菌M39所產脲酶的pH穩(wěn)定性發(fā)現，前者所產脲酶最適pH低于后者。酒醅是酸性體系，腐生葡萄球菌所產脲酶很可能無法耐受酒醅中酸性環(huán)境而很快失活，導致無法降低尿素。把羅伊氏乳桿菌所產脲酶與商品脲酶進行對比，發(fā)現羅伊氏乳桿菌粗酶降解尿素效果優(yōu)于商品脲酶。對比酒醅中添加的產脲酶菌濃度和粗酶濃度，全細胞比粗酶去除酒醅中尿素的效率更高，可能是因為細胞對脲酶具有一定的保護作用或者細胞持續(xù)產生更多的脲酶。由于白酒發(fā)酵的復雜性和特殊性，應用大曲來源的產脲酶菌去除尿素較合適，但去除效果不佳。后面的研究還可繼續(xù)從大曲中篩選與羅伊氏乳桿菌所產脲酶性能相近的菌株。羅伊氏乳桿菌不是來源于大曲的菌株，其所產脲酶曾被用于黃酒中尿素去除。由于黃酒是液態(tài)發(fā)酵，白酒為固態(tài)發(fā)酵，并且向黃酒中添加脲酶是在發(fā)酵結束時，因此本論文將脲酶應用于白酒固態(tài)發(fā)酵是一種全新的嘗試。羅伊氏乳桿菌是否對白酒的品質產生影響，仍需要進一步驗證和改進，使其盡快適用于白酒的工業(yè)化生產。目前對于白酒中EC的降低策略鮮有報道，本研究通過降低EC前體物質含量從而減少EC的生成，為降低白酒中EC的研究提供參考。

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ReductionofureainfermentedgrainsduringChineseliquorbrewingprocess

MENG Qing-da1, 2, ZHOU Xin-hu3, CHEN Xiang3,DU Guo-cheng1, 2, 4, CHEN Jian1, 2, 5, FANG Fang1, 2*

1(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Wuxi 214122, China) 3(Jiangsu Yanghe Distillery Co．LTD．, Suqian 223800, China) 4(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Wuxi 214122, China) 5 (National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Wuxi 214122, China)

Urea is one of the main precursors of ethyl carbamate in Chinese liquor fermentation process. It has a significant effect on the formation of ethyl carbamate in Chinese Luzhou-flavor spirits. By reducing the urea content in fermented grains, the content of ethyl carbamate in Chinese liquor could be reduced. Urease-producing strains or crude urease were mixed with fermented grains to reduce the content of urea during fermentation. Three urease-producing strains were isolated fromDaqu, characterized asStaphylococcussaprophyticus. But addition ofStaphylococcussaprophyticusstrains had no significant effect on urea decrease in the solid-state fermentation, while addition ofLactobacillusreuterior the crude urease thereof eliminated urea in fermented grains. Compared with commercial urease, urease produced byLactobacillusreuterishowed better removal effect for urea in fermented grains with removal rate of 100%. WhenLactobacillusreuteriat a concentration higher than 107CFU/g was added into fermented grains, the removal rate of urea was higher than 97.3%. The removal rate of urea was higher than 77.4% when the amount of crude urease at a concentration higher than 25 U/kg was added into fermented grains. Therefore,Lactobacillusreuterihas better removal effect for urea in white wine fermented grains.

Chinese liquor; ethyl carbamate; urea; urease;Lactobacillusreuteri;Staphylococcussaprophyticus

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013879

碩士研究生(方芳副教授為通訊作者,E-mail:ffang@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(31371821)；廣東省科技計劃項目(2015B020205002)

2017-01-12，改回日期：2017-03-18