楊博文，顏春魯，王 鵬，馬正民，牛彥強

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗實訓(xùn)中心，甘肅 蘭州730000； 3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

·實驗研究·

補腎中藥溫腎強身散對去卵巢大鼠骨代謝和OPG/RANKL平衡的影響*

楊博文1，顏春魯2，王 鵬1，馬正民1，牛彥強3

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗實訓(xùn)中心，甘肅 蘭州730000； 3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

目的：觀察補腎中藥溫腎強身散對去勢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝和OPG/RANK/RANKL含量的影響，探討補腎中藥溫腎強身散治療骨質(zhì)疏松的作用機制。方法：將60只SPF級雌性SD大鼠隨機分為模型對照組，戊酸雌二醇組，溫腎強身散高、中、低劑量組和假手術(shù)組。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠行雙側(cè)卵巢去除術(shù)，假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)處理。戊酸雌二醇組給予雌激素戊酸雌二醇片0.09 μg/g體質(zhì)量灌胃治療，假手術(shù)組和模型對照組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃，溫腎強身散高、中、低劑量組依次給予8，16，32 g/kg溫腎強身散溶液10 μL/g體質(zhì)量灌胃治療，1 d 1次，連續(xù)4周。觀察大鼠的一般狀況，記錄末次給藥體質(zhì)量；檢測血清骨鈣素(osteocalcin，BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)、護骨素(osteoprotegerin ，OPG)、核因子b受體激活劑(receptor activator of nuclear factor κB，RANK )和核因子b配體受體激活劑(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)含量；雙能X骨密度儀分析測定大鼠股骨骨密度(bone mineral density，BMD)；AG-IX生物力學(xué)萬能實驗機檢測斷裂載荷和定伸長-位移。結(jié)果：與假手術(shù)組對比，模型對照組和各干預(yù)組大鼠體質(zhì)量明顯升高，血清trACP、RANK和RANKL含量均明顯升高(P<0.05)；而模型對照組大鼠血清BGP和OPG明顯降低，BMD明顯減少，斷裂載荷和定伸長-位移明顯減少(P<0.05)。與模型對照組相比，溫腎強身散各劑量組血清trACP、RANK和RANKL含量均降低，股骨的骨微觀參數(shù)BMD均得到了良好地修復(fù)，骨生物力學(xué)參數(shù)中斷裂載荷、定伸長-位移得到了明顯修復(fù)(P<0.05)；而溫腎強身散中、高劑量組血清BGP和OPG明顯升高(P<0.05)。結(jié)論：補腎中藥溫腎強身散能夠調(diào)控去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨代謝和股骨的生物力學(xué)性能，可能是通過OPG/RANK/RANKL調(diào)節(jié)軸實現(xiàn)的。

溫腎強身散/藥效學(xué)；骨質(zhì)疏松；骨代謝；OPG/RANK/RANKL；動物；大鼠

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種起病隱匿，以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加、易于骨折的慢性代謝性骨病[1]。性激素分泌減少，鈣調(diào)節(jié)激素分泌失調(diào)，蛋白質(zhì)、鈣、磷、維生素、微量元素攝入不足，戶外運動減少是導(dǎo)致中、老年人易患OP的重要原因[2-3]。如何防治骨質(zhì)疏松成為醫(yī)學(xué)者關(guān)注的焦點。本課題以SD雌性大鼠為實驗對象，采用去卵巢法建立骨質(zhì)疏松癥模型，通過檢測血清骨鈣素(osteocalcin，BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)、護骨素(osteoprotegerin ，OPG)、核因子b受體激活劑(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)、核因子b配體受體激活劑(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)含量，股骨骨密度(bone mineral density，BMD)，斷裂載荷和定伸長-位移變化，進一步探討補腎中藥溫腎強身散在體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松癥的作用機制，為臨床研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級SD雌性大鼠60只，體質(zhì)量(180±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗動物中心提供。實驗動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

溫腎強身散由鐘乳石(精焙)、蛇床子、遠志、鹿茸(細研如磨末)、肉蓯蓉、薯蕷、續(xù)斷(為末)組成。藥材由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供，分別制備成質(zhì)量分數(shù)為 8，16，32 g/kg 的溫腎強身散藥物提取液。戊酸雌二醇片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司產(chǎn)品，批號156A；青霉素，華北制藥股份有限公司，批號F6042103。水合氯醛，天津市光復(fù)精細化工研究所產(chǎn)品，批號20150105； Rat OPG ELISA Kit檢測試劑盒(批號E20151102B)、Rat RANK/RANKL ELISA Kit檢測試劑盒(批號E20151102B)、Rat trACP ELISA Kit檢測試劑盒(批號E20151102B)、Rat BGP ELISA Kit檢測試劑盒(批號E20151201A)，均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。iMark型自動酶標分析儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；FA2004N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；ZY12306型微量加樣器，德國艾本德產(chǎn)品；T6新悅-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產(chǎn)品；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機，湖南平凡科技有限公司產(chǎn)品；雙能X骨密度儀，美國GE公司產(chǎn)品；AG-IX生物力學(xué)萬能實驗機，日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

將60只大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型對照組，戊酸雌二醇組，溫腎強身散高、中、低劑量組6組，每組10只。除假手術(shù)組外，其他各組參照文獻[4-6]方法造模：以40 g/L水合氯醛(3 μg/g)腹腔注射麻醉大鼠；取俯臥位，備皮，消毒手術(shù)區(qū)皮膚；沿背部后正中線作1個1.0～1.5 cm的縱形切口，找到卵巢，沿子宮角處結(jié)扎并切除卵巢，逐層縫合傷口。假手術(shù)組大鼠只切除卵巢周圍脂肪組織。術(shù)后給予青霉素抗感染，注意保溫。造模成功后7 d給予藥物干預(yù)，戊酸雌二醇組給予雌激素戊酸雌二醇片0.09 μg/g體質(zhì)量灌胃，假手術(shù)組和模型對照組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃，溫腎強身散高、中、低劑量組依次給予8，16，32 g/kg溫腎強身散溶液10 μL/g灌胃，每日1次，連續(xù)4周。

1.4 檢測指標

1.4.1 動物一般狀況

每天觀察大鼠精神狀態(tài)，毛發(fā)，活動，飲食飲水，大、小便等,并在末次給藥24 h后記錄各組大鼠體質(zhì)量。

1.4.2 血清BGP、trACP、OPG、RANK、RANKL含量

末次給藥后，腹主動脈采血，靜置2～3 h，1 500 r/min離心10 min，分離血清。檢測各組血清骨代謝相關(guān)生化指標(BPG、trACP)、OPG/RANK/RANKL調(diào)節(jié)系統(tǒng)指標(OPG、RANK、RANKL)含量，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4.3 骨密度

采血結(jié)束后，以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉各組動物，四肢展開平置于雙能X 線吸收測量儀平臺上，通過計算機系統(tǒng)中小動物軟件測定右股骨BMD。

1.4.4 斷裂載荷和定伸長-位移

處死大鼠后取出完整股骨，將其右側(cè)股骨送至蘭州軍區(qū)總醫(yī)院，用AG-IX生物力學(xué)萬能實驗機檢測斷裂載荷和定伸長-位移。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量對比

與假手術(shù)組對比，模型對照組及各藥物組大鼠皮毛欠光滑，其他一般狀況如精神狀態(tài)，活動，飲食飲水，大、小便情況均未見明顯異常。與模型對照組對比，戊酸雌二醇組及溫腎強身散3個劑量組大鼠精神狀態(tài)，活動，飲食飲水，大、小便情況均無差異。與假手術(shù)組對比，模型對照組及各藥物組大鼠體質(zhì)量升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型對照組對比，溫腎強身散3個劑量組和戊酸雌二醇組體質(zhì)量降低，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠末次給藥后體質(zhì)量對比響

注：與假手術(shù)組對比，**P<0.05；與模型對照組對比，#P>0.05。

2.2 各組大鼠血清BGP、trACP含量對比

與假手術(shù)組對比，模型對照組大鼠血清BGP含量降低，trACP含量升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，溫腎強身散中、高劑量組和戊酸雌二醇組血清BGP含量均升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；溫腎強身散3個劑量組和戊酸雌二醇組血清trACP含量均降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清BGP 、trACP 含量對比

注：與假手術(shù)組對比，**P<0.05；與模型對照組對比，##P<0.05。

2.3 各組OPG、RANK、RANKL含量對比

與假手術(shù)組對比，模型對照組大鼠血清OPG含量降低，RANKL和RANK含量均升高, 差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，溫腎強身散中、高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠血清OPG含量升高，溫腎強身散3個劑量組和戊酸雌二醇組大鼠血清RANKL和RANK含量均降低, 差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表 3。

表3 各組OPG、RANK、RANKL含量對比

注：與假手術(shù)組對比，**P<0.05；與模型對照組對比，##P<0.05。

2.4 各組BMD對比

與假手術(shù)組對比，模型對照組大鼠BMD降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，溫腎強身散各劑量組和戊酸雌二醇組BMD均升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠BMD對比

注：與假手術(shù)組對比，**P<0.05；與模型對照組對比，##P<0.05。

2.5 各組斷裂載荷、定伸長-位移參數(shù)對比

與假手術(shù)組對比，模型對照組大鼠股骨生物力學(xué)參數(shù)斷裂載荷、定伸長-位移指標均明顯下降(P<0.05)；溫腎強身散各劑量組和戊酸雌二醇組可明顯改善去卵巢大鼠斷裂載荷、定伸長-位移參數(shù)(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠斷裂載荷、定伸長-位移參數(shù)對比

注：與假手術(shù)組對比，**P<0.05；與模型對照組對比，##P<0.05。

3 討 論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是由于絕經(jīng)期婦女卵巢功能的退化造成機體雌激素水平下降而導(dǎo)致的一種骨代謝失衡病，屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨痹”等范疇。中醫(yī)臨床根據(jù)骨質(zhì)疏松的病因病機，依據(jù)辨證論治將其分為腎陰虛、腎陽虛、脾胃虛弱、氣虛血瘀等型，治法多以補腎、健脾、活血等為主，以補腎中藥多用[7]。敦煌醫(yī)方溫腎強身散有溫補腎陽、填精補髓的作用。方中以鹿茸為君藥，可溫腎陽，益精血，強筋骨；肉蓯蓉溫腎助陽，補益精血，與鹿茸配伍，不但能溫補腎陽，又能填精補髓，此正如《難經(jīng)》所謂“損其腎者，補其精”之意；蛇床子、鐘乳石皆能溫腎助陽，與鹿茸、肉蓯蓉合用，加強溫補腎陽之功；佐以遠志交通心腎，寧心安神；薯芋既能培補后天、助氣血陰陽化生，又能益腎澀精、防止腎精耗散，同時又培補后天，交通心腎；續(xù)斷補肝腎，續(xù)筋骨，調(diào)血脈，可助薯芋氣血化生之功。諸藥合用，重在溫補腎陽，兼能填精益髓。

有研究認為：骨吸收大于骨形成，骨代謝失衡是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要原因[8]。骨組織的骨量、結(jié)構(gòu)、形狀及內(nèi)在的生物力學(xué)性能等指標是判定骨質(zhì)疏松骨性能的重要指標[9]。BMD的測定是目前公認的診斷骨質(zhì)疏松中骨量丟失的金標準[10]。在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展進程中，反映骨吸收與骨形成平衡狀況的骨代謝生化指標會隨之發(fā)生變化。BGP是骨形成的生化指標[11]。trACP反映骨吸收程度，是目前鑒別骨量丟失、診斷骨質(zhì)疏松的可靠指標[12]。已有相關(guān)研究[13-15]證實：中藥對調(diào)節(jié)骨代謝和骨量具有良好效果。本研究結(jié)果也顯示：溫腎強身散能夠提高骨質(zhì)疏松模型大鼠的BGP含量、BMD、斷裂載荷和定伸長-位移。表明：溫腎強身散對骨質(zhì)疏松具有良好的治療效果。

OPG/RANK/RANKL是一個能影響破骨細胞生成、分化、成熟和調(diào)節(jié)骨重建的樞軸旁分泌系統(tǒng)。近年研究[16-17]發(fā)現(xiàn)：OPG作為腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員，與其配體OPGL結(jié)合后，可阻止RANKL與OPGL的結(jié)合，使RANKL活化受阻，不能發(fā)揮破骨作用。李晶等[18]研究發(fā)現(xiàn)：淫羊藿總黃酮能促進去勢大鼠骨組織OPG mRNA表達的表達，使RANKL活化受阻，有效抑制破骨細胞的分化和成熟，減少破骨細胞的增殖及骨吸收，從而對骨質(zhì)疏松起到治療的作用。本研究也證實：溫腎強身散各劑量組能夠有效降低骨質(zhì)疏松大鼠血清RANK和RANKL的含量，中、高劑量組的溫腎強身散能有效升高骨質(zhì)疏松大鼠OPG的含量。說明：溫腎強身散通過上調(diào)成骨細胞OPG 的表達、下調(diào)RANKL和RANK的表達來減少破骨細胞的生成、抑制破骨細胞的活化、降低破骨細胞的骨吸收功能來防治骨質(zhì)疏松癥。

綜上所述，溫腎強身散可能是通過OPG/RANK/RANKL調(diào)節(jié)軸實現(xiàn)對骨質(zhì)疏松骨代謝的調(diào)控作用來達到治療骨質(zhì)疏松癥的目的。

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1001-6910(2017)09-0061-04

R681.1

:B

2017-06-29；

2017-08-03

(編輯 陶 珠)

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.09.26

顏春魯，副教授， yanchl1979@126.com

甘肅省高等學(xué)校科研項目(2015A-097)；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)研究與教學(xué)改革項目(ZH-201606)；甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究重大實驗室開放基金(FZYK15-16-7)