羅彩林，鄭晨娜，，饒華春，楊會(huì)勇

1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建泉州 362000；2.華僑大學(xué)分子藥物研究所，福建泉州 362000；3.泉州市正骨醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，福建泉州 362000

IL-17A與IRF-5遺傳多態(tài)性與泉州地區(qū)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)性研究

羅彩林1，鄭晨娜1，2，饒華春3，楊會(huì)勇2

1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建泉州 362000；2.華僑大學(xué)分子藥物研究所，福建泉州 362000；3.泉州市正骨醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，福建泉州 362000

目的 該文探討白介素-17A（IL-17A）rs8193036C/T、rs2275913A/G與干擾素調(diào)節(jié)因子5（IRF-5）rs729302A/C基因多態(tài)性與福建泉州地區(qū)人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的易感性關(guān)聯(lián)。 方法 采用病例-對照研究法，自2014年3月—2016年4月收集泉州正骨醫(yī)院確診RA患者108例 （病例組）和149名健康對照者 （對照組），應(yīng)用三引物全血擴(kuò)增法 （AS-PCR）對IL-17A rs8193036,rs2275913和IRF-5 rs729302進(jìn)行基因分型，并用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果分析。 結(jié)果RA組RF-陽性率、CRP-陽性率、ACCPA-陽性率分別為：88.89%、28.70%、72.22%，DAS28為（4.86±1.63）。IL-17A rs8193036C/T位點(diǎn)的3個(gè)基因型CC、TT、CT在健康對照組的分布頻率分別為57.0%、16.8%、26.2%，在RA組的分布頻率分別為61.1%、6.5%、32.4%，RA組的基因型頻率與健康對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042）,其中攜帶TT純合子基因型的RA患病風(fēng)險(xiǎn)較高。IL-17A rs2275913 G/A位點(diǎn)的3個(gè)基因型AA、GA、GG在健康對照組的分布頻率分別為23.5%、46.3%、30.2%，在RA組的分布頻率分別為13.0%、52.8%、34.3%，RA組基因型頻率與健康對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.106）。IRF-5 rs729302A/C的AA、AC、CC基因型在健康對照組的分布頻率分別為50.3%、39.6%、10.1%，在RA組的分布頻率分別為47.7%、43.1%、8.3%,兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.781)。結(jié)論 IL-17A rs8193036C/T可能與泉州地區(qū)人群RA發(fā)病有弱相關(guān)性，其中IL-17A rs8193036中TT基因型攜帶者可能增加RA疾病的易感性。而IL-17A rs2275913A/G和IRF-5 rs729302A/C與泉州地區(qū)人群RA發(fā)病無相關(guān)性。

關(guān)節(jié)炎；類風(fēng)濕；多態(tài)性；單核苷酸；白介素-17A；干擾素調(diào)節(jié)因子-5

遺傳因素如單核苷多態(tài)性可能在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用。白介素-17（Interleukin-17，IL-17）是由Th17細(xì)胞分泌的一種致炎癥因子，IL-17A/F基因多態(tài)性與許多自身免疫性疾病以及炎癥反應(yīng)有相關(guān)性。干擾素調(diào)節(jié)因子-5（Interferon Regulatory Factor 5，IRF-5）在細(xì)胞多種生理活動(dòng)中發(fā)揮作用，也在RA發(fā)病過程中起著重要的作用[1-2]。根據(jù)兩個(gè)基因在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用，該研究自2014年3月—2016年4月選取泉州市正骨醫(yī)院已確診的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者108例和在體檢過程中健康志愿者149名作為研究對象，探討了IL-17A rs8193036C/T、rs2275913A/G和IRF-5 rs729302A/C基因多態(tài)性與福建泉州地區(qū)人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的易感性關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步探討泉州地區(qū)人群RA的發(fā)病特征與機(jī)制提供理論支持和數(shù)據(jù)分析。

1 對象與方法

1.1 對象

采用病例-對照法，所選的對象中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者達(dá)到ACR2010 RA分類標(biāo)準(zhǔn)，需要排除所選對象患有其他結(jié)締組織疾病，感染性或者惡性腫瘤等疾病，平均年齡（56±12.29）歲；健康志愿者排除糖尿病、腫瘤、心血管疾病等基礎(chǔ)性疾病，平均年齡在（55±11.69）歲。該研究由泉州市正骨醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)對象知情并同意研究的開展。

1.2 方法

1.2.1 外周血抽取 抽取待測人員的外周血，血液樣本用EDTA、肝素和枸櫞酸鈉等抗凝劑做抗凝處理，抽取的血樣于-20℃冰箱保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 從 ncbi網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲取該SNP位點(diǎn)附近序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)一條公共引物和一對3′端分別與SNP位點(diǎn)互補(bǔ)等位基因特異性引物，其中3′端第3個(gè)堿基引入一個(gè)人為錯(cuò)配堿基。IL-17A基因rs8193036C/T的一條通用引物序列FW 5’-CAGGAC AGGGAGGAATGGAT-3’，兩條特異性引物分別是RN1 5’-TAGAGACTGGACAAAGGTGACGG-3’；RN2 5’-TAGAGACTGGACAAAGGTGACGA-3’。SNP位點(diǎn)rs2275913A/G通用引物RW 5’-TGGATGAGTTTGTGCCTGCT-3’兩條特異性引物分別為FN1 5’-CTTCCCATTTTCCTTCAGACGA-3’；FN2 5’-CTTCCCATTTTCCTTCAGACGG-3’

IRF-5基因rs729302A/C通用引物Fw 5’-GGGCGGCATCGGGAGTGGAG-3’，兩條特異性引物分別為RN1 5’-GACTCTGGTGTGTAGGTGATCGTGT-3’；RN25’-GACTCTGGTGTGTAGGTGATCGTGG-3’。所有引物合成均來自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.3 全血三引物擴(kuò)增法（AS-PCR）采用該課題組建立的三引物全血等位基因特異性PCR擴(kuò)增法（AS-PCR）進(jìn)行目的基因的SNP分型檢測[3]。擴(kuò)增體系如下：20 μL的體系加入0.3 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶（TaKaRa,大連），2 μL 2.5 mM dNTP，10 μmol/L通用引物和特異性引物各0.8 μL，2 μL 10×聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）緩沖液(含有Mg2+)，4 μL 50%甘油以及4 μL 5דYW”緩沖液 （該實(shí)驗(yàn)室研發(fā)），最后無菌H20補(bǔ)足19.6 μL,震蕩混勻離心后加入外周血模板0.6 μL。反應(yīng)體系參數(shù)設(shè)定：預(yù)變性溫度96℃，時(shí)間4 min；變性溫度95℃，時(shí)間30 s，復(fù)性溫度58℃，時(shí)間30 s，延伸溫度72℃，時(shí)間30 s，循環(huán)次數(shù)40；72℃延伸10 min，于4℃條件保存。擴(kuò)增結(jié)束，吸取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠，100 V電壓條件下電泳15 min。采用ExRed核酸染料進(jìn)行染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶的位置和數(shù)目，并分析基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

分析所選擇樣本目的基因各SNP基因型與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)分析；采用網(wǎng)絡(luò)工具進(jìn)行Hardy-Weinberg檢驗(yàn)遺傳平衡 (http://ihg.gsf.de/ihg/snps.html)，健康志愿者和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者組間比較采用χ2檢驗(yàn)和logistic模型分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象特征分析及SNP位點(diǎn)Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)

該文采用病例-對照研究法，其中RA患者年齡范圍從10～89歲，健康對照者年齡范圍從8～78歲，其中RA患者的臨床表現(xiàn)見表1。為了檢驗(yàn)該研究人群是否符合隨機(jī)性抽樣原則，將RA患者組和正常對照組3個(gè)SNPs位點(diǎn)的分布頻率在 http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl網(wǎng)站進(jìn)行 Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)。結(jié)果表明除了 IL-17A rs8193036位點(diǎn)的健康對照組的群體基因遺傳平衡 （P＜0.05）之外，IL-17A rs8193036 RA患者組以及 IL-17A rs2275913A/G和IRF-5 rs729302A/C健康對照組和RA患者組群體基因遺傳平衡（P＞0.05），課件研究對象的選擇符合隨機(jī)性原則，研究對象具有群體代表性。

2.2 病例-對照組3個(gè)等位基因和基因型頻率分布比較

IL-17A rs8193036 C/T、IL-17A rs2275913 G/A和IRF-5 rs729302A/C在正常對照組和RA組基因型及等位基因分布頻率情況見表2。IL-17A rs8193036位點(diǎn)。

CC基因型在健康對照組的分布頻率為57.0%，在RA組為 61.1%，TT基因型在健康對照組的分布頻率為16.8%，在RA組為6.5%，CT基因型在健康對照組的分布頻率為26.2%，在RA組為32.4%，RA組的基因型頻率與健康對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042）,與攜帶CC或CT基因型的研究對象相比，攜帶TT純合子基因型的RA患病風(fēng)險(xiǎn)要高（TT vs.CC：OR,2.773；95%CI,1.130～6.805；P=0.022；TT vs.CC+CT:OR,2.909；95%CI,1.209～7.002；P=0.014）。健康對照組的等位基因C分布頻率為70.1%，RA組為77.3%；健康對照組的等位基因T分布頻率為29.9%，RA組為22.7%。等位基因C型和T型在RA-健康對照組患病風(fēng)險(xiǎn)比較，其OR值是1.451，95%CI為[0.969～2.173]，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.070＞0.05）。

表1 RA患者臨床特征

IL-17A rs2275913 G/A位點(diǎn)AA基因型在健康對照組的分布頻率為23.5%，在RA組為13.0%，GA基因型在健康對照組的分布頻率為46.3%，在RA組為52.8%，GG基因型在健康對照組的分布頻率為30.2%，在RA組為34.3%，該位點(diǎn)RA組的基因型頻率與健康對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.106）,與攜帶GG+GA基因型的患病風(fēng)險(xiǎn)相比較，攜帶AA基因型的患病風(fēng)險(xiǎn)要高 （AA vs. GA：OR,2.065；95%CI,1.013～4.210；P=0.044；AA vs.GG+ GA:OR,2.061；95%CI,1.049～4.058；P=0.034）。健康對照組的等位基因A分布頻率為46.6%，RA組為39.4%；健康對照組的等位基因G分布頻率為53.4%，RA組為60.6%。等位基因A型和G型在RA-健康對照組患病風(fēng)險(xiǎn)比較，其OR值是1.347，95%CI為[0.944～1.922]，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.099 8＞0.05）。

IRF-5 rs729302A/C的AA基因型在健康對照組的分布頻率為50.3%，在RA組為47.7%，AC基因型在健康對照組的分布頻率為39.6%，在RA組為43.1%，CC基因型在健康對照組的分布頻率為10.1%，在RA組為8.3%，該位點(diǎn)兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.781)。健康對照組的等位基因A分布頻率為70.1%，RA組為69.9%；健康對照組的等位基因C分布頻率為29.9%，RA組為30.1%。等位基因A型和C型與RA-健康對照組患病風(fēng)險(xiǎn)比較，其OR值是1.011，95%CI為[0.690～1.481]，亦差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.956，P＞0.05)。說明該位點(diǎn)與泉州地區(qū)人群RA易感性無相關(guān)性。

表2 病例-對照組三個(gè)等位基因和基因型頻率分布比較

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性、自身免疫性疾病，屬于系統(tǒng)性炎癥。在RA發(fā)病發(fā)展的炎癥性細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中，Th17細(xì)胞在促進(jìn)自身免疫性進(jìn)程、骨損傷以及血管生成均起了重要作用。根據(jù)文獻(xiàn)資料選取 IL-17A rs2275913 G/A, rs8193036 C/T與泉州地區(qū)RA患者的相關(guān)性進(jìn)行研究。Nordang等[4]檢測了IL-17A基因多態(tài)性與來自于挪威和新西蘭的高加索RA易感性的相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)IL-17A rs2275913在挪威RA人群呈弱相關(guān)性，然而與新西蘭RA人群無關(guān)聯(lián)性。來自日本的研究報(bào)道IL-17A基因SNP rs3804513與2年內(nèi)RA影像進(jìn)程有弱相關(guān)性 （P=0.049），這說明IL-17在日本人群RA發(fā)病初期與骨關(guān)節(jié)損傷有一定的關(guān)聯(lián)[5]。Bogunia-Kubik等[6]和Pawlik等[7]兩個(gè)不同的研究團(tuán)隊(duì)先后在波蘭RA人群研究中發(fā)現(xiàn)IL-17A基因rs2275913與 RA易感性無關(guān)聯(lián)性，而對 IL-17F基因rs763780與RA人群關(guān)聯(lián)性得出了完全相反的結(jié)論。選取了108例RA患者和149名健康對照者作為研究對象，其中發(fā)現(xiàn)rs8193036C/T位點(diǎn)等位基因頻率患者-健康對照者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042），與RA易感性有弱關(guān)聯(lián)性，其中攜帶TT純合子基因型的RA患病風(fēng)險(xiǎn)要高（TT vs.CC：OR,2.773；95%CI,1.130～6.805；P=0.022；TT vs.CC+CT:OR,2.909；95%CI,1.209～7.002；P=0.014）。Shen等人[8]研究發(fā)現(xiàn)IL-17A rs2275913和rs3819024兩個(gè)位點(diǎn)的等位基因可能會(huì)降低RA風(fēng)險(xiǎn)性。而該研究則發(fā)現(xiàn)攜帶IL-17A rs2275913 AA基因型的人群RA患病風(fēng)險(xiǎn)增高（AA vs.GA：OR,2.065；95%CI,1.013-4.210；P=0.044；AA vs.GG+GA:OR,2.061；95%CI,1.047-4.058；P=0.034），而該位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與健康對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,這可能是該次選取的樣本數(shù)較少緣故或是存在地域性的差異所致。

IRF-5基因位于染色體7q32上，IRF-5的啟動(dòng)區(qū)和5’UTR區(qū)的遺傳多態(tài)性與RA的易感有強(qiáng)相關(guān)性，因此該區(qū)域可用來分析IRF-5的轉(zhuǎn)錄機(jī)制以及與RA的發(fā)病機(jī)理之間的關(guān)系[9]。IRF-5同時(shí)還是一種轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)機(jī)體受到病毒感染時(shí)，IRF-5激活并轉(zhuǎn)錄出IRF-5蛋白，再調(diào)控產(chǎn)生干擾素和其他致炎因子[10]，由此可見IRF-5在致炎細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要作用。IRF-5的SNP位點(diǎn)在不同人群RA患者的相關(guān)性也不盡相同，如rs2004640，rs752637，rs3807306和rs3757385，在無CCP抗體人群中，保護(hù)性基因型分別為AGAC。而IRF-5rs2004640，rs729302和rs752637多態(tài)性與RA易感性在不同的族群相關(guān)性不同，該結(jié)果已在歐洲人和亞洲人群中得到證實(shí)，而其他族群這種關(guān)聯(lián)性需要進(jìn)一步研究。從以上研究結(jié)果可以看出，IRF-5多態(tài)性與RA相關(guān)性依據(jù)人種群不同而不同，甚至在同一種群結(jié)構(gòu)也有差異。該次選取了IRF-5基因rs729302位點(diǎn)作為研究對象，與福建泉州RA人群的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rs729302A/C在健康和RA患者比較，基因型和等位基因均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明該位點(diǎn)與福建泉州人群的RA易感性無相關(guān)性。

綜上所述，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到IL-17A rs8193036C/ T,IL-17A rs2275913G/A和IRF-5 rs729302A/C基因多態(tài)性對福建泉州地區(qū)RA人群的易感性有一定的關(guān)聯(lián)，其中攜帶IL-17A rs8193036的TT基因和rs2275913的AA基因的人群可能屬于風(fēng)險(xiǎn)性較高的人群，而IRF-5 rs729302與該地區(qū)的RA人群無關(guān)聯(lián)性。

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Research on Correlation between the IL-17A and IRF-5 Genetic Polymorphism and Rheumatoid Arthritis in Quanzhou Region

LUO Cai-lin1,ZHENG Chen-na1,2,RAO Hua-chun3,YANG Hui-yong2
1.Basic Medicine Department,Quanzhou Medical College,Quanzhou,Fujian Province,362000 China；2.Institute of Molecular Medicine,Huaqiao University,Quanzhou,Fujian Province,362000 China；3.Department of Clinical Laboratory,Quanzhou Orthopedic-traumatological Hospital,Quanzhou,Fujian Province,362000 China

Arthritis;Rheumatoid;Polymorphism;Mononucleotide;Interleukin-17A;Interferon regulatory factor-5

R446

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.03.04

2017-06-07；

2017-06-27

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2015J01138）;福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2016J01420）。

羅彩林（1981-），女，福建三明人，碩士，講師，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

鄭晨娜（1978-），女，河北滄州人，碩士，副教授，研究方向：醫(yī)學(xué)診斷學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail:chennzh2009@126. com。

AbstractObjective To study the correlation between the interleukin-17A（IL-17A）rs8193036C/T,rs2275913A/G,（IRF-5）rs729302A/ C genetic polymorphism and susceptibility of rheumatoid arthritis in Quanzhou region.Methods 108 cases of RA patients and 149 cases of healthy people in our hospital from March 2014 to April 2016 were selected and respectively used as the case group and control group,and AS-PCR was used for genotyping of IL-17A rs8193036,rs2275913 and IRF-5 rs729302,and the data results were analyzed by the statistical software SPSS 18.0.Results The positive rates of RF,CRP and ACCPA in the RA group were respectively 88.89%,28.70%,72.22%and DAS28 was 4.86±1.63,and the distribution frequencies of three gene types of CC,TT,CT in the IL-17A rs8193036C/T sites in the healthy control group were respectively 57.0%,16.8%,26.2%,and the distribution frequencies in teh RA group were respectivly 61.1%,6.5%,32.4%,and the difference in the gene frequency between the RA group and healthy control group was statistically significnat（P=0.042）,and the prevalence risk of RA with TT homozygote genotype was higher and teh distribution frequencies of the three genetypes AA,GA,GG in the IL-17A rs2275913 G/A sites in the healthy control group were respectively 23.5%,46.3%,30.2%,and the distribution frequencies in the RA group were respectively 13.0%,52.8%,34.3%,and the differences between the two groups were not statistically significant（P=0.106）,and the distribution frequencies of AA,AC,CC of IRF-5 rs729302A/C in the healthy control group were respectively 50.3%,39.6%,10.1%and in the RA group were respectively 47.7%,43.1%,8.3%,and the differences between the two groups were not statistically significant(P=0.781).Conclusion IL-17A rs8193036C/T may have a weak correlation with the RA incidence in population in Quanzhou region,and TT genotype carriers of IL-17A rs8193036 may increase the susceptibility of RA disease,and IL-17A rs2275913A/G and IRF-5 rs729302A/C have no correlation with the RA incidence in population in Quanzhou region.