朱迎萍 吳燕平

自擬宮頸方對宮頸炎模型大鼠宮頸組織VEGF-A、NF-KB表達(dá)的影響

朱迎萍 吳燕平

目的觀察自擬宮頸方對宮頸炎模型大鼠宮頸組織病理及血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、核轉(zhuǎn)錄因子（NF-KB）表達(dá)的影響。方法48只成年雌性大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組12只和實驗組36只，實驗組大鼠給予陰道內(nèi)注入25%苯酚膠漿（0.15mL/只）法建立大鼠宮頸炎動物模型。造模成功的36只大鼠再隨機(jī)分為模型組、外用潰瘍散組和自擬宮頸方組，每組12只。除空白對照組外，其余各組大鼠按0.1mL/0.1kg劑量，模型組大鼠給予蒸餾水膠漿，外用潰瘍散組給予0.05g/mL外用潰瘍散膠漿、自擬宮頸方組給予0.3g/mL自擬宮頸方膠漿，用灌胃針注入大鼠陰道深部，用自制醫(yī)用無菌棉條堵塞陰道，隔天1次，共5次。觀察各組大鼠宮頸形態(tài)及病理改變，蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）檢測大鼠宮頸組織VEGF-A、NF-KB表達(dá)量。結(jié)果自擬宮頸方組、外用潰瘍散組大鼠宮頸炎癥程度較模型組明顯減輕；自擬宮頸方組、外用潰瘍散組大鼠宮頸組織VEGF-A、NF-KB表達(dá)水平顯著低于模型組[VEGF-A：（0.703±0.150）、0.780±0.182）比（1.226± 0.160），P＜0.05；NF-KB：（0.088±0.015）、（0.068±0.008）比（0.183±0.041），P＜0.05]；自擬宮頸方組和外用潰瘍散組大鼠宮頸組織VEGF-A、NF-KB表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義[VEGF-A：（0.703± 0.150）比（0.780±0.182），P＞0.05；NF-KB：（0.088±0.015）比（0.068±0.008），P＞0.05]。結(jié)論自擬宮頸方能明顯改善宮頸炎模型大鼠宮頸炎癥程度，其作用可能與降低大鼠宮頸組織VEGF-A、NF-KB表達(dá)水平有關(guān)。

大鼠；宮頸炎；血管內(nèi)皮生長因子A；核轉(zhuǎn)錄因子

宮頸炎以局部治療為主，西醫(yī)主要采用抗生素同時結(jié)合物理方法輔助治療[1]，但有時因副作用導(dǎo)致患者順應(yīng)性差。中醫(yī)藥具有毒副作用小，標(biāo)本兼治的作用[2]。自擬宮頸方是裘氏婦科創(chuàng)始人、首批國家名老中醫(yī)裘笑梅主任中醫(yī)師的經(jīng)驗方，治療宮頸炎，有良好的臨床療效。本研究觀察其治療宮頸炎的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物48只健康未孕的雌性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物許可證：SCXK（滬）2008-0115。

1.2 實驗藥物苯酚：杭州雙林化工試劑廠，批號20090528。甘油：商丘市亮峰衛(wèi)生用品有限公司，批號131128。黃芪樹膠：上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站，批號811104。自擬宮頸方：明礬、兒茶各30g，冰片1g，碾粉，浙江省中醫(yī)院制劑室提供。外用潰瘍散：（組成：雄黃、寒水石、朱砂、銀朱、石決明、冰片、人工麝香），內(nèi)蒙古蒙藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z15020458，批號1410025。核轉(zhuǎn)錄因子（NF-KB）試劑盒：聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）試劑盒：聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。25%的苯酚膠漿配制∶取液化苯酚5mL，黃芪樹膠1g，甘油4mL，加蒸餾水至20mL，配成25%苯酚膠漿。

2 方法

2.1 造模及分組[3]大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，成年雌性大鼠48只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組12只和實驗組36只。實驗組大鼠按0.15mL/只劑量，采用1mL注射器（針頭為灌胃針頭）向陰道內(nèi)注入25%苯酚膠漿，然后使用自制醫(yī)用無菌棉條堵塞陰道，防止藥液流出，隔天1次，共5次。于末次給藥24h后,四組大鼠各隨機(jī)選取2只，麻醉后解剖取材陰道至子宮角處組織做病理切片，微鏡下觀察子宮頸組織油大量炎性細(xì)胞浸潤提示造模成功。余30只造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、外用潰瘍散組和自擬宮頸方組，每組10只。

2.2 用藥方法根據(jù)臨床給藥，以人體質(zhì)量70kg為標(biāo)準(zhǔn)，按照人體表面積比率換算等效計量法（大鼠用量=成人日用量×0.018）計算大鼠給藥劑量（70kg成人劑量：自擬宮頸方1次3g，外用潰瘍散1次0.5g；大鼠給藥劑量：外用潰瘍散5mg/0.1kg，自擬宮頸方30mg/0.1kg）[3]。各組均用1mL注射器分別吸取蒸餾水膠漿、自擬宮頸方膠漿和外用潰瘍散膠漿等（配制：蒸餾水膠漿：黃芪樹膠0.5g，甘油3mL，加蒸餾水至10mL；自擬宮頸方膠漿：自擬宮頸方3g，黃芪樹膠0.5g，甘油3mL，加蒸餾水至10mL；外用潰瘍散膠漿：外用潰瘍散0.5g，黃芪樹膠0.5g，甘油3mL，加蒸餾水至10mL）。每組各10只大鼠，模型組給予蒸餾水膠漿，外用潰瘍散組給予外用潰瘍散膠漿（0.05g/ mL），自擬宮頸方組給予自擬宮頸方膠漿（0.3g/mL），各組均用1mL注射器取藥，用灌胃針注入陰道深部并予自制醫(yī)用無菌棉條堵塞陰道，隔天1次，0.1mL/ 0.1kg，共12次。

2.3 觀察指標(biāo)實驗期間觀察大鼠的一般情況（活動、飲食、精神狀態(tài)），用藥前后稱大鼠體質(zhì)量,每天觀察并記錄外陰局部及分泌物變化,大鼠陰道口是否干燥,外陰及陰道口黏膜有無充血、紅腫，陰道有無流血。實驗結(jié)束處死各組大鼠，取部分宮頸組織固定、脫水、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察病理變化并記錄。部分宮頸組織收集等量濃度的蛋白，通過對蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育后應(yīng)用Western Blot法檢測VEGF-A、NF-KB蛋白表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示并作圖，計量資料組內(nèi)治療前后比較用配對t檢驗，蛋白質(zhì)免疫印跡多樣本均數(shù)組間比較用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量比較與實驗前比較，實驗結(jié)束后各組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05）。實驗結(jié)束后，與模型組比較，自擬宮頸方組和外用潰瘍散組大鼠體質(zhì)量增加更明顯（P＜0.05），見表1。

3.2 各組大鼠宮頸組織NF-KB、VEGF-A表達(dá)水平比較結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組宮頸組織NF-KB、VEGF-A表達(dá)明顯升高（P均＜0.01）；與模型組比較，自擬宮頸方組和外用潰瘍散組NF-KB、VEGF-A表達(dá)明顯降低（P均＜0.05）；自擬宮頸方組與外用潰瘍散組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、封三圖1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別空白對照組模型組自擬宮頸方組外用潰瘍散組鼠數(shù)10 10 10 10實驗前210.80±6.512 207.80±2.860 210.80±3.360 208.80±6.303實驗結(jié)束276.60±10.234 242.00±2.309* 267.20±21.801*△264.60±15.414*△

表2 各組大鼠宮頸組織NF-KB、VEGF-A表達(dá)水平比較（g，）

表2 各組大鼠宮頸組織NF-KB、VEGF-A表達(dá)水平比較（g，）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05；NF-KB：核轉(zhuǎn)錄因子；VEGF-A：血管內(nèi)皮生長因子

組別空白對照組模型組自擬宮頸方組外用潰瘍散組鼠數(shù)5 5 5 5 NF-KB 0.056±0.036 0.183±0.041* 0.088±0.015△0.068±0.008△VEGF-A 0.584±0.520 1.226±0.160* 0.703±0.150△0.780±0.182△

3.3 各組大鼠宮頸形態(tài)學(xué)改變空白組大鼠陰道口光滑，無異物流出。陰道壁光潔、宮頸口光滑,無紅腫。模型組大鼠陰道口紅腫，部分大鼠有少量膿性分泌物。陰道壁水腫充血明顯，宮頸口充血，重度炎癥樣改變。

3.4 各組大鼠宮頸組織病理變化空白組宮頸組織未見明顯異常（見封三圖2-A、1A）。模型組宮頸黏膜鱗狀上皮細(xì)胞變性、壞死脫落，黏膜及其下固有層充血水腫和炎細(xì)胞浸潤（淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞），內(nèi)仍可見部分膿性滲出物及壞死組織（見封三圖2-B、1B）。自擬宮頸方組：宮頸黏膜鱗狀上皮增生修復(fù)，稍增厚，固有層增生，可見極少量炎性細(xì)胞，內(nèi)未見炎性滲出物和壞死組織（見封三圖2-C、1C）。外用潰瘍散組宮頸部分壞死的宮頸黏膜處有肉芽組織機(jī)化，黏膜上皮化生，固有層有少量炎細(xì)胞浸潤，內(nèi)可見少量炎性滲出物和壞死組織（見封三圖2-D、1D）。部分宮頸黏膜接近正常，未見明顯異常改變。

4 討論

宮頸炎（cervicitis）包括子宮頸陰道部炎癥及子宮頸管黏膜炎癥[4]。宮頸炎（cervicitis）的發(fā)病多為感染性，病理變化主要為炎癥和滲出，血管新生也是炎癥反應(yīng)的重要特征[5-7]。宮頸炎主要表現(xiàn)為陰道分泌物增多，成年女性婦科的發(fā)病率約有90%，其中宮頸病占30%～45%[8]。宮頸炎若診治不恰當(dāng)，很容易上行感染，進(jìn)而影響生育[9]。

研究認(rèn)為，VEGF-A、NF-KB等與宮頸炎的發(fā)病有關(guān)[10]。NF-kB是一種能與免疫蛋白特異結(jié)合的一種多效性核轉(zhuǎn)錄因子，NF-kB屬于Rel蛋白家族成員[11]，一般情況下，主要以異源二聚體或同源形式存在于細(xì)胞漿中，與NF-kB的抑制性蛋白（IkB）結(jié)合而呈非活性狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到病毒，物理創(chuàng)傷等刺激后，導(dǎo)致NF-kB活化，被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，入核后，轉(zhuǎn)錄功能明顯增高，從而啟動和調(diào)控一系列參與炎癥反應(yīng)的炎癥因子基因表達(dá)，參與大部分基因的轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)缺氧，誘導(dǎo)VEGF-A表達(dá)而促使血管生成[12]。

VEGF是NF-kB的下游基因，屬于受體酪氨酸激酶超家族，與血小板來源生長因子和成纖維生長因子同源。VEGF是迄今發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是作用最強(qiáng)、特異性高的血管形成調(diào)控因子,主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜，是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原[13]，分為多個單體，各單體與組織親和力不同，其中VEGF-A不僅能通過調(diào)節(jié)纖溶酶原激活物及其抑制因子，從而促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖還能引起血漿蛋白從血管內(nèi)滲漏到血管外區(qū)域，提高血管通透性的炎癥表現(xiàn)[10]。VEGF-A及NF-kB與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)。近年來，生長因子用于宮頸糜爛的治療已有大量的臨床報道[13-14]，但中藥促進(jìn)宮頸糜爛的愈合的分子作用機(jī)制的研究尚少。

慢性宮頸炎屬中醫(yī)“帶下病”范疇[15]，其病因主要歸于脾虛失運，水濕不化；或腎虛失固，封藏失司；或攝生不慎，外感濕邪侵襲，濕邪郁結(jié)，水濕下注；或素體腎虛或者操勞過度傷腎。病機(jī)在于任帶二脈受損、氣血不暢[16]。治療以清熱解毒、活血化瘀為主[17]，同時須明確局部與全身的關(guān)系，區(qū)分脾虛、腎虛、肝郁、祛除濕熱及濕瘀蘊(yùn)結(jié)[15]，局部治療采用陰道納藥，則宮頸炎癥隨之改善[18]。

外用潰瘍散是由寒水石（涼制）、雄黃、朱砂、銀朱、石決明（煅）、冰片、人工麝香組成的傳統(tǒng)中藥散劑。功效為去腐生肌，收斂，促進(jìn)組織再生修復(fù)，加速糜爛面自然愈合。該藥是不含任何輔料的極細(xì)粉末，與瘡面組織有良好的親和力，藥物附著性好，又可避免使用其他藥物的局部刺激，既能增加組織對缺氧的耐受性，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[19]，局部用藥，能對創(chuàng)面產(chǎn)生抗菌、止血、消腫、促進(jìn)愈合等作用[20]。

“自擬宮頸方”包含明礬、兒茶、冰片三味中藥，方中兒茶活血散瘀，收斂止血生肌，解毒收濕，藥理研究顯示，兒茶有抑菌，抗腫瘤，抗病原體，抗血小板，調(diào)血脂等作用[21]；冰片清熱止痛，瀉火解毒消腫，防腐生肌，有抗病原微生物，抗炎鎮(zhèn)痛等功效，而且還可促進(jìn)其他藥物的吸收，提高藥物的整體療效[22]。明礬有解毒殺蟲，燥濕止癢，可以降低前炎癥因子水平，抗感染，改善機(jī)體免疫狀態(tài)[23]。本研究結(jié)果表明，自擬宮頸方治療宮頸炎大鼠療效與外用潰瘍散相當(dāng)，顯著降低模型大鼠宮頸組織NF-KB、VEGF-A表達(dá)，從而抑制炎癥。

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（收稿：2016-07-29 修回：2017-02-22）

Effect of Self-prescription on the Expression of VEGF-A and NF-κB in Rats with Cervicitis

ZHU Yingping,WU YanpingDepartment of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310018),China

ObjectiveTo investigate the efficacy of self-prescription on the pathological changes of cervical tissues and the expression of vascular endothelial growth factor-A（VEGF-A）and nuclear factor kappaB（NF-κB）in rats with vervicitis.MethodsForty-eight adult female rats were distributed at random to blank control group(12 rats)and experimental group（36 rats）.The rats in the experimental group were injected with 25%phenol slurry（0.15mL per rat）to the vagina to establish the cervicitis model,then randomly divided into model group,Waiyongkuiyangsan group,and self-prescription group,with 12 rats in each group.Except for blank control group,model group was given still water,Waiyongkuiyangsan group was given a thick liquid of Waiyongkuiyangsan（0.05g/mL）, and self-prescription group was given a thick liquid of self-prescribed herbs（0.3g/mL）,all at the dosage of 0.1mL/ 0.1kg.The corresponding drugs were administered via injection into the vagina and the vaginal orifice was blocked with self-made tampons,one treatment every 2 days,for 5 times.After the treatment,the morphology and pathology of the cervix was observed;Western blot analysis was performed to detect the levels of VEGF-A and NF-κB in cervical tissues.ResultsCompared with model group,the inflammation of cervix in self-prescription group and Waiyongkuiyangsan group was reduced and the levels of VEGF-A and NF-κB in cervical tissues were decreased（VEGF-A∶0.703±0.150 and 0.780±0.182 vs 1.226±0.160,P＜0.05;NF-κB∶0.088±0.015 and 0.068±0.088 vs0.183±0.041,P＜0.05）,but no significant difference in VEGF-A and NF-κB was found between self-prescription group and Waiyongkuiyangsan group（VEGF-A∶0.703±0.150 vs 0.780±0.182,P＞0.05;NF-KB∶0.088±0.015 vs 0.068±0.008,P＞0.05）.ConclusionSelf-made prescription for the treatment of cervicitis can attenuate the inflammation of cervix in rats with cervicitis via down-regulating the expression of NF-κB and VEGF in cervical tissues.

rats;cervicitis;nuclear factor kappaB;vascular endothelial growth factor-A

book=752,ebook=21

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科（杭州310018）

朱迎萍，Tel：18268155196；E-mail：zhuyingping_26@126.com