李鵬飛，馮 將，劉 嬡，包細(xì)明，張 益，李 婷，鮮思美,2(.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病研究所，貴陽 550025)

羊口瘡病毒重慶株 F1L基因克隆與生物信息學(xué)分析

李鵬飛1，馮 將1，劉 嬡1，包細(xì)明1，張 益1，李 婷1，鮮思美1,2
(1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病研究所，貴陽 550025)

旨在分析OrfV-CQ株 F1L基因的分子特點(diǎn)，預(yù)測(cè)其編碼蛋白的生物學(xué)功能。對(duì)OrfV-CQ株 F1L基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆及序列測(cè)定，利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件進(jìn)行序列分析并對(duì)其編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、B細(xì)胞表位、T細(xì)胞表位、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，OrfV-CQ株 F1L基因長(zhǎng)1 023 bp，編碼340 個(gè)氨基酸，與Shanxi株 F1L基因的核苷酸和氨基酸同源性分別為98.4%和95.0%。OrfV-CQ 株 F1L基因編碼蛋白的α-螺旋、β-片層、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲分別為11.21%、10.3%、2.73%、75.76%；可能存在5 個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，3 個(gè)CTL表位，4 個(gè)Th細(xì)胞表位，無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。

羊口瘡病毒； F1L基因；克隆；生物信息學(xué)分析

羊口瘡(Orf)是由羊傳染性膿皰病毒(Orf virus，OrfV)引起的一種接觸性、傳染性、嗜上皮性人畜共患傳染病[1]，其主要特征病變?yōu)槠つw、口唇、鼻部和口腔黏膜等處形成增生性皮膚損傷，多發(fā)于6 月齡內(nèi)的羔羊[2]。OrfV粒子長(zhǎng)200～350 nm，寬140～220 nm，基因組長(zhǎng)度為130～150 kb，不同毒株基因組長(zhǎng)度有10～25 kb的差異[3]。 F1L基因位于OrfV的第59 個(gè)開放閱讀框，編碼的39 ku蛋白是表面微管的重要組成，該蛋白與病毒吸附、侵入宿主細(xì)胞及病毒成熟有關(guān)，還可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體并介導(dǎo)細(xì)胞免疫[4-5]。本研究采用PCR技術(shù)擴(kuò)增羊口瘡病毒重慶分離株(OrfV-CQ) F1L基因，進(jìn)行序列測(cè)定后，采用在線程序和生物信息學(xué)分析軟件對(duì)其核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)，為重慶地區(qū)羊口瘡的防治、OrfV的遺傳變異研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

OrfV-CQ株、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體均由貴州省動(dòng)物疫病研究所保存；T4DNA連接酶、PCR反應(yīng)試劑、限制性內(nèi)切酶NotⅠ和EcoRⅠ、DL 2000 DNA Marker 購自TaKaRa公司；2×TaqPCR Master Mix、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA病毒基因組提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的OrfV標(biāo)準(zhǔn)序列(No.AY040083)，設(shè)計(jì)合成1 對(duì)引物用于擴(kuò)增 F1L基因，F(xiàn)：5′-CCGGAATTCATGGATCCACCCGAAAT-3′(EcoRⅠ)；R：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCACACGATGGCCGTGAC-3′(NotⅠ)，劃線部分為酶切位點(diǎn)，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 023 bp。

1.3 F1L基因的克隆與鑒定

使用DNA病毒基因組提取試劑盒提取痂皮組織 DNA。以提取的 DNA為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。使用膠回收試劑盒回收并純化目的片段，連接至 pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞。培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，經(jīng) PCR和雙酶切鑒定后，陽性重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.4 序列分析

采用NCBI的BLAST對(duì)比驗(yàn)證所測(cè)序列，并使用在線程序和生物信息學(xué)分析軟件對(duì)所測(cè)核苷酸序列與選取的參考序列進(jìn)行比對(duì)和生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FlL基因的PCR擴(kuò)增與克隆鑒定

以提取的病毒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)約1 023 bp的片段(圖1)。用設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 023 bp的特異性片段(圖2)。經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，得到2 條條帶，即載體帶和目的條帶(圖3)。經(jīng)測(cè)序證實(shí)目的基因正確插入到pMD18-T載體中。

M.DNA Marker；1.羊口瘡病毒 OrfV

2.2 序列及遺傳進(jìn)化分析

經(jīng)測(cè)序拼接后得到OrfV-CQ株 F1L基因長(zhǎng)度為1 023 bp，使用DNAStar推導(dǎo)其編碼340個(gè)氨基酸(圖4)。應(yīng)用DNAStar將OrfV-CQ株 F1L序列與GenBank中收錄的17株OrfV F1L基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，核苷酸序列同源性為93.8%～98.4%(圖5)，氨基酸同源性為11.5%～95.0%(圖6)，其與Shanxi株(No：HQ221964)的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸的同源性分別為95.0%和98.4% 。依據(jù)OrfV F1L基因核苷酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹(圖7)，OrfV-CQ株與國內(nèi)毒株中Shanxi株的親緣關(guān)系最近，與Jinlin株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；與國外毒株中SA00株的親緣關(guān)系最近，與OV-Torino的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

M.DNA Marker；1.pMD18-T- F1L重組質(zhì)粒 Recombinant plasmid of pMD18-T- F1L

圖2重組質(zhì)粒PCR鑒定
Fig.2IdentificationofrecombinantplasmidbyPCR

M. DNA Marke；1.pMD18-T- F1L重組質(zhì)粒 Recombinant plasmid of pMD18-T- F1L

圖3重組質(zhì)粒雙酶切鑒定
Fig.3Doubleenzymedigestionofrecombinantplasmid

圖4 OrfV-CQ株 F1L基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.4 Nucleotide sequence and derived amino acid sequences of F1L gene of OrfV-CQ strain

圖5 OrfV-CQ株 F1L基因的核苷酸同源性分析Fig.5 Nuccleotide homology analysis of F1L gene of OrfV-CQ

圖6 OrfV-CQ株 F1L基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸同源性分析Fig.6 Amino acaid homology analysis of F1L gene of OrfV-CQ

2.3OrfV-CQ株F1L基因編碼蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

2.3.1 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用SOPMA在線服務(wù)器進(jìn)行OrfV-CQ株 F1L基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖8)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋(h，11.21%)、β-轉(zhuǎn)角(t，2.73%)、β-片層(e，10.3%)和無規(guī)則卷曲(c，75.76%) 4種類型。

2.3.2 B細(xì)胞表位多參數(shù)分析 使用DNAStar程序設(shè)置高于閾值的氨基酸殘基作為參考區(qū)域，對(duì)OrfV-CQ株 F1L基因編碼蛋白B細(xì)胞表位各參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖9)，該基因編碼蛋白在15～320位氨基酸區(qū)域具有較好的親水性；在20～305位氨基酸區(qū)域具有較好的柔韌性，其柔韌性分布較平均；抗原性及表面可及性較高；310位氨基酸以后，各類B細(xì)胞表位參數(shù)為負(fù)值，故C端的肽段各參數(shù)優(yōu)勢(shì)較低。

2.3.3 B細(xì)胞抗原表位綜合分析 根據(jù)B細(xì)胞表位多參數(shù)綜合分析，OrfV-CQ株 F1L蛋白可能存在優(yōu)勢(shì)抗原表位的各肽段區(qū)域如表1所示。

2.4OrfV-CQ株F1L基因編碼蛋白的T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

2.4.1 CTL表位預(yù)測(cè) 使用nHLAPred 在線程序，將閾值設(shè)置為0.5，分別對(duì)HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0201、HLA-A*0202 、HLA-A*0203和HLA-A*0205 5種不同分子結(jié)合肽進(jìn)行預(yù)測(cè)(表2)，36～40位的SLNPH、41～44位的LLPL和332～340位的ALIGPVTAI為OrfV-CQ F1L蛋白的CTL表位。

圖7 OrfV-CQ株 F1L基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of F1L gene of OrfV-CQ on nucleotide sequence

圖8 OrfV-CQ株F1L蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 Secondary structure prediction of OrfV-CQ F1L protein

圖9 OrfV-CQ F1L蛋白B細(xì)胞表位參數(shù)預(yù)測(cè)Fig.9 Bcell epitopes prediction for F1L protein of OrfV-GZ by the DNAStar software

2.4.2 Th表位預(yù)測(cè) 使用ProPred在線程序分別對(duì)DRB1-0101、DRB1-0102、DRB1-0301 3種不同Th表位類型進(jìn)行預(yù)測(cè)(表3)，44～49位的LLRQRL、61～69位的LRRHPSHLL、122～130位的YRPALSPPS和273～281位的WRASGPAPS為OrfV-CQ F1L蛋白的Th表位。

表1 應(yīng)用不同參數(shù)預(yù)測(cè)OrfV-CQ F1L蛋白抗原表位的肽段位置Table 1 Prediction results of epitopes of OrfV-CQ F1L protein with different parameter

表2 OrfV-CQ F1L CTL表位預(yù)測(cè)Table 2 Prediction for CTL epitopes of OrfV-CQ F1L

表3 OrfV-CQ F1L Th表位預(yù)測(cè)Table 3 Prediction for cell epitopes of OrfV-CQ F1L

2.5 OrfV-CQ株 F1L蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

采用NCBI上的CDART工具分析OrfV-CQ株 F1L蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(圖10)。結(jié)果顯示該蛋白無保守結(jié)構(gòu)域。

2.6 OrfV-CQ株 F1L蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用TMHMM 2.0 Server在線軟件預(yù)測(cè)OrfV-CQ株 F1L蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域(圖11)。結(jié)果顯示該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.7 OrfV-CQ株 F1L蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

采用SignalP 4.1在線軟件預(yù)測(cè)OrfV-CQ株 F1L蛋白的信號(hào)肽(圖12)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號(hào)肽，即為非分泌蛋白。

圖10 OrfV-CQ F1L蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.10 Conserved domains analysis of F1L protein of OrfV-CQ

圖11 OrfV-CQ株 F1L 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.11 Prediction of transmembrance domains of F1L protein of OrfV-CQ

圖12 OrfV-CQ株 F1L蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.12 Signal peptide analysis of F1L protein of OrfV-CQ

3 討 論

3.1 OrfV F1L基因的長(zhǎng)度分析

本研究結(jié)果表明，OrfV-CQ株 F1L基因序列長(zhǎng)1 023 bp，DNAStar推導(dǎo)其編碼340個(gè)氨基酸。與GenBank登錄的17株 F1L基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)、不同宿主的OrfV F1L基因長(zhǎng)度存在變異性[6-7]。其中，與重慶毗鄰的OrfV貴州分離株(OrfV-GZ株) F1L基因?yàn)? 029 bp[8]，OrfV F1L基因存在的長(zhǎng)度變異性可能與病毒的適應(yīng)性相關(guān)，但目前未見相關(guān)報(bào)道。

3.2 OrfV-CQ株 F1L基因同源性分析

本研究發(fā)現(xiàn)，不同毒株 F1L基因的同源性較高，但存在不同的堿基改變或缺失。OrfV-CQ株 F1L基因與參考序列的核苷酸同源性為93.8%～98.4%，其他研究人員分析各地的 F1L基因核苷酸序列也高度同源[9-10]。OrfV-CQ株 F1L基因編碼的氨基酸與Shanxi株的同源性為95.0%，但與其他16株OrfV F1L的氨基酸同源性較低，為11.5%～12.4%。編碼氨基酸同源性較低的原因，可能是在進(jìn)化過程中堿基的缺失或變異，從而導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)出現(xiàn)較大變異。

3.3 OrfV-CQ 株 F1L蛋白的生物信息學(xué)分析

本研究通過在線程序和生物學(xué)軟件對(duì)OrfV-CQ 株 F1L基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽及可能存在的T、B淋巴細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明，α-螺旋和β-片層占21.51%，二者化學(xué)鍵能較高，存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部且不易變形，有利于維持病毒囊膜蛋白的穩(wěn)定性，但難與抗體結(jié)合，故不利于抗原表位的形成；β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲占78.49%，二者的結(jié)構(gòu)常盤旋、扭曲并在蛋白表面展示，對(duì)抗體結(jié)合和B細(xì)胞抗原表位形成有利，因此這些區(qū)域常含有B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位[11]。本研究綜合二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、柔韌性和抗原性等參數(shù)預(yù)測(cè)OrfV-CQ株 F1L基因編碼蛋白可能存在的5個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位，分別可能存在于49～50、90～92、170～190、195～197、288～289。

CTL表位能夠被T細(xì)胞抗原受體(TCR)特異性識(shí)別，它是可以與MHC-I類分子結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)相應(yīng)的CTL發(fā)生免疫應(yīng)答的一類短肽，一般由8～10個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基構(gòu)成，活化并決定CTL的特異性殺傷效應(yīng)[12]。本研究使用nHLAPred在線程序?qū)TL表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，OrfV-CQ F1L蛋白上有3個(gè)CTL表位，分別是36～40位的SLNPH、41～44位的LLPL和332～340位的ALIGPVTAI。這些CTL表位與MHC-I類分子結(jié)合形成復(fù)合物呈遞至CTL細(xì)胞以激活其細(xì)胞毒作用。

Th細(xì)胞表位是通過識(shí)別、加工外源蛋白，從而使外源蛋白與MHC-II類分子結(jié)合的一類抗原表位(外源性抗原T細(xì)胞表位)。本研究利用ProPred在線程序?qū)h表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，OrfV-CQ F1L蛋白上有4個(gè)Th表位，分別是44～49位的LLRQRL、61～69位的LRRHPSHLL、122～130位的YRPALSPPS和273～281位的WRASGPAPS。這些Th表位與MHC-II類分子結(jié)合后，被抗原遞呈細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面與Th細(xì)胞受體結(jié)合，從而對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行協(xié)調(diào)[13]。

綜合保守結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，OrfV-CQ株 F1L基因編碼蛋白沒有保守結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。而吉艷紅等[14]報(bào)道預(yù)測(cè) F1L基因序列無跨膜區(qū)和信號(hào)肽；李瑞芳等[15]研究發(fā)現(xiàn)OrfV-shz株 F1L基因編碼的氨基酸序列第1～70位存在信號(hào)肽，第285～313位存在跨膜區(qū)。這些差異的存在可能是由于不同毒株中堿基改變或缺失引起，有待進(jìn)一步研究。

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CloningandBioinformaticAnalysisofF1LGeneinChongqingOrfVirus

LI Pengfei1,FENG Jiang1,LIU Ai1,BAO Ximing1,ZHANG Yi1,LI Ting1and XIAN Simei1,2
(1.College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China；2.Institute of Animal Disease,Guizhou Province,Guiyang 550025,China)

In order to analyze the F1L gene of Orf virus in Chongqing (OrfV-CQ) and predict the function of its derived protein. The F1L gene was amplified,cloned and sequenced by PCR,and the secondary structure,B-cell preponderant epitope,T-cell preponderant epitope,conserved domains analysis,transmembrance domain and signal peptide of its derived protein were predicted by the bioinformatics softwares. The results indicated that the F1L gene of OrfV-CQ was at the length of 1 023 bp,which encoded 340 amino acids and shared the 98.4% and 95.0% at the consistency of nucleotide sequence and amino acid sequence with Shanxi strain,respectively. The proportion of the alpha helix in the protein encoded by F1L gene of OrfV-CQ was 11.21%,β-turn was 2.73%,andom coils was 75.76% andβ-sheet was 10.3%.The protein may exist 5 B-cell epitopes,3 CTL epitopes and 4 Th epitopes,no transmembrance domains and signal pepide were found.

Orf virus(OrfV)； F1L gene；Clone；Bioinformatics analysis

2016-09-07

2016-11-02

Science and Technology Department of Guizhou Privince [No.LH(2014)7667]；Science and Technology Innovation Talents Team of Animal Disease Prevention and Control and Veterinary Public Health Security of Guizhou Privince[No. (2015)4016].

LI Pengfei,male,master student. Research area:preventive veterinary medicine.E-mail:lpf0405@yeah.net

S855.3

A

1004-1389(2017)09-1281-08

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsibleeditor:GUYulan)

日期：2017-09-12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170912.1740.006.html

2016-09-07

2016-11-02

貴州省科學(xué)技術(shù)基金[LH(2014)7667]；貴州省動(dòng)物疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生保障科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)[(2015) 4016]。

李鵬飛，男，碩士研究生，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：lpf0405@yeah.net

鮮思美，女，副教授，博士，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：xiansimei@163.com

CorrespondingauthorXIAN Simei,female,associate professor,Ph.D.Research area:preventive veterinary medicine.E-mail:xiansimei@163.com