王嘉麟 邢 佳 賀立娟 朱曉晨 王椿野 王 蕊 鄭建穎 張 迎 李秋祥 崔洪志 秦裕駒 符海燕 高 維 郭 曉 袁清潔 高東陽(yáng) 郭凱航 王建偉 王玉來(lái) 郭蓉娟

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京，100078)

益氣活血藥物對(duì)腦梗死恢復(fù)期大鼠c-fos基因表達(dá)的影響

王嘉麟 邢 佳 賀立娟 朱曉晨 王椿野 王 蕊 鄭建穎 張 迎 李秋祥 崔洪志 秦裕駒 符海燕 高 維 郭 曉 袁清潔 高東陽(yáng) 郭凱航 王建偉 王玉來(lái) 郭蓉娟

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京，100078)

目的：基于c-fos mRNA觀察益氣活血藥物對(duì)腦梗死恢復(fù)期大鼠的影響。方法：以Longa的方法略作改良制作大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞模型，按照隨機(jī)數(shù)字表的方法隨機(jī)分為正常組、模型組、假手術(shù)組、益氣組、活血組、益氣活血組、ERK抑制劑7組，采用RT-PCR技術(shù)，在治療28 d觀察益氣活血藥物對(duì)腦梗死恢復(fù)期大鼠梗死皮層c-fos mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：在治療28 d后，模型組較正常組c-fos mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)，益氣活血組與ERK抑制組較模型組有一定程度提高(P<0.05)，活血組與模型組比較，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，益氣組的c-fos mRNA表達(dá)低于其他各組(P<0.05)。結(jié)論：在腦梗死恢復(fù)期，益氣活血藥物在一定程度上可改善腦缺血，優(yōu)于單純益氣與單純活血，其療效機(jī)制可能與提高c-fos mRNA的表達(dá)有關(guān)。

腦梗死；c-fos；益氣活血

腦梗死是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)難治性疾病，尋求有效的防治方法一直是腦梗死研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。益氣活血中藥在腦梗死恢復(fù)期的治療中起到重要價(jià)值，然而其療效的分子機(jī)制尚不清楚，為此設(shè)立本研究。通過(guò)比較單純益氣及單純活血藥物，于梗死28 d觀察益氣活血藥物對(duì)腦梗死恢復(fù)期大鼠的c-fos基因的影響，從分子生物學(xué)水平揭示益氣活血藥物治療腦梗死恢復(fù)期的療效機(jī)制，為益氣活血藥物治療腦梗死恢復(fù)期的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)Wistar大鼠42只，體重(207～238)g，平均(219.84±6.72)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2015-0001。飼養(yǎng)在SPF環(huán)境下，術(shù)前12 h禁食，不禁水。

1.1.2 藥物 活血藥：注射用血栓通(凍干)(三七總皂苷)(廣西梧州制藥集團(tuán)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025652，生產(chǎn)批號(hào)：14052406)。益氣藥：黃芪注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z33020179，生產(chǎn)批號(hào)：1409051)。益氣活血藥：注射用血栓通(凍干)+黃芪注射液。ERK抑制劑：U0126(Sigma)。

1.1.3 試劑與儀器 1)試劑：TRNzol總RNA提取試劑(北京天根生化科技有限公司)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)、SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)，ROX plus(TaKaRa公司)、DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)、引物合成(Invitrogen)。2)主要儀器：渦旋振蕩儀(QL-902)(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、離心機(jī)(Centrifuge 5415D)(Eppendorf)、分光光度計(jì)(NANODROP 2000)(Therno scientific)、熒光定量PCR儀(ABI7500)(Applied Biosystems)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1)分組：按照隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠分為7組：正常組、假手術(shù)組、模型組、ERK抑制組、單純活血組、單純益氣組、益氣活血組，每組6只，由于本研究觀察時(shí)點(diǎn)較長(zhǎng)，部分大鼠因進(jìn)食困難等因素而死亡，因此，每組實(shí)際完成研究的例數(shù)為3只。2)模型制備方法：以Longa的方法略作改良，制作線栓阻塞大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈模型，同時(shí)按照Bederson評(píng)分觀察術(shù)后動(dòng)物的神經(jīng)癥狀和體征[1]。

1.2.2 給藥方法 各組均在腦梗死造模后開(kāi)始給藥。中藥各組給予相應(yīng)中藥注射劑腹腔注射，1次/d，連續(xù)給藥28 d，其中活血組給予血栓通注射液0.45 g/(kg·d)(配比濃度0.03 g/mL，平均給藥3.3 mL)，1次/d，益氣組給予黃芪注射液60 g/(kg·d)(配比濃度2 g/mL，平均給藥6.6 mL)，1次/d，益氣活血組給予黃芪注射液聯(lián)合血栓通注射液，1次/d，劑量同上2組。假手術(shù)組與模型組給藥時(shí)間和途徑同中藥組，以蒸餾水代替藥液。ERK抑制組：予ERK抑制劑U1026腹腔注射(0.1 mg/(kg·d)，1次/d)(配比濃度0.01 mg/mL，平均給藥2.2 mL)

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)檢測(cè)指標(biāo)：各組大鼠梗死皮層的c-fos mRNA的表達(dá)；2)檢測(cè)方法：RT-PCR法檢測(cè)，引物在北京Invitrogen公司合成，c-fos上游引物序列CCGAAGGGAAAGGAATAAGATG，c-Fos下游引物序列GGGCTGCCAAAATAAACTCC，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大小173bp；內(nèi)參GAPDH上游引物序列CCTTCCGTGTTCCTACCCC，GAPDH下游引物序列GCCCAGGATGCCCTTTAGTG，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大小131 bp。采用通用方法[2]提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄cDNA、RT-PCR擴(kuò)增及檢測(cè)。按照2-△△ct相對(duì)定量計(jì)算公式:

F=2[(待測(cè)目的基因平均Ct值-待測(cè)組管家基金平均Ct值)-(對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組管家基因平均Ct值)]

計(jì)算出相對(duì)于對(duì)照樣品，各組目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入excel數(shù)據(jù)庫(kù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，采用SPSS 20.0軟件作統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組一般情況觀察 造模前，各組大鼠健康狀況相同；毛色光亮、順滑；行動(dòng)、飲食、飲水、排泄均正常。造模后，各組大鼠在蘇醒后即刻觀察，其中假手術(shù)組大鼠一般狀況可，毛色光亮，受傷口影響，行動(dòng)緩慢，進(jìn)食、飲水、排泄正常。而模型組等其他各組大鼠一般狀況較差，形體消瘦，進(jìn)食量明顯減少，毛色黃暗，被毛不順滑，出現(xiàn)右側(cè)肢體偏癱、轉(zhuǎn)圈、不能直立，身體向右側(cè)傾倒，或者在原地向右側(cè)轉(zhuǎn)圈、追尾等，評(píng)分在1～3分，不能自主到食盒內(nèi)采食，不能自主飲水，需要人為輔助喂食喂水。給藥28 d后，中藥各組、ERK抑制組大鼠偏癱癥狀均好于模型組。

2.2 各組腦梗死恢復(fù)期大鼠c-fos mRNA表達(dá)比較(RT-PCR法)以正常組的平均△CT值4.445作為對(duì)照樣本，治療28 d后，c-fos mRNA表達(dá)趨勢(shì)：正常組與假手術(shù)組>抑制組與益氣活血組>模型組與活血組>益氣組，即模型組較正常組c-fos mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)，益氣活血組與ERK抑制組較模型組有一定程度提高(P<0.05)，活血組與模型組比較，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，益氣組的c-fos mRNA表達(dá)低于其他各組，提示益氣活血藥物在一定程度上可提高c-fos mRNA的表達(dá)，好于單純益氣及單純活血，與ERK抑制組的療效大致相當(dāng)，但仍未恢復(fù)至正常。見(jiàn)表1。

表1 各組對(duì)腦梗死恢復(fù)期大鼠c-fos mRNA表達(dá)的影響比較(n=3)

3討論

腦梗死是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，許多患者在急性期過(guò)后，常常留有肢體癱瘓、言語(yǔ)障礙、吞咽困難、二便失控、生活難以自理等癥狀，這給患者帶來(lái)極大的痛苦及悲觀情緒，甚至喪失生活信心，針對(duì)腦梗死具有較高的致殘率和復(fù)發(fā)率，探討腦梗死恢復(fù)期有效的治法，促進(jìn)腦梗死患者的康復(fù)，提高其生命質(zhì)量，顯得非常重要。腦梗死屬于中醫(yī)“中風(fēng)病”范疇，病理性質(zhì)屬本虛標(biāo)實(shí)，急性期多以痰、瘀實(shí)證的表現(xiàn)為主，而恢復(fù)期則多表現(xiàn)為虛(氣虛、陰虛)、瘀，益氣活血法成為重要治法，王清任創(chuàng)立了中風(fēng)病氣虛血瘀理論，他在《醫(yī)林改錯(cuò)》中說(shuō)：“半身不遂，虧損元?dú)?，是其本源”“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無(wú)氣，必停留而瘀”，提示臟腑氣血的運(yùn)行均有賴于元?dú)獾耐苿?dòng)，氣無(wú)則血無(wú)以依附。久病或臟腑衰竭，造成元?dú)馓撊?，氣虛鼓?dòng)無(wú)力，不能帥氣正常運(yùn)行于脈中，而變成瘀血。采用益氣活血代表方劑——補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)偏癱，至今仍有很高的立論和臨床指導(dǎo)意義，備受后世醫(yī)家推崇。益氣活血法成為腦梗死恢復(fù)期的經(jīng)典治法，大量研究證實(shí)其有效性[3-4]。

益氣活血中藥治療腦梗死有確切療效，但是其療效機(jī)制非常復(fù)雜，這與腦梗死病理機(jī)制龐雜以及中藥本身具有多水平、多通道、多靶點(diǎn)的效應(yīng)有關(guān)。例如，益氣活血法可促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠的血管新生，改善腦循環(huán)[5]，參與調(diào)節(jié)Notch通路[6]及Wnt信號(hào)通路[7]，其中黃芪注射液[8]還可使腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)。絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinases，MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的至關(guān)重要的蛋白激酶。研究證實(shí)，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)到通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)的過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用。MAPK可分為3個(gè)主要的亞群，即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK)，應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)和p38MAPK。其中，ERK1/2在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起主要作用。ERK1/2由2種同工異構(gòu)體組成，分別為ERK1和ERK2，兩者在體外有相同的作用底物，兩者在功能上的重疊?；罨腅RK形成二聚體，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，磷酸化其他轉(zhuǎn)錄因子如癌基因c-fos、c-jun等而調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、存活、分化、凋亡、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激等。c-fos是ERK下游的轉(zhuǎn)錄因子之一，正常情況下，在神經(jīng)元中呈極低水平表達(dá)，但其作為細(xì)胞核的“第三信使”，通過(guò)啟動(dòng)和調(diào)控某些具有特殊功能意義的靶基因的表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化、再生和重塑起著舉足輕重的作用。研究發(fā)現(xiàn)，c-fos的表達(dá)與腦缺血缺氧后神經(jīng)元的信息傳遞、凋亡密切相關(guān)。腦缺血缺氧后即快速而短暫的誘導(dǎo)表達(dá)。c-fos的表達(dá)參與了腦缺血耐受,是腦缺血耐受的保護(hù)機(jī)制之一。c-fos蛋白的積累說(shuō)明缺血后神經(jīng)元蛋白質(zhì)合成能力的快速恢復(fù)，并可能在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中起到重要作用[9-10]。也有學(xué)者認(rèn)為c-fos參與腦缺血的損傷[11-15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在治療28 d時(shí)，模型組的c-fos mRNA表達(dá)量較正常組明顯下降，而經(jīng)過(guò)益氣活血藥物治療后，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(見(jiàn)表1)，這提示在腦梗死恢復(fù)期中，c-fos本身參與腦缺血的保護(hù)作用，這與部分學(xué)者[16]的結(jié)果相一致，益氣活血藥物的療效機(jī)制之一是提高c-fos mRNA的表達(dá)。

本研究的不足之處，每組樣本量較小，需要在今后的實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，不妥之處望同行指正。

[1]王嘉麟，劉雪梅，邢佳，等.基于火毒病機(jī)研究急性腦梗死重癥大鼠皮層的核轉(zhuǎn)錄因子κB、c-fos蛋白表達(dá)及中藥干預(yù)效應(yīng)[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2014，7(1)：6-11.

[2]方肇勤.分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用[M].2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2008，110-112.

[3]王成太.益氣活血法治療缺血性腦卒中恢復(fù)期患者的臨床療效及對(duì)hs-CRP、Fg、HCY水平的影響[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2016，20(3)：28-31.

[4]紀(jì)永勝.益氣活血通絡(luò)湯治療缺血性腦中風(fēng)療效觀察[J].中醫(yī)臨床研究，2016，8(9)：42-43.

[5]明康文，胡麗竹.益氣活血法對(duì)急性腦梗死大鼠側(cè)支循環(huán)重建影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，18(4)：17-19.

[6]徐偉，胡建鵬，王鍵，等.益氣活血方和補(bǔ)腎益髓方對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠Ctnnb1和Krt1基因及其蛋白表達(dá)的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37(2)：112-115.

[7]俞麗華，胡建鵬，王鍵，等.兩種中藥復(fù)方對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠額頂葉皮層LRP5和β-Catenin表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16(4)：17-20.

[8]孫麗，劉英北，王嶺，等.黃芪注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后BDNF表達(dá)的影響[J].世界中醫(yī)藥，2016，11(4)：686-689.

[9]張小喬，梅元武，劉傳玉.經(jīng)顱磁刺激對(duì)腦梗死大鼠皮質(zhì)c-Fos和BDNF表達(dá)的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2006，28(2)：86-89.

[10]薛占霞，高永山，沈麗霞.大黃酚對(duì)小鼠腦皮層c-fos和c-jun mRNA表達(dá)的影響及與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2015，38(4)：375-379.

[11]曹澤標(biāo)，陳昱文，劉旺華，等.丹龍醒腦方對(duì)腦缺血再灌注大鼠半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡與即早基因表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36(4)：1-5.

[12]陳江君，陳軍，魯雅琴，等.大鼠腦缺血再灌注c-fos表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡關(guān)系研究[J].衛(wèi)生職業(yè)教育，2014，32(6)：89-90.

[13]陳衍晨，趙丹，卿娣，等.缺氧再灌注斑馬魚胚胎腦部細(xì)胞凋亡及c-fos基因的表達(dá)[J].中國(guó)組織工程研究，2013，17(37)：6613-6619.

[14]毛曉霞，夏愛(ài)華，吳曉光，等.山楂葉總黃酮對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)元凋亡和c-fos，c-jun表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21(2)：174-177.

[15]李凱，張平，周杰.益氣活血補(bǔ)腎方對(duì)大鼠腦缺血損傷后c-Fos、c-Jun表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，10(1)：27-29,58.

[16]顏玲，黃德斌.黃芪多糖對(duì)缺血腦損傷大鼠海馬神經(jīng)遞質(zhì)及c-fos mRNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2012，28(2)：263-268.

(2016-09-13收稿 責(zé)任編輯：徐穎)

EffectofSupplementingQiandActivatingBloodCirculationDrugsonC-FosMrnaofRatswithCerebralInfarction

Wang Jialin，Xing Jia，He Lijuan，Zhu Xiaochen，Wang Chunye，Wang Rui，Zheng Jianying，Zhang Ying，Li Qiuxiang， Cui Hongzhi，Qin Yuju，F(xiàn)u Haiyan， Gao Wei，Guo Xiao，Yuan Qingjie，Gao Dongyang，Guo Kaihang， Wang Jianwei，Wang Yulai，Guo Rongjuan

(DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China)

Objective:To observe the expression of c-fos mRNA of rats with cerebral infarction in recovery period under supplementing qi and activating blood circulation drugs.Methods:Longa method was slightly modified in making the rat model of left middle cerebral artery occlusion. According to the random number table method，the rats were randomly divided into 7 groups，including a normal group, a model group, a sham operation group, a supplementing qi group, an activating blood circulation group, a supplementing qi and activating blood circulation group, and an ERK inhibitor group. Using RT-PCR technique, we observed the effect of supplementing qi and activating blood circulation drugs on c-fos mRNA of rats with cerebral infarction after 28 days′ treatment in myocardial infarction cortex.Results:After 28 days′ treatment，compared with normal group, c-fos mRNA expression in the model group was significantly decreased (P<0.05)；c-fos mRNA expression in the supplementing qi and activating blood circulation group and ERK inhibition group increased to a certain extent than that in the model group (P<0.05)；the activating blood circulation group had no significant statistical difference with the model group(P>0.05)；c-fos mRNA expression in supplementing Qi group was lower than the other groups (P<0.05).Conclusion:In the recovery period of cerebral infarction, supplementing qi and activating blood circulation drugs can improve cerebral ischemia in a certain degree, which is better than simply supplementing qi and activating blood circulation, and its therapeutic mechanism may be related to improving the expression of c-fos mRNA.

Cerebral infarction; C-fos; Supplementing qi and activating blood circulation

R256

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.043

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2015CB554401)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助課題(20120013120014)；北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(東方新星)(DFRC2014C01)

王嘉麟(1982.04—)，男，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治腦病基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail:WJL2008420@sina.com，Tel：(010)67689749

郭蓉娟(1964.08—)，女，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院副院長(zhǎng)，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治腦病基礎(chǔ)與臨床研究，Tel：(010)67689749，E-mail:dfguorongjuan@163.com