張晶晶，康天放，劉錦華，丁 玎，宋海燕，杜曉麗

(1.北京工業(yè)大學 環(huán)境與能源工程學院，北京 100124；2.北京市勞動保護科學研究所，北京 100054)

納米金信號探針/石墨烯修飾免疫傳感器檢測微囊藻毒素

張晶晶1，2*，康天放1*，劉錦華2，丁 玎2，宋海燕1，杜曉麗1

(1.北京工業(yè)大學 環(huán)境與能源工程學院，北京 100124；2.北京市勞動保護科學研究所，北京 100054)

納米金信號探針；石墨烯；微囊藻毒素；免疫傳感器

微囊藻毒素是一種環(huán)狀七肽肝毒素，是淡水水體富營養(yǎng)化的次級代謝產(chǎn)物。微囊藻毒素-(亮氨酸-精氨酸)(Microcystin-(Leucine-Argineine),MCLR)是目前發(fā)現(xiàn)的100多種異構體中毒性最強、急性危害最大的一種[1]，世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《飲用水水質準則》中規(guī)定MCLR限值為1 μg/L，因此建立一種快速、高靈敏度的MCLR檢測方法具有重要意義[2]。

電化學免疫傳感器具有選擇性高、響應快、靈敏度高等特點，在快速分析領域被廣泛研究應用[3]。納米材料的引入為免疫傳感器發(fā)展提供了新的可能性，主要用于敏感分子的固定、提高電子傳遞速率、信號的檢測和放大等[4]。納米金(AuNPs)具有比表面積大、表面活性中心多、良好的導電性和生物相容性等優(yōu)點[5]，在免疫傳感器的構建過程中，主要通過電化學還原[6]或化學還原[7]等方式形成不同納米微結構的修飾層，起到提高靈敏度或固定敏感分子的作用。相較于大多數(shù)通過酶標記物催化產(chǎn)生或放大檢測信號[8]，納米信號探針更易保持標記載體生物活性，提高檢測穩(wěn)定性。納米金在生物標記分析中同樣具有重要貢獻,1971年Faulk等[9]首次將AuNPs引入到免疫分析中制成電子顯微鏡的金探針，近年來AuNPs被廣泛應用于細胞、抗原、抗體和DNA的標記物[10-12]。石墨烯(Graphene sheet，GS)具有單原子厚度，以正六邊形排列呈蜂窩狀二維平面結構，理論比表面積達2 630 m2/g，室溫下平面電子遷移率為1.5×104cm2/(V·s)，GS還具有優(yōu)異的機械力學性能和良好生物相容性，具有固載生物活性分子和信號傳遞并放大的雙重作用，成為構筑電化學生物傳感器的理想材料[13-15]。

本文利用1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)活化GS偶聯(lián)BSA-MCLR，將其懸濁液修飾于玻碳電極表面，在電極表面滴加一定量的混合溶液，其中含有不同濃度的MCLR和一定量AuNPs標記的anti-MCLR(記為Ab-Au)，使溶液中MCLR與電極表面的BSA-MCLR競爭結合Ab-Au，通過電化學氧化將AuNPs溶于溶液中，再采用差分脈沖伏安法(DPV)進行陰極電位掃描，通過DPV峰電流對MCLR進行定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀 器

電化學實驗在CHI660e電化學工作站(上海辰華儀器公司)上進行，三電極系統(tǒng)：玻碳電極(Φ=3 mm)為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。2450型紫外-可見吸收光譜儀、SPM-9600型透射電子顯微鏡(日本島津公司)；SU-8010型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；FE20型pH計(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試 劑

石墨粉(320目，光譜純)購于國藥化學試劑有限公司；氯金酸(HAuCl4·3H2O)購于北京百靈威科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA，分子量66.4 kDa)購于Sigma有限公司。anti-MCLR(分子量15 wDa)、MCLR、BSA-MCLR、微囊藻毒素-精氨酸-精氨酸(MCRR)和微囊藻毒素-絡氨酸-精氨酸(MCYR)均購于北京伊普瑞思科技有限公司。水合肼、H2SO4、HCl、H2O2等試劑購于北京化學試劑公司，所有試劑均為分析純及以上純度。實驗用水為超純水(Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)，法國Millipore公司)。

1.3 石墨烯的制備

取一定量石墨放入80 ℃烘箱中干燥2 h后待用。將3.0 g K2S2O8、3.0 g P2O5、12 mL 98%濃硫酸置于三口燒瓶中，邊攪拌邊加熱至80 ℃，然后向燒瓶中加入2.0 g烘干的石墨粉末，待反應物完全變?yōu)樗{色后停止加熱，冷卻至室溫，用二次水稀釋，過濾，直至濾液呈中性。

采用改進的Hummers法[16]，向預氧化的石墨中加入46 mL濃硫酸和1 g NaNO3，攪拌混合均勻后，放入0 ℃冰浴中，緩慢加入6 g KMnO4，控制反應溫度不超過10 ℃。去掉冰浴，懸濁液溫度升至(35±3)℃，保持30 min。反應過程中，混合物逐漸變稠，最后變成糊狀。30 min后，向燒瓶中緩緩加入92 mL水，燒瓶中劇烈冒泡，溫度升至98 ℃，稀釋的懸濁液呈褐色，在該溫度下繼續(xù)反應15 min后，再加入28 mL熱水，進一步稀釋。用3%的H2O2還原剩余KMnO4為無色可溶性正二價錳鹽，此時溶液呈亮黃色。趁熱過濾，并用過量的(250 mL左右) 1∶10的HCl溶液洗滌，過濾移除金屬離子。用水充分洗滌至中性后，置于60 ℃烘箱中烘干，得到黃褐色氧化石墨。

將干燥后的氧化石墨分散于二次水中，在100 W功率下超聲處理5 h，使氧化石墨片層剝落，得到棕色懸濁液。將懸濁液離心分離10 min，移去未剝離的氧化石墨，得到氧化石墨烯懸濁液。向氧化石墨烯懸濁液中加入100 μL水合肼，95 ℃水浴中攪拌反應5 h，溶液由黃褐色變?yōu)楹谏?。將樣品用水充分淋洗過濾，烘箱干燥，得到黑色憎水的石墨烯。

1.4 金溶膠的制備

將8 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液迅速加入到0.01% 100 mL沸騰狀態(tài)下的HAuCl4溶液中，攪拌15 min，混合溶液的顏色由淺黃變?yōu)榫萍t色。自然冷卻至室溫，即得納米金溶膠，置于4 ℃冰箱黑暗條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫傳感器的制備

將2 mg GS高度分散于水中，向其中加入100 mmol/L EDC和100 mmol/L NHS，搖床中振蕩反應2 h，然后將1 mL 60 μg/mL BSA-MCLR加入到上述混合溶液中，繼續(xù)反應2 h。將混合溶液離心、超純水清洗，得到共價連接MCLR的石墨烯片復合物(GS-MCLR)懸濁液，4 ℃下儲存?zhèn)溆肹17]。

將4 μL 20 μg/mL的anti-MCLR與20 μL的AuNPs膠體溶液混合，室溫下反應30 min，AuNPs與anti-MCLR中的半胱氨酸殘基通過Au-S鍵連接，將混合溶液于14 000 r/min條件下離心1 h，移去含有未與AuNPs偶聯(lián)的抗體的上清液，所得沉淀為AuNPs標記的anti-MCLR，分散于10 μL水中，制成Ab-Au懸濁液，標記為Ab-Au[18]。

用粒徑為0.5 μm的Al2O3懸濁液將玻碳電極拋光成鏡面，用水沖洗后分別用乙醇和水超聲清洗5 min，氮氣吹干。在玻碳電極表面滴加10 μL GS-MCLR溶液，室溫下晾干，得到免疫傳感器GS-MCLR/GCE，4 ℃下儲存?zhèn)溆谩Ｃ庖邆鞲衅鞯闹苽溥^程如圖1所示。

圖1 免疫傳感器制備示意圖Fig.1 Fabrication process and the detection mechanisms of the immunosensor absence(a) and presence(b) of MCLR

1.6 測定方法

2 結果與討論

2.1 納米金的表征

圖2A為AuNPs的紫外可見光吸收光譜，在519 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，根據(jù)文獻[20]的方法計算AuNPs粒徑約為19 nm。透射電鏡圖(圖2B)顯示，AuNPs形狀呈球形，均勻分散，粒徑分布為16～20 nm。

2.2 石墨烯的表征

采用掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)對所制備的石墨烯進行了表征。從圖3可以看出，石墨烯呈無序、褶皺的薄紗片層結構，部分薄片層堆疊，呈多層結構。這種結構穩(wěn)定，可極大地增加電極的比表面積。

2.3 電極在修飾過程中的電化學行為

采用循環(huán)伏安法考察了不同修飾電極在含1.0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中的電化學行為，掃描電位范圍為-0.6～0.3 V，掃描速率為100 mV/s。如圖4所示，[Fe(CN)6]3-/4-在裸玻碳電極表面的循環(huán)伏安圖有1對峰形較好的氧化還原峰，氧化峰電位約為-0.18 V，還原峰電位約為-0.25 V(圖4a)；當電極表面修飾10 μL 2 mg/mL石墨烯溶液后，氧化還原峰電流明顯增大(圖4b)，表明石墨烯具有良好的導電性，能夠顯著提高探針分子在電極上的電子傳輸，此外，該循環(huán)伏安圖也呈現(xiàn)出較大的充電電流；當在玻碳電極表面修飾MCLR-GS后，該修飾層對電子轉移起到阻礙作用，原因在于制備MCLR-GS修飾劑時所采用的微囊藻毒素是偶聯(lián)了牛血清白蛋白的MCLR(BSA-MCLR)，由于BSA的導電性差，使得MCLR-GS/GCE的峰電流明顯小于GS/GCE，但比裸玻碳電極略大(圖4c)。電極表面修飾4 μL 20 μg/mL anti-MCLR(Ab)之后，峰電流下降(圖4d)，Ab增大了探針離子通過膜的阻力；當在電極表面修飾了含有AuNPs的修飾劑Ab-Au/MCLR-GS之后，[Fe(CN)6]3-/4-在電極上的氧化還原峰電流略增大(圖4e)，說明AuNPs顯著增大了電極表面修飾層的導電性，AuNPs可以通過與抗體發(fā)生化學吸附作用較好地保持抗體的生理活性。

圖4 GCE(a)、GS/GCE(b)、MCLR-GS/GCE(c)、Ab/MCLR-GS/GCE(d)和Ab-Au/MCLR-GS/GCE(e)在含1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of GCE(a),GS/GCE(b),MCLR-GS/GCE(c),Ab/MCLR-GS/GCE(d),Ab-Au/MCLR-GS/GCE(e)in 0.1 mol/L KCl solution containing of 1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-

圖5 不同濃度MCLR免疫傳感器的差分脈沖伏安圖Fig.5 Differential pulse voltammograms of MCLR of different concentrationssupporting electrolyte solution:2 mol/L HCl;concentration of MCLR(a-f):0,0.100,1.00,10.0,25.0,50.0 μg/L；insert：calibration curve of determination MCLR

2.4 實驗條件的優(yōu)化

2.4.1底液中鹽酸濃度的優(yōu)化考察了底液中HCl濃度(1～3 mol/L)的影響。結果顯示，峰電流信號隨著HCl濃度增加而增大，在濃度超過2 mol/L后峰電流信號下降，本文采用2 mol/L為最佳HCl濃度。

2.4.2 BSA-MCLR濃度的優(yōu)化隨著BSA-MCLR濃度的增加越來越多的BSA-MCLR偶聯(lián)在石墨烯表面，從而使檢測的峰電流信號增強，當BSA-MCLR濃度超過60 μg/mL后，峰電流信號隨著BSA-MCLR濃度增加變化不大，因此選用60 μg/mL BSA-MCLR為最佳濃度。

2.4.3 anti-MCLR濃度的優(yōu)化AuNPs標記的anti-MCLR的用量對峰電流強度產(chǎn)生直接影響，實驗結果表明，當anti-MCLR濃度在5～20 μg/mL范圍時，峰電流信號隨anti-MCLR濃度的增加而增強，當 anti-MCLR濃度超過20 μg/mL后，峰電流信號無明顯變化，因此選擇20 μg/mL anti-MCLR為最佳條件。

2.5 免疫傳感器對MCLR的測定

在優(yōu)化條件下，考察了MCLR-GS/GCE免疫傳感器對不同濃度MCLR的電流響應。如圖5所示，差分脈沖伏安峰電流(DPV)隨MCLR濃度的增加而減小。ΔI與MCLR質量濃度在0.1～50 μg/L范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為ΔI(μA)=0.471 5+0.155 2CMCLR(μg/L)，相關系數(shù)為0.991 6，檢出限為0.05 μg/L(S/N=3)。

2.6 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性與選擇性

免疫傳感器MCLR-GS/GCE在4 ℃下保存30 d，對濃度為10 μg/L的MCLR進行測定，響應電流為最初的97.3%，說明免疫傳感器具有較好的穩(wěn)定性。相同實驗條件下，以5支免疫電極檢測1.00 μg/L MCLR，響應電流的相對標準偏差(RSD)為7.2%，表明制備的免疫傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

3 結 論

本文構建了納米金信號探針/石墨烯修飾的MCLR電流型免疫傳感器，并用于微囊藻毒素的檢測。結果表明，該傳感器操作簡單，相較于酶標記材料，AuNPs粒徑和質量小，巰基與AuNPs形成Au-S鍵，不易脫落，與電極間的電子傳遞速率更快，靈敏度高、檢測效果良好，作為信號探針更加經(jīng)濟便捷。本研究建立的檢測MCLR的新方法快速、可靠，對現(xiàn)場快速篩查和定量分析水體中MCLR具有重要意義。

[1] Kim S K,Kim H H,Lee K M,Lee H J,Lee C.WaterRes.,2017,114:277-285.

[2] WHO.GuidelinesforDrinking-WaterQuality.4th ed.Geneva:World Health Organization,2011.

[3] Kokkinos C,Economou A,Prodromidis M I.TrACTrendsAnal.Chem.,2016,79:88-105.

[4] Riccia F, Adornettoa G,Palleschi G.Electrochim.Acta,2012,84:74-83.

[5] Tang J,Hu R, Wu Z S, Shen G L,Yu R Q.Talanta,2011,85:117-122.

[6] Zhang J J,Kang T F,Hao Y C,Lu L P,Chen S Y.Sens.ActuatorsB,2015,214:117-123.

[7] Zhang J J,Kang T F,Li N N,Lu L P,Cheng S Y.J.Instrum.Anal.(張晶晶,康天放,李娜娜,魯理平，程水源.分析測試學報),2016,35(9):1100-1104.

[8] Wu H,Ohnuki H,Ota S,Murata M,Yoshiura Y,Endo H.Biosens.Bioelectron.,2016,93:57-64.

[9] Faulk W P,Taylor G M.Immunochemistry,1971,8:1081-1083.

[10] Hurst S J,Lytton-Jean A K R,Mirkin C A.Anal.Chem.,2006,78(24):8313-8318.

[11] Lee J S,Han M S,Mirkin C A.Angew.Chem.,2007,46:4093-4096.

[12] Thaxton C S,Dimitra Q,Mirkin C A.Clin.Chim.Acta,2006,363:120-126.

[13] Cui X Q,Liu J F,Yang A K,Fang X,Xiao C,Zhao H,Ren H X,Li Z X.ColloidsSurf.A,2017,520:668-675.

[14] Yang J J,Cao J T,Wang H,Liu Y M,Ren S W.Talanta,2017,167:325-332.

[15] Chen L,Li N,Zhang M X,Li P N,Lin Z P.J.SolidStateChem.,2017,249:9-14.

[16] Hummer W S,Offeman R E.J.Am.Chem.Soc.,1958,80:1339.

[17] Wei Q,Zhao Y,Du B,Cai Y,Mao K,Li H,Xu C.Adv.Funct.Mater.,2011,21:4193-4198.

[18] Ilkhani H,Sarparast M,Noori A,Bathaie S Z,Mousavi M F.Biosens.Bioelectron.,2015,74:491-497.

[19] Hou L,Ding Y H,Zhang L L,Guo Y,Li M S,Chen Z,Wu X P.Sens.ActuatorsB,2016,233:63-70.

[20] Zhou J,Du L,Zou L,Zou Y,Hu N,Wang P.Sens.ActuatorsB,2014,197:220-227.

Determination of Microcystins Using a Graphene Modified Immunosensor Based on Au Nanoparticles Signal Probe

ZHANG Jing-jing1,2*,KANG Tian-fang1*,LIU Jin-hua2,DING Ding2,SONG Hai-yan1,DU Xiao-li1

(1.College of Environmental and Energy Engineering，Beijing University of Technology,Beijing 100124，China;2.Beijing Municipal Institute of Labour Protection,Beijing 100054，China)

AuNPs signal probe;graphene;microcystins;immunosensor

O657.1；TP212.2

:A

：1004-4957(2017)09-1075-06

2017-04-12；

：2017-05-31

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFC0700604)資助

*

：張晶晶，博士，助理研究員，研究方向:快速檢測技術與應用，Tel:15011596908,E-mail:zjjzhaxidele@163.com 康天放，博士，教授，研究方向：化學生物傳感技術及化學污染物快速檢測應用，Tel:010-67391659,E-mail:kangtf@bjut.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.003