沈 麗，王 超，陳 靜，楊 雪

(北京物資學(xué)院 物流學(xué)院，北京 101149)

UHPLC-Quadrupole/Orbitrap MS同步檢測十字花科植物中的游離氨基酸

沈 麗*，王 超，陳 靜，楊 雪

(北京物資學(xué)院 物流學(xué)院，北京 101149)

采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UHPLC-Quadrupole/Orbitrap MS)結(jié)合柱前衍生法建立了可同時(shí)測定28種游離氨基酸的分析方法，并對十字花科植物中的游離氨基酸進(jìn)行檢測和分析。樣品用超純水提取后，經(jīng)6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯(AQC)衍生，采用Waters BEH C18柱作為色譜柱，以pH 5.0乙酸銨緩沖溶液和80%乙腈水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。質(zhì)譜檢測器采用電噴霧離子源，在正離子模式下進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，十字花科植物中含有25種以上游離氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸。25種氨基酸在線性范圍內(nèi)相關(guān)性良好，平均加標(biāo)回收率為80.5%～104.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～4.4%。不同氨基酸檢測靈敏度不同，定量下限為0.01～1.45 μmol/L。該方法雜質(zhì)干擾小，分析速度快，靈敏度高，適用于植物樣品中游離氨基酸的同步檢測。

超高效液相色譜；高分辨質(zhì)譜；游離氨基酸；十字花科植物

氨基酸是生物體內(nèi)構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位，與生物的生命活動(dòng)有著密切關(guān)系[1]。為適應(yīng)人體新陳代謝的需要，人們必須從食物中攝取所需氨基酸。植物作為人類重要的食物來源，是人類獲取氨基酸的主要途徑之一[2]。同時(shí)，氨基酸還是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式進(jìn)行運(yùn)輸，測定植物體內(nèi)氨基酸的含量有助于研究植物在不同條件下及不同生長發(fā)育時(shí)期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運(yùn)輸、同化等[3]。氨基酸在植物體內(nèi)以游離態(tài)存在[4]，因此，測定植物體內(nèi)游離氨基酸的含量具有重要意義。

早期主要采用氨基酸分析儀對游離氨基酸進(jìn)行檢測[5]，但由于氨基酸分析儀具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價(jià)格昂貴、測定時(shí)間長和靈敏度較低等缺點(diǎn)，分析工作者開發(fā)了一系列新方法來測定植物樣品中的游離氨基酸，包括氣相色譜法[6-7]、液相色譜法[8]、毛細(xì)管電泳法[9-10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等。其中，反相高效液相色譜法因具有操作程序簡單、運(yùn)行時(shí)間短、靈敏度較高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于植物樣品中游離氨基酸的檢測。由于氨基酸極性較強(qiáng)，缺少可產(chǎn)生紫外吸收或熒光信號(hào)的基團(tuán)，應(yīng)用液相色譜法進(jìn)行檢測時(shí)需對氨基酸進(jìn)行柱前衍生[14]。常用的衍生試劑有鄰苯二甲醛(OPA)、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)、異硫氰酸苯酯(PITC)、丹磺酰氯、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC)等[15]。已報(bào)道的柱前衍生結(jié)合反相高效液相色譜法最多能實(shí)現(xiàn)22種游離氨基酸的同步檢測，檢出限在mg/L量級(jí)。由于氨基酸是一類化學(xué)性質(zhì)相似的生物活性物質(zhì)，檢測方法的靈敏度對分析的準(zhǔn)確性起非常重要的作用。因此，建立能同步檢測更多種游離氨基酸、靈敏度更高、準(zhǔn)確性更好、快速高效的氨基酸分析方法非常必要。

本文建立了一種柱前衍生/超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用快速檢測植物中游離氨基酸的方法，能同時(shí)檢測多達(dá)28種氨基酸。所采用的衍生劑為AQC。AQC能同時(shí)與一級(jí)、二級(jí)氨基酸反應(yīng)，且衍生時(shí)間較短，產(chǎn)物穩(wěn)定性強(qiáng)，有較高的靈敏度，檢出限低[15]，非常適合作為氨基酸檢測的衍生劑。本文以十字花科最簡單的植物——擬南芥作為代表，對上述方法應(yīng)用于植物樣品檢測的條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了油菜、香菜、生菜、油麥菜等十字花科植物中游離氨基酸的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Thermo Scientific Q-Exactive超高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Scientific公司)；KQ5200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；5418 高速離心機(jī)(德國Eppendorf 公司)；FreeZone凍干機(jī)(美國Labconco公司)；Vortex Genius 3渦旋混合器(德國IKA公司)；Milli-Q超純水器(默克化工技術(shù)上海有限公司)。

WATERS AccQ-Fluor試劑盒(衍生劑粉2A、硼酸緩沖液、稀釋液2B,Waters公司)；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液(Sigma-Aldrich公司)；乙酸銨(分析純)、乙醇(色譜純)、乙酸(色譜純)和乙腈(色譜純)均購自國藥集團(tuán)北京試劑公司。

擬南芥植物來自于實(shí)驗(yàn)室溫室內(nèi)種植；油菜、油麥菜、香菜、生菜等蔬菜購自市場。

氨基酸儲(chǔ)備液濃度為450 μmol/L，使用時(shí)逐級(jí)稀釋，使之濃度為100、20、5、1、0.5 μmol/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1超高效液相色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UHPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；柱溫40 ℃；流動(dòng)相:A為20 mmol/L乙酸銨溶液(pH 5.0)，B為80%乙腈水溶液；梯度洗脫程序:0.00～3.06 min，97%～93% A；3.06～3.86 min，93%～88% A；3.86～3.89 min，88%～85% A；3.89～8.06 min，85%～66%A；8.06～12 min，66%～30% A；12～15 min，30% A；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.3 mL/min。

1.2.2質(zhì)譜條件離子化模式：電噴霧離子源，正離子模式；質(zhì)譜掃描方式：一級(jí)全掃描(分辨率70 000)和靶標(biāo)二級(jí)掃描(分辨率35 000)；電離電壓：3.5 kV；毛細(xì)管溫度320 ℃；霧化氣溫度350 ℃；鞘氣流量30 L/min，輔助氣流量10 L/min，反吹氣流量5 L/min。

1.2.3樣品前處理方法將植物樣品用超純水洗凈，在液氮條件下保存。從液氮中取出的植物樣品放入真空冷凍干燥機(jī)中，直至樣品干燥完全(約1.5 d)。選取干燥后的植物，去除根部后，全植株剪碎，并在研缽中充分研磨均勻。稱取20 mg樣品于離心管中，加1 mL超純水提取，常溫超聲30 min后，離心10 min(5 000 r/min)，取上清液備用。

1.2.4衍生程序采用AQC為柱前衍生劑。取10 μL樣品提取液置于衍生瓶中，加入70 μL硼酸鹽緩沖液(Buffer 1)，混勻后加入20 μL衍生劑。室溫放置1 min，置于55 ℃烘箱中，衍生10 min。取出冷卻至室溫后，裝瓶上機(jī)待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜與色譜條件的優(yōu)化

為獲得更高的選擇性和靈敏度，對質(zhì)譜條件包括離子模式、碎裂電壓、離子源溫度、鞘氣流量及碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，正離子模式下，各氨基酸的分子離子均為[M+H]+。正離子模式下各氨基酸的特征碎片離子如表1所示。

表1 28種待測氨基酸的保留時(shí)間、質(zhì)譜參數(shù)、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量下限Table 1 Retention times,mass spectrometric parameters,linear ranges,correlation coefficients and quantitation limits of 28 amino acids

圖1 28種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of amino acids mixed standard solution

為獲得更好的分離效果，對色譜柱、流動(dòng)相組成以及進(jìn)樣體積等色譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。比較了BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 和HILIC C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 2種色譜柱，發(fā)現(xiàn)采用BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 能夠得到較好的保留時(shí)間和峰形。因此，選擇BEH C18柱作為分離柱。對于流動(dòng)相，主要對乙酸銨濃度和溶液pH值進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙酸銨濃度在10～50 mmol/L范圍時(shí)，所有氨基酸的峰形和峰強(qiáng)度基本不變。當(dāng)乙酸銨濃度低于10 mmol/L時(shí)，多數(shù)氨基酸的峰強(qiáng)度下降，而乙酸銨濃度過高會(huì)對儀器系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響，降低色譜柱的使用壽命。另外，通過優(yōu)化發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為弱酸性時(shí)所得信號(hào)較好，因此將流動(dòng)相A的pH值設(shè)為5.0，濃度在10～50 mmol/L范圍內(nèi)均可。本實(shí)驗(yàn)選擇的乙酸銨濃度為20 mmol/L。對進(jìn)樣體積進(jìn)行優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，進(jìn)樣體積超過2 μL時(shí)，氨基酸的分離度變差。在優(yōu)化條件下，28種氨基酸的總離子流圖如圖1所示。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1樣品干燥方法新鮮植物樣品的含水量高，在檢測之前需將樣品進(jìn)行干燥處理。本實(shí)驗(yàn)采用烘箱烘干和真空冷凍干燥兩種方式對擬南芥樣品進(jìn)行處理，氨基酸測定含量為3個(gè)批次實(shí)驗(yàn)的平均值，結(jié)果如表2所示。通過實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)凍干處理后，大多數(shù)氨基酸的含量比樣品經(jīng)烘干處理后測得含量高，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)較小。因此，冷凍干燥法可以更大限度的保留植物體內(nèi)氨基酸含量，本文選擇真空冷凍干燥法對植物樣品進(jìn)行處理。

表2 干燥方法對擬南芥中氨基酸含量測定的影響(μmol/g干重)Table 2 Effects of drying methods on the determination of amino acids in arabidopsis(μmol/g dry weight)

2.2.2樣品提取液與提取溫度的選擇植物樣品成分復(fù)雜，可能含有對氨基酸檢測產(chǎn)生干擾的成分，因此需選擇合適的提取液使基質(zhì)干擾最小。實(shí)驗(yàn)分別以1 mL乙醇和超純水作為提取劑，在0、25、70 ℃條件下對10 mg擬南芥植物樣品超聲處理30 min后，采用本方法測定游離氨基酸含量。對比發(fā)現(xiàn)，以超純水作為提取劑所測得的氨基酸含量較高，且不同超聲溫度下，氨基酸含量的測定值無明顯差異，樣品提取實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行即可。此外,以5%磺基水楊酸溶液作為稀酸溶液的代表，對擬南芥植物中的氨基酸進(jìn)行提取。結(jié)果表明，磺基水楊酸稀溶液和純水對各氨基酸的提取效果整體相當(dāng)，但純水提取后所得溶液顏色更清亮，因此本實(shí)驗(yàn)選用純水作為提取劑。

2.2.3樣品與提取液比例優(yōu)化分別稱取擬南芥樣品10、20、30 mg溶于1 mL提取液中，按照上文所述步驟進(jìn)行分析檢測，結(jié)果顯示樣品質(zhì)量分別為10 mg和20 mg時(shí)，所測得的游離氨基酸含量比值約為1∶2，但當(dāng)樣品質(zhì)量為30 mg時(shí)，所測得的游離氨基酸含量與10 mg樣品所測得的游離氨基酸含量比值小于1∶3，說明1 mL提取液不能將30 mg樣品中的氨基酸提取完全。因此最終選擇將20 mg樣品溶于1 mL提取液中。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限(LOQ) 采用分辨率為70 000的高分辨質(zhì)譜儀來識(shí)別氨基酸；每種母離子色譜圖的提取窗口設(shè)置為3 ppm來減少干擾。以各濃度下化合物的定量離子峰面積對濃度作線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線，以10倍信噪比時(shí)的濃度計(jì)算定量下限(LOQ)，結(jié)果如表1所示。每種化合物的峰面積對相應(yīng)濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)不低于0.995，LOQ為0.01～1.45 μmol/L，能夠滿足檢測要求。

2.3.2準(zhǔn)確性與精密度方法的準(zhǔn)確度通過擬南芥植物樣品添加已知量標(biāo)準(zhǔn)品所得回收率來考察，精密度則由回收率的RSD來反映。分別向樣品中添加低濃度和高濃度的含有谷氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、脯氨酸5種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品，每批次每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。以上5種氨基酸在化學(xué)性質(zhì)、極性等方面差異較大，在植物樣品內(nèi)的含量也相差較大，可以代表絕大部分氨基酸。如表3所示，3個(gè)加標(biāo)濃度的回收率為80.5%～104.4%，RSD為0.6%～4.4%，證明該方法重現(xiàn)性較好。

表3 5種氨基酸的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 5 amino acids in spiked samples(n=3)

表4 實(shí)際樣品中游離氨基酸分析結(jié)果(μmol/g干重)Table 4 Determination results of free amino acids in real samples(μmol/g dry weight)

*no detection

2.4 實(shí)際樣品分析

將該方法應(yīng)用于市售油菜、油麥菜、香菜、生菜等4種十字花科植物中游離氨基酸含量的檢測。分別采用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法(以正亮氨酸為內(nèi)標(biāo)物)進(jìn)行定量分析，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法所得結(jié)果差別不大，說明兩種方法均可用于植物中游離氨基酸的定量檢測。因外標(biāo)法比內(nèi)標(biāo)法更加簡便，選擇外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表4所示。由此可見，4種蔬菜中含有豐富的游離氨基酸，油菜的氨基酸含量最高，其次是香菜、生菜、油麥菜。4種蔬菜中全部含有色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸8種人體必需氨基酸，其中以油菜含量最高。

3 結(jié) 論

利用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合AQC柱前衍生法建立了植物中游離氨基酸的快速檢測方法。本方法將現(xiàn)有柱前衍生/RPHPLC方法的分析指標(biāo)擴(kuò)展到28個(gè)。通過優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件以及樣品前處理方法，使檢測更加便捷與準(zhǔn)確。通過對十字花科植物中游離氨基酸的檢測，發(fā)現(xiàn)植物中含有超過25種游離氨基酸，包括8種人體必需氨基酸，進(jìn)一步證實(shí)了十字花科植物的營養(yǎng)價(jià)值。

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Detection of Free Amino Acids in Cruciferous Vegetables by Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Quadrupole/Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry

SHEN Li*,WANG Chao，CHEN Jing,YANG Xue

(Logistics School,Beijing Wuzi University,Beijing 101149,China)

A simultaneous method was developed for the analysis of 28 free amino acids using ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry with pre-column derivatization,and was used to detect the free amino acids in cruciferous plants.The samples were extracted using ultra-pure water,and derivatized with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate(AQC) to enhance chromatographic retention.A Waters BEH C18column was used as stationary phase.Ammonium acetate solution(pH 5.0) and 80% acetonitrile in water were applied as mobile phases for gradient elution.MS detector with electrospray ion source worked in positive ion mode.The results showed that there were more than 25 kinds of free amino acids in cruciferous plants,including 8 essential amino acids.All calibration curves of the analytes exhibited good linearity.The average recoveries of this method ranged from 80.5% to 104.4% with the relative standard deviations of 0.6%-4.4%.The sensitivities of amino acids were different,and the quantitation limit was between 0.01 μmol/L and 1.45 μmol/L.With the advantages of little impurity interference,rapidness and high sensitivity,the method is suitable for the simultaneous detection of free amino acids in plant samples.

ultra-high performance liquid chromatography;high resolution mass spectrometry;free amino acids;cruciferous vegetables

O657.63；Q517

:A

：1004-4957(2017)09-1093-06

2017-04-13；

：2017-05-25

北京市科技新星計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013028)；中國商品學(xué)會(huì)規(guī)劃項(xiàng)目(SPXH201601)

*

：沈 麗，博士，副教授，研究方向：商品檢驗(yàn)與質(zhì)量管理，Tel:010-89534018，E-mail:lishen97@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.006