朱元祺，賈 楠，田清武，吳國才，董丹丹，張 會，李延年*

(1.青島大學附屬醫(yī)院 檢驗科，山東 青島266003；2.青島大學醫(yī)學院)

青島市流行性出血熱的漢坦病毒檢測和其基因型的研究

朱元祺1，賈 楠2，田清武1，吳國才1，董丹丹2，張 會2，李延年1*

(1.青島大學附屬醫(yī)院 檢驗科，山東 青島266003；2.青島大學醫(yī)學院)

目的探討引起青島市流行性出血熱的漢坦病毒(Hantavirus,HV)的感染類型，以明確基因亞型和進化特點。方法免疫膠體金法檢測126份臨床懷疑急性期病人血清中漢坦病毒的抗體。RT-PCR 擴增病毒的S 基因段，并經(jīng)測序獲得基因序列。病毒的核苷酸序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹應用DNASta軟件，并以確定病毒的型別。結(jié)果126份血清標本中，112份漢坦病毒IgM和(或)IgG抗體陽性。經(jīng)RT-PCR 擴增獲得7株漢坦病毒S基因序列，與漢灘型(Hantaan virus,HTN)和漢城型(Seoul virus,SEO)毒株比較，其中2株為HTN型，5株為SEO型，相互間序列達到68%-98.9%同源性。結(jié)論引起青島市流行性出血熱的漢坦病毒為漢灘型和漢城型的混合感染，以漢城型為主。

漢坦病毒；S 基因；感染；漢灘型；漢城型

(ChinJLabDiagn,2017,21:1314)

漢坦病毒(Hantavirus，HV) 基因組由大(L)、中(M)、小(S)三個節(jié)段組成，可引起人類流行性出血，即腎綜合征出血熱( HFRS)。盡管漢坦病毒新型或新亞型不斷被發(fā)現(xiàn)，但引起人腎綜合征出血熱的病毒亞型主要是漢灘型(Hantaan virus，HTN)和漢城型(Seoul virus ，SEO)[1]。因此，我們對臨床高度懷疑為腎綜合征出血熱的病人進行抗體檢測，同時設計引物擴增S基因序列，并與漢灘型(M14626)和漢城型(M34881)標準毒株的序列進行比較，了解引起青島市流行性出血熱的漢坦病毒的感染類型，以明確基因亞型和進化特點，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 漢坦病毒抗體的檢測

收集126份臨床懷疑腎綜合征出血熱病人的血清，采用膠體金法檢測漢坦病毒的IgM和IgG抗體。試劑由廈門市波生生物技術有限公司提供，具體操作和結(jié)果的判斷按說明書。

1.2 主要儀器和試劑

RT-PCR擴增試劑盒、核酸分子量標準和瓊脂糖為大連寶生物；美國Bio-RAD公司MyCycle型PCR擴增儀；美國Alpha Innotech公司HP3400型全自動凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 病毒核糖核酸的提取

從腎綜合征出血熱病人的血清中提取病毒核糖核酸，是按照上海之江生物科技股份有限公司提供的試劑盒說明書進行。保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計和RT-PCR擴增

參照相關文獻[1]，根據(jù)漢坦病毒標準株(76-118)的序列，設計兩對擴增S基因的引物。QSF1:5′-TAGTAGTAGACTCCCTAAAGA-3′，QSR1：5′-CCCGAGTGGTACAAGGAACGG-3′。

QSF2:5′-GCACTGGCAAAAGATTGGACA-3′,QSR2：5′-AAATCCCTCAGATGATGAT-3′。擴增條件:62℃ 1 min，45℃ 10 min，53℃ 30 min，95℃15 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min 40 個循環(huán)。北京睿博興科生物技術有限公司完成引物合成和產(chǎn)物測序。

1.5 核苷酸同源性和系統(tǒng)發(fā)生樹分析

擴增產(chǎn)物經(jīng)睿博興科生物公司雙向測序、拼接，應用DNASta軟件與數(shù)據(jù)庫中已知漢灘型(M14626)和漢城型(M34881)標準株序列進行比對，以分析臨床標本中病毒核苷酸序列的同源性和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 漢坦病毒抗體檢測、PCR擴增和病毒核苷酸同源性分析結(jié)果

在收集的臨床高度懷疑為腎綜合征出血熱病人的126份血清標本中，其中的112份漢坦病毒IgM和(或)IgG抗體陽性，陽性率為88.9%。經(jīng)PCR 擴增、測序和拼接，共獲得7株漢坦病毒S基因完整的序列，命名為QDS01-QDS07。 經(jīng)DNASta軟件分析，QDS01-QDS07相互間序列達到68%-98.9%同源性。其中，QDS02與QDS04序列之間同源性高達98.9% 。詳見圖1。

圖1 不同漢坦病毒青島株S段核苷酸序列的同源性

2.2漢坦病毒青島株S基因段系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果

經(jīng)DNASta軟件分析QDS01-QDS07漢坦病毒S基因序列，并與數(shù)據(jù)庫中漢灘型(HTN，M14626)和漢城型(SEO，M34881)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果顯示有兩個分支，其中2株與漢灘型親緣近，而另外5株與漢城型在一個分支。詳見圖2。

圖2 漢坦病毒青島株S段系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討論

漢坦病毒是引起腎綜合征出血熱的主要病原體。其基因組由分別編碼病毒RNA依賴的RNA多聚酶、病毒糖蛋白G1和G2以及病毒的核衣殼蛋白的L、M和S基因節(jié)段組成。除了與病毒感染和復制有關外，S基因序列具有相對的保守性，從而可對臨床標本中獲得的S段序列來分析漢坦病毒的進化、變異信息[2]。

我們對2013-2016年門診和住院臨床高度懷疑為腎綜合征出血熱的病人進行漢坦病毒IgM和IgG抗體的檢測。在測定的126份樣本中，其中112份呈現(xiàn)漢坦病毒IgM和(或)IgG抗體陽性，陽性率為88.9%。這表明青島地區(qū)仍然是人腎綜合征出血熱發(fā)病的主要地區(qū)之一。

人感染腎綜合征出血熱病毒亞型與疫源地宿主攜帶的HV型別有關系。我國曾把HTN和SEO病毒稱為“野鼠型”和“家鼠型”病毒，現(xiàn)已將“野鼠型”改為“姬鼠型”[3，5]。我們共獲得7株漢坦病毒S基因完整的序列(QDS01-QDS07)，并將這些序列與數(shù)據(jù)庫中漢灘型(HTN，M14626)和漢城型(SEO，M34881)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果顯示有兩個分支，其中2株與HTN親緣近，而另外5株與SEO型在一個分支上。這與王慎驕等報道[4]江蘇省腎綜合征出血熱病毒感染特點相一致，即青島地區(qū)也是HV感染的混合疫區(qū)，同時存在HTN和SEO型漢坦病毒。核苷酸序列分析表明，7株間序列達到68%-98.9%同源性。在進化樹分支上，5株與SEO型病毒標準株具有較近的親緣關系，其中QDS02與QDS04之間同源性高達98.9%，這表明當?shù)亓餍械腟EO型病毒具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

總之，研究表明引起青島市流行性出血熱的漢坦病毒為HTN型和SEO型的混合感染，以SEO型病毒為主，即“家鼠”作為攜帶SEO型病毒的主要宿主動物，可能是引起青島地區(qū)人間流行性出血流行的主要因素之一，應引起注意。

[1]閉福銀,譚 毅,莫建軍,等.廣西北部地區(qū)漢坦病毒基因型研究[J].應用預防醫(yī)學,2016,22(05):383.

[2]CaoS,MaJ,ChengC,etal.GeneticcharacterizationofhantavirusesisolatedfromrodentsintheportcitiesofHeilongjiang,China,in2014[J].BMCVetRes,2016,12:12917.

[3]王玉蘭,蔡 東,許 艷,等.日照平原地區(qū)鼠類及其攜帶漢坦病毒調(diào)查[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2016,39(06):417.

[4]王慎驕,王笑辰,朱小娟,等.江蘇省2009-2013年漢坦病毒分離株全基因序列測定及分析[J].南京醫(yī)科大學學報(自然科學版),2015,35(11):1564.

[5]李 莉,張學軍,杜月荷.連云港市2009年HFRS病例的流行特征和實驗室檢測結(jié)果分析[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2010,37(14):2741.

StudyonantibodydetectionsandgenotypesoftheHantavirusinQingdaodistrict,china

ZHUYuan-qi,JIANan,TIANQing-wu,etal.

(TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266003,China)

ObjectiveTo explore the genotype of hantavirus causing hemorrhagic fever with renal syndrome patients in Qingdao district,and to affirm genetic subtypes and its evolution features.MethodsHantavirus IgM ,IgG antibodies were detected by Diagnostic kit for antibody to Hantavirus (Colloidal Gold).The complete S segments were amplified by RT-PCR and sequenceing.The sequence percent identity and the phylogenetic tree were done by DNAStar Software so as to clarifying the characteristics of Hantavirus.ResultsOut of 126 blood samples collected from suspected acute hemorrhagic fever with renal syndrome patients ,112 samples were positive for IgM and/or IgG antibodies.Compared with standard strains of Hantavirus (HV)，the sequences analysis and phylogenetic tree indicated that the seven S genes amplified in antibody positive samples were grouped into two Hantaan virus (HTN) ,five Seoul virus(SEO),respectively． The sequence percent identity of all the 7 S genes were 68-98.9% homology.ConclusionOur results showed that there were two subtypes of HV(HTN and SEO) infections in Qingdao district and that SEO may be the dominant common hantanvirus.

Hantavirus;S gene;infection;Hantaan virus;Seoul virus

青島市民生科技計劃項目(14-2-3-12-nsh)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1314-03

R514.5

：A

2017-01-06)