于 新,何成彥，魏學(xué)峰,郭鐘賀,黃紅蘭*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)系，吉林 長春130021)

通遼地區(qū)大腸埃希菌耐藥性與Ⅰ類整合子關(guān)系研究

于 新1,何成彥1，魏學(xué)峰2,郭鐘賀2,黃紅蘭2*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)系，吉林 長春130021)

目的了解通遼地區(qū)大腸埃希菌臨床分離株中I類整合子分布情況及基因盒類型，初步探討耐藥與整合子之間的關(guān)系。方法收集2013年10月-2014年3月通遼市某醫(yī)院的非重復(fù)菌株作為試驗(yàn)菌株，采用Kirby-Bauer紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；采用PCR方法擴(kuò)增Ⅰ類整合酶基因，在此基礎(chǔ)上擴(kuò)增Ⅰ類整合子可變區(qū)，對(duì)部分基因盒陽性菌株測序并分析。結(jié)果99株大腸埃希菌臨床分離株對(duì)所試23種抗生素中的13種耐藥率高于50%，主要為對(duì)青霉素、磺胺類藥物、頭孢菌素等；Ⅰ類整合酶檢出55株，檢出率為55.56%；基因盒攜帶有36株，攜帶率為65.46%；共檢出4種基因盒，共兩種組合形式arr-3-dfrA27和dfrA17-AadA5。結(jié)論大腸埃希菌的耐藥性與Ⅰ類整合子的存在有很大關(guān)系，dfrA17-AadA5是常見的基因盒組合形式。

大腸埃希菌；耐藥性；整合子

(ChinJLabDiagn,2017,21:1316)

大腸埃希菌廣泛存在于自然界中，可引起兒童的腦膜炎、敗血癥、泌尿道感染等多種感染性疾病[1-3]，嚴(yán)重威脅了人類的健康和日常生活。中國作為人均使用抗生素的大國，由于抗生素的大量、不規(guī)范使用，使得大腸埃希菌這類菌群的耐藥機(jī)率，呈現(xiàn)逐年升高現(xiàn)象。整合子是一類可移動(dòng)的基因元件，在耐藥基因的水平傳播中肩負(fù)著至關(guān)重要的任務(wù)[4]。本研究通過認(rèn)識(shí)通遼相關(guān)區(qū)域臨床大腸埃希菌株Ⅰ類整合子的分布情況及耐藥基因盒的類型，來初步探究Ⅰ類整合子與這些菌株耐藥性之間存在的關(guān)系和相互影響，從而為臨床耐藥研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2013年10月-2014年3月收集于通遼市某醫(yī)院(已排除同一患者同一病患處重復(fù)菌株)，應(yīng)用常規(guī)方法分離鑒定并保存，經(jīng)梅里埃VITEK-2 COMPACT 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏分析系統(tǒng)鑒定。臨床藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922采購自吉林省臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 頭孢唑啉(CFZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢吡肟(FEP)、慶大霉素(GEN)、氨曲南(ATM)、氨芐西林(AMP)、左氧氟沙星(LEV)、頭孢克洛(CEC)、復(fù)方新諾明(STX)、環(huán)丙沙星(CIP)、亞胺培南(IMP)、頭孢哌酮/舒巴坦(CSF)、頭孢西丁(FOX)、美羅培南(MEM)、頭孢曲松(CRO)、哌拉西林(PIP)、阿莫西林/棒酸(AMC)、氨芐西林/舒巴坦(AMS)、頭孢呋辛酯(CFX)、阿米卡星(AMK)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢他啶(CAZ)、四環(huán)素(TCY)(購自英國Oxoid公司)。使用儀器主要有PCR儀(美國賽默飛公司)，凝膠成像儀(上海天能公司)，VITEK-II全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀(法國生物梅里埃公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn) 采用 Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法對(duì)分離鑒定的實(shí)驗(yàn)菌株行抗菌藥物的敏感性檢測，根據(jù)CLSI/NCCLS2005 年標(biāo)準(zhǔn)判斷細(xì)菌的耐藥情況。

1.2.2 大腸埃希菌總DNA提取 采取水煮法[5]提取菌株中的總DNA分子，分裝后-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 測試Ⅰ類整合子-基因盒系統(tǒng)及耐藥基因序列分析結(jié)果 按照參考文獻(xiàn)[6,7]設(shè)計(jì)引物，用以擴(kuò)增Ⅰ類整合酶與Ⅰ類整合子可變區(qū)，引物序列見表1。反應(yīng)體系：2×Master Mix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃ 1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳運(yùn)行110v 30 min后EB(溴化乙錠)染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察目的條帶。

表1 PCR引物序列

1.2.4 Ⅰ類整合子-基因盒中耐藥基因分析 隨機(jī)選取4株基因盒陽性菌株(j53、j49、j48、j57)的PCR產(chǎn)物，交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，得到的測序結(jié)果，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核酸序列同源性分析(BLASTn)。

2 結(jié)果

2.1 菌株藥物敏感試驗(yàn)的檢測結(jié)果

在所試抗菌藥物中，99株大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類抗生素如美羅培南和亞胺培南等敏感度較高，其耐藥率為5%和7%；對(duì)氨芐西林耐藥率高達(dá)83%；而對(duì)頭孢呋辛、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氨芐西林/舒巴坦等的耐藥率，則超過了50%。具體耐藥結(jié)果見表2。

2.2 含Ⅰ類整合酶的菌株篩選結(jié)果

以483 bp處出現(xiàn)條帶判定該菌株為含有Ⅰ類整合酶的陽性菌株，若無條帶出現(xiàn)則判定為不含有Ⅰ類整合酶。99株菌中，共有55株(陽性率55.56%)在約500 bp處出現(xiàn)特異性條帶，提示其所對(duì)應(yīng)菌株可能攜有Ⅰ類整合子。PCR產(chǎn)物部分電泳圖見圖1。

M：DL2000 Maker j47-j60：大腸桿菌

2.3攜有Ⅰ類整合子-基因盒大腸埃希菌菌株的耐藥分析

以前面獲得的這55株菌株的DNA分子作為反應(yīng)模板，以表1中的引物擴(kuò)增Ⅰ類整合子的可變區(qū)，共出現(xiàn)36個(gè)Ⅰ類整合子陽性菌株(陽性率36.4%)，大小均在1 000 bp-2 000 bp之間，這些菌株中，其中19株菌株未檢出基因盒。分析基因盒攜帶與否與大腸埃希菌耐藥率之間的關(guān)系(見表3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，比較23種抗菌藥物的耐藥情況，基因盒陰性的菌株耐藥率普遍低于陽性菌株。經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn)可見，兩組大腸埃希菌對(duì)于氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、頭孢呋辛、阿莫西林/棒酸、左氧氟沙星、氨曲南、阿米卡星的耐藥性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。任意選取4株耐藥相關(guān)基因盒陽性菌株的PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)BLASTn比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，四株菌中均含有不同種類的耐藥基因盒，j53株含arr-3與dfrA27，j57、j49均攜帶dfrA17和AadA5?？梢奷frA17-AadA5是所測菌中比較常見的耐藥基因攜帶形式。

表2 99株大腸埃希菌耐藥情況統(tǒng)計(jì)分析

表3 基因盒陽性菌株耐藥分析

3 討論

從全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)站提供的數(shù)據(jù)不難看出，在近年來大力控制抗生素用藥的背景下，臨床分離大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類和碳青霉烯類以及三代頭孢菌素等的耐藥程度有所降低，但同比世界其他國家，我國仍處于較高的耐藥水平，說明控制臨床抗生素的耐藥情況任重道遠(yuǎn)，需要全國范圍的醫(yī)務(wù)人員共同努力，嚴(yán)格把關(guān)。整合子作為天然的水平轉(zhuǎn)移元件，不但可以跨過種屬，更可以在細(xì)菌與真菌中介導(dǎo)耐藥基因之間的傳遞[8]。在本研究中，99株大腸埃希菌的菌株，對(duì)所試23種抗生素其中13種抗生素的耐藥率均超過50%，對(duì)亞胺培南和美羅培南兩者較敏感，但耐藥程度仍大于國內(nèi)其它報(bào)道[9]。目前比較常見的與大腸埃希菌耐藥緊密相連的整合子有3類，本文主要探究了Ⅰ類整合子-基因盒在這一過程中的作用。通過PCR技術(shù)篩選出55株大腸埃希菌含有Ⅰ類整合酶，陽性率為55.56%，與國內(nèi)報(bào)道基本相近[10]，說明在抗生素大量使用這種社會(huì)環(huán)境下，細(xì)菌耐藥性的形成在人群中具有普遍性。PCR擴(kuò)增Ⅰ類整合酶陽性菌株的Ⅰ類整合子可變區(qū)時(shí)，36株菌株為陽性結(jié)果，基因盒陽性菌株的耐藥率普遍高于陰性菌株，通過4株大腸桿菌整合子可變區(qū)測序結(jié)果分析顯示，本實(shí)驗(yàn)中共出現(xiàn)arr-3、dfrA27、dfrA17和AadA5四種基因盒，有兩種組合方式，其中dfrA17-AadA5的組合形式比較常見，有arr-3 利福平ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶，dfrA17編碼二氫葉酸還原酶，介導(dǎo)磺胺類藥物甲氧芐啶耐藥，AadA5編碼鏈霉素3’-腺苷?；D(zhuǎn)移酶,介導(dǎo)對(duì)鏈霉素、慶大霉素等的耐藥，可發(fā)現(xiàn)其中攜帶的基因盒類型與藥敏試驗(yàn)結(jié)果不太符合，間接說明了整合子只是參與了細(xì)菌耐藥機(jī)制的形成過程，而細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥的分子機(jī)制是受多種因素共同作用。

隨著抗生素最后一道防線多粘菌素的突破，超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)警示了合理用藥的迫切需要。本文初步探討了大腸埃希菌耐藥與Ⅰ類整合子-基因盒之間密切關(guān)系，為更深入了解細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制和抗菌新藥物的研究與發(fā)現(xiàn)提供更多可靠依據(jù)。

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Correlationofantimicrobialresistancepatternswithclass1integronsinEscherichiacoliisolatesfromTongliaoarea

YUXin,HECheng-yan,WEIXue-feng,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo understand the distribution situation of class 1 integrons and Gene cassette type,inquire the relation between antimicrobial and resistance patterns.MethodsCollect non-repetitive strains in Tongliao Hospital from Oct.,2013 to Mar.2014 as trial bacterial strain,and use K-B method for drug sensitive tests,and use PCR method to amplify the class 1 integrons.And then use the result to amplify class 1 integron variable region and analyze the partial gene cassette positive strains.ResultsAntimicrobial susceptibility testing revealed that among the 99 clinical escherichia coli,there is more than 50% (>50%) of the isolates were resistant to 13 out of 23 antibiotics tested in this study,mainly is against penicillin,sulfonamide,cephalosporin and etc.PCR and DNA sequencing analysis revealed the presence of class I integrons is 55 isolates,i.e.relevance ratio 55.6%;gene cassettes of class I integrons is 36 isolates,i.e.carrier ratio 65.46%;there are 4 types of gene cassettes been tested,combined in 2 patterns,one was dfrA17 and aadA5,the other was aar-3 and dfrA27.ConclusionThe resistance of escherichia coli exhibited significant impact on the expression level of class I integrase,dfrA17 and aadA5 is a common form of gene cassettes combination.

Escherichia coli;Antibiotic Resistance;Integron

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1316-04

R378.2+1

：A

2016-03-22)