李亞麗， 高文惠*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊，050000；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊，050000）

檢測分析

高效液相色譜-DAD法檢測飼料中苯基脲類農(nóng)藥殘留

李亞麗1，2， 高文惠1，2*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊，050000；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊，050000）

本文建立了用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（HPLC-DAD）測定飼料樣品中苯基脲類農(nóng)藥殘留分析方法。測定中使用C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為乙腈和水，采用溶劑梯度結(jié)合波長和流速梯度等洗脫技術(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：6種農(nóng)藥在20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基線分離，線性相關(guān)系數(shù)≥0.9990，檢出限為0.2～1.0 mg/L，平均回收率為83.6%～93.9%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.24%～4.64%，該方法操作簡單，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

飼料；苯基脲類農(nóng)藥；殘留；高效液相色譜法；二極管陣列檢測器

苯基脲類除草劑(PUHs)廣泛應(yīng)用于不同農(nóng)作物芽前和苗后的一年生雜草，包括防除葡萄、甘蔗、棉花和大田作物中的單子葉和雙子葉雜草。苯脲類除草劑屬水溶性化合物，其在使用過程中的殘留很容易通過遷移進(jìn)入地表水和地下水中，對水源造成污染（金晶等，2017）。并且這類化合物降解速度較慢，通?？纱嬖诎肽曜笥摇Ｑ芯勘砻?，這類除草劑對人類有不同程度的毒性，有的甚至有致癌作用（熊力等，2012），因此對苯脲類除草劑進(jìn)行檢測非常重要，尤其是飼料中的農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題，不僅會嚴(yán)重影響國內(nèi)農(nóng)畜產(chǎn)品在國際市場中的競爭力，還會對人們的身體健康造成一定的危害，因此，飼料中農(nóng)藥殘留問題應(yīng)引起人們的足夠重視（烏仁圖雅等，2014；崔淑華等，2013）。

農(nóng)藥殘留常用的檢測方法有近紅外光譜技術(shù)（孫露萍等，2013）、氣相色譜法（張妮等，2014）、氣相色譜-質(zhì)譜法(代飛飛等，2014)、高效液相色譜法 （何叢薇等，2015）、高效液相色譜-質(zhì)譜法等（Golge 等，2015；趙樺林等，2013）、超臨界流體色譜法（陳靜，2015）、毛細(xì)管電泳色譜法（劉興中，2014）、凝膠滲透色譜法（李軍明等，2010）等。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜 (HPLC)-二極管陣列檢測器(DAD)法，利用DAD的可變波長功能，結(jié)合波長、流速和溶劑梯度對飼料中的多種農(nóng)藥殘留進(jìn)行靈敏、快速的分離與檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 LC-1260型高效液相色譜儀 （安捷倫科技有限公司）；SK5200LHC型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲器有限公司）；LD-52A低速離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）；PHS-3C型pH計(jì) （上海精密儀器有限公司雷磁儀器廠）；Millipore Synergy-超純水機(jī)（法國Millipore公司）。

1.1.2 材料 甲醇和乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：丁噻隆（純度≥99%）、枯莠?。兌取?9%），美國Accustandard工業(yè)公司；綠麥隆（純度≥99%）、非草隆（純度≥99%）、甲氧?。兌取?9%）、滅草?。兌取?9%），美國阿拉丁工業(yè)公司。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取丁噻隆、綠麥隆、非草隆、甲氧隆、滅草隆、枯莠隆各150 mg，用乙腈溶解后分別定容于100 mL容量瓶中。

樣品：豬飼料、牛飼料和雞飼料（市售）。

1.2 樣品處理 稱取5.000 g樣品，研磨后用30 mL甲醇提?。ㄌ崛纱危看?5 mL），超聲20 min，于4000 r/min離心5 min，合并2次上清液，定容至30 mL，混勻，取10 mL過0.45μm微孔濾膜，超聲脫氣后備用（高林等，2015）。

1.3 色譜條件 色譜柱：Accurasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相是乙腈-水的二元溶液。采用溶劑梯度、流速梯度和波長梯度相結(jié)合的方式，具體見表1和表2。柱溫為25℃；進(jìn)樣量為20μL。

表1 溶劑梯度和流速梯度程序

表2 波長梯度參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇 HPLC-DAD法具有適用性廣、分辨率高、靈敏度好等優(yōu)勢，已經(jīng)被廣泛用于樣品中農(nóng)藥殘留的檢測。眾所周知，最佳檢測波長的確定是HPLC-DAD色譜條件選擇中非常重要的一個環(huán)節(jié)，確定最佳檢測波長方能確保在該波長下目標(biāo)物有最大的吸收。研究表明，苯基脲類農(nóng)藥常用的檢測波長為240 nm，但是所測6種成分的最大吸收波長是不相同的，為保證各成分在最大吸收波長處檢測，提高靈敏度，減少干擾，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)各種物質(zhì)的出峰時間和最大吸收波長設(shè)置了波長梯度，見表2。

2.2 流動相及流速的選擇 本實(shí)驗(yàn)研究了甲醇-水和乙腈-水這兩種流動相對6種苯基脲類農(nóng)藥分離的影響，以甲醇-水為流動相時，目標(biāo)物質(zhì)峰形較差，且丁噻隆和甲氧隆會出現(xiàn)不同程度的重疊，無法實(shí)現(xiàn)良好分離。當(dāng)使用乙腈-水作流動相時，目標(biāo)物質(zhì)峰形較好，但是當(dāng)乙腈-水的比例是45∶55（體積比）恒溶劑洗脫時，雖然6種苯基脲類農(nóng)藥出峰較快，但丁噻隆和甲氧隆無法實(shí)現(xiàn)分離，見圖1a；而當(dāng)乙腈-水的比例是35∶65（體積比）恒溶劑洗脫時，6種苯基脲類農(nóng)藥雖能實(shí)現(xiàn)分離，但保留時間偏長，其分離結(jié)果如圖1b所示。因此本實(shí)驗(yàn)采用溶劑梯度和流速梯度洗脫技術(shù)，可以將6種苯基脲混合標(biāo)準(zhǔn)樣品有效分離，見圖1c。

圖1 流動相及流速的選擇

2.3 線性關(guān)系和檢出限 將6種苯基脲類農(nóng)藥分別配制成質(zhì)量濃度為0.01～200 mg/L的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用1.3中的條件對一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。以濃度x對所測物質(zhì)的峰面積y作圖，則得到線性方程以及線性相關(guān)系數(shù)，如表3所示。

檢出限是指在規(guī)定的某種條件下，樣品中的被測物能夠被檢出的最低含量，用于考察檢測方法靈敏度的大小。檢出限一般是信噪比大于等于3（S/N≥3）。各物質(zhì)的檢出限如表3所示。

表3 6種苯基脲線性關(guān)系及檢出限

2.4 樣品測定 飼料樣品按照1.2中方法處理，在1.3色譜條件下進(jìn)行測定，其色譜分離如圖2所示，在雞飼料、豬飼料和牛飼料中未檢出此6種農(nóng)藥。

圖2 飼料樣液色分離譜圖

2.5 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 對豬飼料、牛飼料和雞飼料樣品在低水平和高水平2個添加水平下，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。平均回收率為83.6% ～93.9%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.24%～4.64%（n=5）。說明本方法對苯基脲類農(nóng)藥的回收率較高，精密度好。

表4 加標(biāo)回收率和精密度(n=5)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了采用波長、溶劑和流速梯度相結(jié)合的技術(shù)同時分離檢測6種農(nóng)藥殘留的HPLC-DAD法。6種農(nóng)藥在20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基線分離，其線性相關(guān)系數(shù)≥0.9990，檢出限為0.2～1.0 mg/L，平均回收率為83.6%～93.9%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.24% ～4.64%(n=5)。該方法靈敏、準(zhǔn)確、簡便、快速，可用于飼料及其他樣品中多種農(nóng)藥的檢測。

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A method for the determination of phenylurea pesticide residue in feeds was developed using high performance liquid chromatography-diode array detection（HPLC-DAD）.C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm） was used，mobile phase was acetonitrile and water，solvent gradient was combined with wavelength gradient velocity gradient.The results showed that the six kinds of pesticides were achieved complete separation within 20 min，the correlation coefficients were over 0.9990，the detection limits were 0.2～ 1.0 mg/L，the average recoveries of the spiked samples were 82.4% ～ 97.3%，the relative standard deviations （RSD） were 1.25% ～ 5.13%.The method was simple，sensitive，accurate and reliable.

feed；phenylurea pesticide；residue；high performance liquid chromatography；diode array detector

S816.17

A

1004-3314（2017）17-0024-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171706

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（16275503D）；河北省食品藥品監(jiān)督管理局食品藥品安全科技計(jì)劃項(xiàng)目（ZD2015015）*通訊作者