李維娟 朱娜

論 著

直接上游法與梯度離心結(jié)合上游法優(yōu)選精子的比較研究

李維娟 朱娜

目的應用直接上游法和梯度離心結(jié)合上游法處理不明原因不孕患者的精液，探討兩種優(yōu)選精子的方法。方法回顧性分析2015年1月至2016年12月在我中心接受體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術(shù)助孕的夫婦1 329對，分別采用直接上游法和密度梯度離心結(jié)合上游法進行精液標本的優(yōu)選，對照分析兩組卵子的受精率。結(jié)果直接上游法檢測501個周期，獲得卵子5 251枚，受精率為75.29%；密度梯度離心結(jié)合上游法檢測828個周期，獲得卵子8 753枚，受精率79.32%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論通過兩種方法的比較分析，密度梯度離心結(jié)合上游法可以明顯提高卵子的受精率。

直接上游法； 密度梯度離心法結(jié)合上游法； 受精率

近年來，隨著生育年齡的增加，不孕癥患者在逐年增多，有研究指出10%～15%的育齡夫婦存在不孕不育問題［1］，而男性不育占其中的30%～40%［2］。男性不育主要通過精液常規(guī)檢查、精子形態(tài)學和DNA碎片化指數(shù)等指標來進行判斷［3］。隨著輔助生殖實驗室技術(shù)的不斷完善和成熟，各種精液優(yōu)化處理方式不斷出現(xiàn)，最常見的為上游法和密度梯度離心法。密度梯度離心法可以更好地去除精液中的雜質(zhì)及碎片，回收更多的精子，但相對于上游法其回收后的精子畸形率過高，該方法更適用于少弱精子癥患者［4］；上游法可分離獲得活力更高的精子，但回收效率較低，該方法更適用于精液常規(guī)檢查結(jié)果正常及較好的患者［5］。本中心自2015年起嘗試采用梯度離心結(jié)合上游的方法處理精液標本，并與直接上游法進行了對比分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2015年1月至2016年12月在新疆佳音醫(yī)院生殖醫(yī)學中心接受體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術(shù)助孕的1 329對夫婦，取卵當天的精液標本經(jīng)檢查各項指標均符合IVF-ET的標準。

1.2 研究方法

1.2.1 分組 將1 329份精液標本依據(jù)精液處理方法不同分為兩組：A組為直接上游法；B組為密度梯度離心結(jié)合上游法。

1.2.2 精液處理方法［6］

1.2.2.1 直接上游法 ① 充分混勻精液標本，并常規(guī)分析其各項指標（體積、濃度、活率等）；② 將1 mL的Hapes液置于試管底部，小心地將1 mL精液加到Hapes液下方，注意保持液體的分界面；③ 將試管傾斜45°，置37 ℃孵育60 min后，將最上面1 mL培養(yǎng)液移置另一試管中，并加2 mL Hapes液114×g離心5 min洗滌1次，棄上清液；④ 將沉淀重新混勻后懸浮于1 mL的Hapes液中備用。記錄精子活率和精子正常形態(tài)。

1.2.2.2 梯度離心結(jié)合上游法 ① 先后將80%和40%的梯度液各1.5 mL置于離心管中，注意保持液體分界面；② 充分混勻精液標本，并常規(guī)分析其各項指標（體積、濃度、活率等）；③ 小心地將混勻后的精液2～3 mL加在配置好的梯度液面上，注意保持液體的分界面，114×g離心20 min，棄上清液；④ 用2 mL Hapes培養(yǎng)液重新混勻精子沉淀，114×g離心5 min，棄上清液；再用2 mL Hapes培養(yǎng)液混勻精子沉淀，114×g離心5 min，棄上清液后混勻精子沉淀； ⑤ 將混勻后的精子沉淀液1 mL小心地加到1 mL的Hapes培養(yǎng)液下方，并注意保持液體的分界面，再次置于37 ℃孵育120 min備用。記錄精子活率和精子正常形態(tài)。

1.2.3 試劑 本文中的Hapes液和80%和40%梯度液為美國SAGE公司生產(chǎn)的成品。Hapes培養(yǎng)液為9 mL Hapes液+ 1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）混合而成。

1.3 檢測受精率 受精率＝總受精卵數(shù)/總獲卵數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以例（%）表示，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，各組間比較采用χ2檢驗進行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 IVF的適應證 女方輸卵管性不孕、排卵障礙、子宮內(nèi)膜異位癥、免疫性不孕，男方輕度少精癥、弱精癥或畸精癥，原因不明性不孕且經(jīng)其他助孕治療多次失敗者。

2 結(jié)果

2.1 不同精液優(yōu)化處理方式前后精子活率和精子正常形態(tài)的比較 處理前，A組和B組的精子活率和精子正常形態(tài)相當（均P＞0.05），處理后，兩組精子活率和精子正常形態(tài)有不同程度的升高，B組略高于A組，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 不同精液優(yōu)化處理方式前后精子活率和精子正常形態(tài)（≥4%）的比較

2.2 不同精液優(yōu)化處理方式對受精率的影響 A組受精率為75.29%，B組受精率為79.32%，A組與B組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 1 329例IVF周期數(shù)受精率在不同檢測方法A、B兩組間的數(shù)據(jù)對比

3 討論

眾所周知，影響卵子受精的因素有很多，比如精子本身的質(zhì)量、卵子的因素以及其他未知的一些因素。但不可否認，更多、更好的前向運動且獲能良好的精子，是常規(guī)體外受精中卵子受精的基礎，而精液的預處理則是達到這一目的的重要手段［7-9］。在精液處理的方法中，直接上游法是利用精子自身的運動能力將活動精子從精液中分離出來，可以獲得活動能力良好的精子，同時精子在上游的過程中獲能。直接上游法操作簡單易掌握，但不易標準化，操作周期長不易統(tǒng)一。而密度梯度離心法則是借助活動精子的運動和各類細胞的密度差異來分離精子，從而可以獲得更多的、質(zhì)量良好的精子，再將這些質(zhì)量良好的精子上游，使其可以再次獲能。相比直接上游法，密度梯度離心法結(jié)合上游法操作更容易標準化，操作周期也大大縮短。更主要的是，密度梯度離心結(jié)合上游法可以在統(tǒng)一的時間內(nèi)完成精液的優(yōu)選過程，這樣就能有效地掌控加精時間。因為在目前的IVF-ET中，短時受精已經(jīng)被大家普遍認可。這是由于短時受精不僅符合正常人體的受精過程，而且短時受精也有利于在出現(xiàn)受精失敗后的補救，從而可以有效地提高體外受精中卵子的受精率。對于短時受精，統(tǒng)一的加精時間不僅有利于操作和掌控，也有利于受精的判斷。密度梯度離心結(jié)合上游法雖然操作過程較為繁瑣但僅從本中心的臨床效果來看，其對提高受精率具有明顯效果。

綜上所述，在輔助生育技術(shù)中，精液的不同優(yōu)選方法在卵子受精過程的重要性不言而喻，本中心采用密度梯度離心結(jié)合上游法進行精子優(yōu)選的方法，主要依據(jù)是：不僅可以利用密度梯度離心法優(yōu)選出更多、更好的精子，同時利用上游法使其能充分獲能，這樣就使卵子的受精有了一個重要的保障。雖然梯度離心結(jié)合上游法的操作過程稍顯繁瑣，不易掌握，但只要通過一段時間的培訓和訓練就基本能夠掌握。所以，密度梯度離心結(jié)合上游法是值得臨床應用的一個精子優(yōu)選方法。

1 張劍波，尹國良，徐新蓉，等.不育門診就診男性精液質(zhì)量與影響因素分析［J］.生殖醫(yī)學雜志，2015，24（12）：1041-1044.

2 Varshini J，Srinag BS，Kalthur G，et al. Poor sperm quality and advancing age are associated with increased sperm DNA damage in infertile men［J］. Andrologia， 2012，44 Suppl 1：642-649.

3 李媛.人類輔助生育實驗技術(shù)［M］.北京：科學出版社，2008.

4 朱立華，肖新燕，許玉剛，等.密度梯度離心方式對人工授精結(jié)局的影響［J］.中國男科學雜志，2016，30（2）：17-20,25.

5 張紅，馬博.兩種不同的上游法處理精液對常規(guī)體外受精結(jié)果的影響［J］.中國醫(yī)藥導報，2010，7（33）：46-47.

6 谷翊群，等. WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊［M］. 5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.

7 中華人民共和國衛(wèi)生部.人類輔助生殖技術(shù)規(guī)范［M］.北京：中華人民共和國衛(wèi)生部.

8 黃國寧.體外受精-胚胎移植實驗室技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012.

9 王一飛. 21世紀的精液分析技術(shù)：現(xiàn)狀·爭議·展望［J］.國際生殖健康/計劃生育雜志，2010，29（3）：131-132.

A comparative study on the optimum spermatozoa of direct upstream and gradient centrifugation

Li Weijuan, Zhu Na. Xinjiang Jiayin Hospital, Urumqi 830001, Xinjiang, China (Li WJ); Xinjiang Fourth People's Hospital, Urumqi 830000, Xinjiang, China (Zhu N)

ObjectiveTo study the semen of two infertile patients with unexplained infertility by direct upstream method and gradient centrifugation combined with upstream method.MethodsA retrospective analysis was performed on 1 329 pairs of patients who received in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET) in our center from January 2015 to December 2016. The patients were treated with direct upstream method and density gradient centrifugation combined with upstream method for semen samples. Fertilization rate of two groups of eggs were compared.ResultsFive hundred and one cycles were detected by direct upstream method, and 5 251 eggs were obtained. The fertilization rate was 75.29%. The density gradient centrifugation combined with upstream method was 828 cycles, and 8 753 eggs were obtained. The fertilization rate was 79.32%. The difference between the two groups was statistically significant (P ＜ 0.05).ConclusionBy comparing the two groups, the density gradient centrifugation combined with the upstream method can significantly improve the fertilization rate of the egg.

Direct upstream method; Density gradient centrifugation combined with upstream method;Fertilization rate

2017-07-03）

（本文編輯：楊程伍 李銀平）

830001 新疆烏魯木齊，新疆佳音醫(yī)院（李維娟）

830000 新疆烏魯木齊,新疆第四人民醫(yī)院（朱娜）

李維娟，Email：1297800451@qq.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2017.03.018

Corresponding author: Li Weijuan, Email: 1297800451@qq.com