楊永輝，李輝，朱桂云，李秀武，陳寧，任雪飛

[河北省胸科醫(yī)院（河北省肺癌防治研究中心），河北 石家莊 050041]

建立基于脫氧次黃嘌呤核苷修飾等位基因PCR方法檢測(cè)EGFR基因熱點(diǎn)突變*

楊永輝，李輝，朱桂云，李秀武，陳寧，任雪飛

[河北省胸科醫(yī)院（河北省肺癌防治研究中心），河北 石家莊 050041]

目的建立基于脫氧次黃嘌呤修飾等位基因特異熒光聚合酶鏈反應(yīng)（dI-AS-PCR）方法，檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因熱點(diǎn)突變L858R和19del（2235～2249，2236～2250）。方法設(shè)計(jì)包含擴(kuò)增EGFR基因L858R和19del熱點(diǎn)突變?cè)趦?nèi)的特異性引物、熒光探針和內(nèi)參體系；且特異檢測(cè)基因突變的等位基因PCR引物3’-末端n-1或n-2位置采用脫氧次黃嘌呤（dI）修飾。建立標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控樣品，應(yīng)用熒光PCR檢測(cè)，并分析結(jié)果。結(jié)果dI-AS-PCR能夠在野生型背景下檢測(cè)低于0.1%的突變，對(duì)50例肺癌臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，有9例（18%）EGFR基因發(fā)生L858R突變，14（28%）例19del基因突變。EGFR基因熱點(diǎn)突變率為46%，其檢測(cè)結(jié)果與DNA測(cè)序完全一致。結(jié)論基于dI-AS-PCR技術(shù)的特異熒光PCR檢測(cè)EGFR基因熱點(diǎn)突變，敏感性高，特異性強(qiáng)，可以應(yīng)用于臨床EGFR基因突變檢測(cè)，指導(dǎo)個(gè)性化用藥及酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療耐藥監(jiān)測(cè)。

EGFR熱點(diǎn)突變；等位基因PCR；脫氧次黃嘌呤；肺癌

Abstract:ObjectiveTo establish a method to test the mutations ofEGFRgene hotspots L858R and 19 del (2235-2249,2236-2250)based on deoxyinosine-modified allele-specific PCR (dI-AS-PCR).MethodsA dI-ASPCR primer system was designed to detect the mutations ofEGFRgene hotspots(L858R and 19 del),which included specific primers modified by deoxyinosine at the n-1 or n-2 position of the primer 3'-terminal,fluorescent probe and internal control primers.Standard substance and quality control samples were built and analyzed by the dI-AS-PCR system.ResultsThe detection limit of dI-AS-PCR was less than 0.1%under the background of wild type template.The dI-AS-PCR system was used to screen 50 lung cancer samples,in which 9 samples(18%)had L858R mutation ofEGFRgene and 14 cases(28%)had 19 del mutation.The hotspot mutation rate ofEGFRgene was 46%,which was consistent with the results of DNA sequencing(P＞0.05).ConclusionsThe dI-AS-PCR is a sensitive and specific assay,which could be widely used to detectEGFRmutations,guide patient-specific treatment and monitor the drug resistance of TKI-therapy in clinic.

Keywords:EGFRgene hotspot mutation;allele specific PCR;deoxyinosine;lung cancer

肺癌是當(dāng)今最常見的惡性腫瘤之一，也是高致死率的癌癥之一，其中80%～85%的患者為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancers，NSCLC）[1-2]。《2012中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》報(bào)道，我國(guó)癌癥發(fā)病率和死亡率分別為286/10萬(wàn)和181/10萬(wàn)，相當(dāng)于每分鐘就有5、6個(gè)人確診為癌癥，平均每5位癌癥患者3個(gè)人死亡。在所有的腫瘤類別中，肺癌發(fā)病率和死亡率在我國(guó)高居第一，高達(dá)54/10萬(wàn)和45/10萬(wàn)，換句話說，每分鐘確診的6位癌癥患者中，就有一個(gè)是肺癌，死亡率極高；而且我國(guó)癌癥的發(fā)病率持續(xù)升高，2003～2009年6年間，癌癥的發(fā)病率上升一半以上（57%）[3]。

大多數(shù)肺癌患者被確診時(shí)已經(jīng)是晚期，采用傳統(tǒng)化療方案以化學(xué)藥物實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的殺傷或抑制，在治療過程中不可避免會(huì)對(duì)正常組織和器官造成極大地?fù)p傷[4]。同時(shí)給患者帶來(lái)極大的身心痛苦，也增加了患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，臨床的治療成功率以及治療后5年存活率效果并不佳[3-5]。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine kinase inhibitor，TKI）在非小細(xì)胞肺癌治療中日漸突出[6-9]；TKI能特異的殺傷腫瘤細(xì)胞，效果顯著。但并非所有的患者都能從TKI治療中獲益，研究表明，攜帶EGFR基因18～21外顯子基因突變患者接受TKI治療效果顯著[10-11]。因此，TKI治療前檢測(cè)EGFR基因突變十分必要。

目前檢測(cè)EGFR基因突變方法很多，等位基因特異聚合酶鏈反應(yīng)（allele specific PCR，AS-PCR）、突變擴(kuò)增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）又稱等位基因特異性擴(kuò)增法（allele specific amplification，ASA）、高分辨率溶解曲線分析（high-resolution melting，HRM）和基因測(cè)序等[12-15]。本文建立基于脫氧次黃嘌呤修飾的等位基因聚合酶鏈反應(yīng)（deoxyinosine modified specific allele PCR，dI-AS-PCR）方法檢測(cè)EGFR基因突變，在等位基因PCR引物3'-末端n-1或n-2位置采用脫氧次黃嘌呤（dI）修飾替代。dI為天然存在的堿基，常用于簡(jiǎn)并性引物中，在DNA聚合酶作用下能與A、G、C和T堿基結(jié)合；但共價(jià)結(jié)合力很弱。本研究探討在等位基因PCR引物中引入dI修飾后對(duì)其檢測(cè)能力的影響，從而驗(yàn)證dI-AS-PCR檢測(cè)EGFR基因熱點(diǎn)突變的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

dNTP（美國(guó)Promega公司），AmpliTaq Gold?DNA Polymerase（美國(guó)ABI公司），T-載體（PMD18-T Vector，日本TaKaRa公司）,DH5α（日本TakaRa公司），TB-DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品（1×107～1×104個(gè)/ml，中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），DNA定量試劑盒（熒光法）（美國(guó)Sigma公司），人EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（中國(guó)雅康博生物科技有限公司），Eppendorf核酸蛋白定量?jī)x（D30，德國(guó)Eppendorf公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（LightCycler?480II qRT-PCR系統(tǒng)，瑞士Roche公司）。

1.2 dI-AS-PCR引物及探針設(shè)計(jì)

等位基因PCR引物和探針采用Beacon Designer 8.0設(shè)計(jì)；構(gòu)建質(zhì)粒引物用primer 5設(shè)計(jì)，引物探針由上海輝睿生物技術(shù)有限公司合成（見表1）。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

選用經(jīng) DNA測(cè)序明確EGFR基因 19del（2235～2249，2236～2250）和L858R突變樣本克隆質(zhì)粒。50μl PCR體系包含：50 ng DNA，1×PCR buffer，200 nmol dNTP，3 mmol Mg2+，200 nmol正反向引物（19-Seq-F/R，或21-Seq-F/R），1U AmpliTaq Gold?DNA Polymerase。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋孩倜讣せ睿?5℃10 min；②擴(kuò)增：95℃30 s，55℃50 s，72℃50 s，8個(gè)循環(huán)；隨后95℃50 s，72℃ 50 s擴(kuò)增5個(gè)循環(huán)；最后30個(gè)循環(huán)，95℃30 s，55℃50 s，72℃50 s；③延伸，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像鑒定后經(jīng)產(chǎn)物純化連接至T-載體中，然后經(jīng)DH5α轉(zhuǎn)化、搖菌、質(zhì)粒提取、酶切和測(cè)序鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品

1.4.1 建立質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品Ⅰ 質(zhì)粒濃度首先應(yīng)用Eppendorf核酸蛋白定量?jī)x初步定量，計(jì)算濃度稀釋至105個(gè)/μl備用。然后使用TB-DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用熒光PCR對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行定量，按照熒光PCR定量濃度稀釋突變質(zhì)粒為1×104、1×103、1×102、10、5、3和1個(gè)/μl建立敏感性標(biāo)準(zhǔn)品I。野生型質(zhì)粒依次稀釋至1×106、4×105、1×105、4×104、1×104、4×103和1×103個(gè)/μl建立耐受標(biāo)準(zhǔn)品I備用。

1.4.2 建立質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品Ⅱ 將DNA定量試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至200、100、50、30、15和10 ng/μl構(gòu)建耐受標(biāo)準(zhǔn)品Ⅱ。敏感性標(biāo)準(zhǔn)品Ⅱ：10 ng/μl耐受標(biāo)準(zhǔn)品Ⅱ中分別加入1 000、100、10和5個(gè)突變質(zhì)粒，即相當(dāng)于1萬(wàn)個(gè)野生背景下含有10%、1%、0.1%和0.05%突變。

1.4.3 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)置的10例EGFR突變樣品來(lái)源于北京雅康博生物科技有限公司，其中19del和L858R各5例構(gòu)建測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品。測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品分為3份用于測(cè)試結(jié)果的重復(fù)性。

表1 檢測(cè)EGFR熱點(diǎn)突變的引物和探針

1.5 qRT-PCR

50μl熒光 PCR體系：1×buffer，2.5 mmol Mg2+，250 nmol dNTP，1U DNA聚合酶，2μl DNA模板，80 nmol Ctrl-F，80 nmol Ctrl-R，60 nmol Ctrl-P及各150 nmol的EGFR突變引物和探針。熒光PCR擴(kuò)增條件：95℃，10 min預(yù)變性，95℃30 s，60℃30 s，72℃25 s，循環(huán)15次；再按95℃30 s，64℃40 s，72℃20 s，循環(huán)30次，并于64℃40 s時(shí)采集熒光信號(hào)分析。

1.6 DNA測(cè)序

敏感性標(biāo)準(zhǔn)品Ⅱ DNA測(cè)序：標(biāo)準(zhǔn)品中含有突變質(zhì)粒，因此采用2種方式進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證：①采用19-Seq-F/R和21-Seq-F/R測(cè)序，該方法同時(shí)可以擴(kuò)增野生型DNA和突變質(zhì)粒（Normal-PCR/DNA測(cè)序）；②特異擴(kuò)增耐受標(biāo)準(zhǔn)品中突變質(zhì)粒，采用引物19-Seq-F/Marker-Seq-R和21-Seq-F/Marker-Seq-R（Marker-PCR/DNA測(cè)序）進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像分析純化后送往上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。臨床樣本測(cè)試，采用 19-Seq-F/R和21-Seq-F/R引物擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序。

1.7 臨床樣本檢測(cè)

NSCLC石蠟切片標(biāo)本來(lái)自河北省胸科醫(yī)院，且經(jīng)臨床、影像以及病理診斷為非小細(xì)胞肺癌患者，共50例。其中男性27例，女性23例；腺癌45例，鱗癌5例。標(biāo)本使用經(jīng)過患者及家屬知情同意，遵循醫(yī)院的患者隱私保密規(guī)矩并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 敏感性及耐受范圍

2.1.1 敏感性 為了方便評(píng)價(jià)dI-AS-PCR方法檢測(cè)基因突變，以EGFR基因L858R突變?yōu)檠芯繉?duì)象，同時(shí)設(shè)計(jì)dI-AS-PCR引物（L858R-F）、AS-PCR引物（L858R-F1）和ARMS引物（L858R-F2）進(jìn)行對(duì)比分析。采用敏感性標(biāo)準(zhǔn)品I測(cè)試dI-AS-PCR、AS-PCR和 ARMS，同時(shí)質(zhì)粒熒光 PCR體系（PMD-18-F/R/P）作為陽(yáng)性對(duì)照，PCR陰性對(duì)照為水。研究結(jié)果表明，dI修飾等位基因PCR引物敏感性與AS-PCR基本一致，可以檢測(cè)低至5個(gè)突變，對(duì)于3和1個(gè)檢測(cè)效果并不好；而ARMS的敏感性則只能檢測(cè)10個(gè)左右的突變。因此，AS-PCR引物經(jīng)dI修飾后，敏感性沒有受到干擾（見圖1）。

圖1 dI-AS-PCR、AS-PCR和ARMS的敏感性

2.1.2 耐受范圍 應(yīng)用耐受標(biāo)準(zhǔn)品 I評(píng)價(jià)dI-AS-PCR，40個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性參考，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：ARMS耐受性最好，可以耐受高達(dá)10萬(wàn)個(gè)的野生背景；dI-AS-PCR次之，可耐受4×104個(gè)野生型背景；AS-PCR最高可以耐受4×103個(gè)野生型背景。在同一濃度（1×106、4×105和1×105）條件下，dI-AS-PCR的檢測(cè)結(jié)果（由于PC的值不同，選擇對(duì)各自重復(fù)實(shí)驗(yàn)和濃度下的Ct值與PC差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析）與AS-PCR和ARMS檢測(cè)結(jié)果相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 閾值及檢測(cè)能力

應(yīng)用dI-AS-PCR檢測(cè)DNA樣品前，需要在檢測(cè)EGFR基因突變的體系引入內(nèi)參引物和探針（Ctrl-F/R/P）建立雙重?zé)晒釶CR體系。其目的：①確定是否有待檢測(cè)DNA樣品加入。②指示加入樣品DNA的濃度。運(yùn)用耐受標(biāo)準(zhǔn)品Ⅱ，測(cè)試dI-AS-PCR的耐受性。結(jié)果表明，dI-AS-PCR可以耐受30 ng以上的野生型DNA的干擾?？剂康胶怂岬鞍锥?jī)x定量DNA的誤差，將DNA上樣的濃度標(biāo)準(zhǔn)定為10 ng。

應(yīng)用 dI-AS-PCR、Normal-PCR-DNA測(cè)序、Marker-PCR-DNA測(cè)序和質(zhì)粒熒光PCR（PMDPCR）方法同時(shí)檢測(cè)敏感性標(biāo)準(zhǔn)品Ⅱ，評(píng)價(jià)dI-ASPCR的檢測(cè)能力。結(jié)果表明：Normal-PCR-DNA測(cè)序方法無(wú)法檢測(cè)出敏感性標(biāo)準(zhǔn)品中含有10%以下的突變；通過Marker-PCR DNA測(cè)序再次驗(yàn)證，敏感性標(biāo)準(zhǔn)品中確實(shí)含有EGFR基因突變。dI-ASPCR檢測(cè)結(jié)果與 Marker-PCR DNA測(cè)序和PMD-PCR檢測(cè)結(jié)果一致。見表3。

表2 耐受標(biāo)準(zhǔn)品I測(cè)試dI-AS-PCR

表3 多種方法檢測(cè)敏感性標(biāo)準(zhǔn)品Ⅱ

可以確定在10 ng野生型DNA干擾下，dI-ASPCR可以檢測(cè)0.05%左右的突變。因此本研究以10 ng DNA檢測(cè)樣本為上樣閾值，檢測(cè)EGFR基因突變。

2.3EGFR基因突變的穩(wěn)定性

通過對(duì)構(gòu)建的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)明確的EGFR基因突變樣品10例，其中L858R和19del各5例，分為3等份分別交給3人應(yīng)用dI-AS-PCR檢測(cè)，評(píng)價(jià)其的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，3人檢測(cè)結(jié)果一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），dI-AS-PCR體系檢測(cè)EGFR突變的穩(wěn)定性良好。

2.4 臨床樣本結(jié)果

經(jīng)過多方面測(cè)試，建立了dI-AS-PCR，可以用于檢測(cè)臨床樣本。隨機(jī)收集的50例臨床樣本，應(yīng)用dI-AS-PCR和DNA測(cè)序方法進(jìn)行比較分析，對(duì)檢測(cè)結(jié)果有出入的樣本采用EGFR基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行確認(rèn)分析。經(jīng)檢測(cè)dI-AS-PCR的檢測(cè)結(jié)果與DNA測(cè)序完全一致。隨機(jī)選擇10例應(yīng)用EGFR基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行確認(rèn)檢測(cè)，結(jié)果與dI-AS-PCR和DNA測(cè)序一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

50例臨床樣本中，23例檢測(cè)EGFR基因突變陽(yáng)性，EGFR基因熱點(diǎn)突變率為46%；其中19del 14例（28%），L858R基因突變9例（18%）。且這23例EGFR基因突變樣本均為腺癌，5例鱗癌中未檢測(cè)出基因突變。由于樣本量的限制，本文中EGFR基因突變率并不能反映當(dāng)?shù)卣鎸?shí)NSCLC患者的EGFR基因突變水平。

3 討論

大量的研究表明EGFR基因突變患者接受TKI治療，療效要高于野生型患者[16-19]。因此臨床已經(jīng)建立基于EGFR基因突變類型的NSCLC個(gè)性化靶向治療方案，并在我國(guó)廣泛推廣。目前，提高EGFR基因突變檢測(cè)率的方法主要有2種：一是研究和開發(fā)高敏感的基因突變檢測(cè)技術(shù)；另一種是提高待檢組織腫瘤細(xì)胞的均質(zhì)性，盡可能的獲得均質(zhì)的腫瘤組織，但是受限于取材的影響，這點(diǎn)很難滿足。

因此，提高檢測(cè)方法的檢測(cè)能力是提高突變檢測(cè)率的主要手段，基于此很多基因突變的檢測(cè)方法問世，如：?jiǎn)畏肿訙y(cè)序、變性高效液相質(zhì)譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）[20]、基質(zhì)輔助激光解析離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/Ionization time of flight，MALDI-TOF）[12]等，這些方法操作復(fù)雜，檢測(cè)周期較長(zhǎng)。雖然基因測(cè)序?yàn)镋GFR基因突變檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[21-22]，但是由于其敏感性低[12，23]，操作復(fù)雜[24]，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)推廣的主要是基于AS-PCR或ARMS的EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒，如scropion-ARMS、TaqMan-ARMS以及ADX-ARMS等，其敏感性可達(dá)到1%。

本文補(bǔ)充的一種AS-PCR引物設(shè)計(jì)方法，也可以理解為一種新的ARMS引物設(shè)計(jì)方法。AS-PCR檢測(cè)基因突變，利用Taq DNA聚合酶缺乏3’-5’校正功能，將檢測(cè)突變的堿基設(shè)計(jì)于3'-末端來(lái)檢測(cè)基因突變，由于AS-PCR需要反復(fù)優(yōu)化引物濃度、Taq DNA聚合酶含量、Mg2+濃度及Tm值等。在AS-PCR引物3’-末端n-1或n-2位置人為引入錯(cuò)配的ARMS得到追捧；這樣可以有效地降低野生型模板干擾，但是同時(shí)也降低了敏感性。dI是自然天然存在的堿基，與堿基A、G、C和T均能結(jié)合，結(jié)合力依次為dI∶dC＞dI∶dA＞dI∶dG＞dI∶dT。但是其與堿基共價(jià)結(jié)合能力很弱，引物中引入一定數(shù)量的dI可以有效降低PCR非特異擴(kuò)增，如寡核苷酸引物（Dual Priming Oligonucleotide，DPO）系統(tǒng)。因此本文中，將AS-PCR引物n-1或n-2位置的堿基采用dI修飾替換。經(jīng)dI修飾的AS-PCR對(duì)野生型模板的耐受及特異性有很大的提高，可以耐受104個(gè)以上的野生型模板干擾，同時(shí)敏感性又未受到干擾，可以檢測(cè)低至0.05%的基因突變；應(yīng)用dI-AS-PCR和DNA測(cè)序檢測(cè)50例臨床樣本，其結(jié)果完全一致。

綜上所述，AS-PCR引物中引入dI修飾，不但可以提高引物對(duì)野生型模板的耐受，同時(shí)對(duì)引物系統(tǒng)檢測(cè)的敏感性無(wú)干擾。這樣拓展了AS-PCR有效檢測(cè)范圍。因此dI-AS-PCR可以應(yīng)用于臨床檢測(cè)EGFR基因突變。采用dI修飾的AS-PCR引物無(wú)疑是設(shè)計(jì)等位基因PCR或ARMS檢測(cè)基因突變一個(gè)比較好的選擇。dI-AS-PCR可以推廣于臨床檢測(cè)EGFR基因突變，指導(dǎo)臨床個(gè)性化用藥。

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（張蕾 編輯）

Establishment of a method for detection ofEGFRgene hotspot mutations based on deoxyinosine-modified allele-specific PCR*

Yong-hui Yang,Hui Li,Gui-yun Zhu,Xiu-wu Li,Ning Chen,Xue-fei Ren
(Hebei Lung Cancer Prevention Research Center,Hebei Chest Hospital, Shijiazhuang,Hebei 050041,China)

R734

A

2016-11-28

河北省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)重點(diǎn)跟蹤項(xiàng)目（No：GL2014061）

朱桂云，E-mail：zgyblk@163.com

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.003

1005-8982（2017）22-0013-07