張燕，陸萍，楊淑玲，劉璇，張琳，王一

（上海市普陀區(qū)婦嬰保健院1.病理科，2.婦科，上海 200062）

滋養(yǎng)葉細(xì)胞增殖基因及間質(zhì)細(xì)胞凋亡檢測(cè)在水泡狀胎塊診斷中的價(jià)值*

張燕1，陸萍1，楊淑玲1，劉璇1，張琳2，王一1

（上海市普陀區(qū)婦嬰保健院1.病理科，2.婦科，上海 200062）

目的探討滋養(yǎng)葉細(xì)胞增殖相關(guān)基因及間質(zhì)細(xì)胞凋亡檢測(cè)在水泡狀胎塊（HM）病理診斷中的價(jià)值。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)100例HM（其中完全性HM 61例，部分性HM 39例）及40例絨毛水腫的病理組織標(biāo)本滋養(yǎng)葉細(xì)胞的Ki67、Livin與Bcl-2的表達(dá)，并應(yīng)用TUNEL法對(duì)絨毛間質(zhì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行原位觀察。結(jié)果Ki67陽(yáng)性表達(dá)在絨毛水腫組、部分性HM組、完全性HM組趨勢(shì)呈逐漸增強(qiáng)，各組間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；絨毛水腫組及HM組絨毛間質(zhì)內(nèi)AI指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Livin及Bcl-2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ki67表達(dá)與AI指數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論間質(zhì)細(xì)胞凋亡聯(lián)合滋養(yǎng)葉細(xì)胞中Ki67表達(dá)檢測(cè)可用于HM的診斷與分型，也可用于鑒別HM與絨毛水腫。

HM；Ki67；Livin；Bcl-2

Abstract:ObjectiveTo investigate the value of trophoblastic cell proliferation-related gene and interstitial cell apoptosis in the diagnosis of hydatidiform moles.MethodsImmunohistochemical technique was used to detect the expressions of Ki67,Livin and Bcl-2 in trophoblast cells.TUNEL was used to detect apoptosis of villous stroma cells of 100 cases of hydatidiform moles(including 61 cases of complete hydatidiform moles and 39 cases of partial hydatidiform moles)and 40 cases of villous edema.ResultsThe expression of Ki67 in the trophoblastic cells of the villous edema group,partial hydatidiform mole group and complete hydatidiform mole group gradually increased,the differences among the 3 groups were statistically significant(P＜0.05).There were no significant differences in the expression of Livin or Bcl-2 among the 3 groups(P＞0.05).There was a positive correlation between Ki67 expression and AI index(P＜0.05).ConclusionsThe detection of Ki67 expression in trophoblastic cells and apoptosis in villous stroma cells can be used for the diagnosis and classification of villous edema,partial hydatidiform mole and complete hydatidiform mole.

Keywords:hydatidiform mole;Ki67;Livin;Bcl-2

水泡狀胎塊（hydatidiform mole，HM），又稱為葡萄胎，是我國(guó)最常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥之一，病變主要在于滋養(yǎng)葉細(xì)胞增生及胎盤絨毛過(guò)度生長(zhǎng)，依據(jù)預(yù)后程度，可將HM分為完全性HM與部分性HM 2類，大多數(shù)為良性妊娠滋養(yǎng)葉細(xì)胞病變，但仍有部分患者清除病變組織后轉(zhuǎn)化為惡性HM，嚴(yán)重者可惡化為絨毛膜癌。但更為嚴(yán)峻的問(wèn)題是，截止目前，HM病理學(xué)特征不典型，難以與流產(chǎn)的水腫絨毛區(qū)別，因此如何診斷并分型HM仍是婦產(chǎn)科病理診斷的難題，即使有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師也面臨診斷困難，并且診斷的可重復(fù)性差，造成HM漏診或誤診，引發(fā)分歧并造成醫(yī)療糾紛[1-3]。文獻(xiàn)顯示HM的流產(chǎn)病例中細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖速度較低，增殖活性下降[4]，本院早期針對(duì)HM的形態(tài)學(xué)進(jìn)行了細(xì)致的回顧性研究，發(fā)現(xiàn)絨毛間質(zhì)的核碎片/凋亡小體的出現(xiàn)對(duì)于區(qū)分HM及絨毛水腫差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，部分病理還顯示了滋養(yǎng)層向間質(zhì)內(nèi)折疊呈凹字形，可見(jiàn)HM的增殖/凋亡平衡可能被打破，Ki67是細(xì)胞增殖標(biāo)記物，主要用于鑒別腫瘤增生，近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者著眼于探索Ki67表達(dá)與反應(yīng)性增生病變的關(guān)聯(lián)[5]。Livin與Bcl-2基因?qū)儆诘蛲鲆种苹颍赏ㄟ^(guò)多種途徑抑制細(xì)胞凋亡作用，過(guò)度表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，有利于細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，但兩者在正常組織中幾乎不表達(dá)[6-7]。基于以上論述，本研究挑選HM及絨毛水腫病例應(yīng)用TUNEL法原位檢測(cè)間質(zhì)層細(xì)胞凋亡，免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)滋養(yǎng)葉細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67及凋亡相關(guān)蛋白Livin、Bcl-2表達(dá)，初步探討2種細(xì)胞的增殖及凋亡狀況與HM的關(guān)系，為診斷并分型HM提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

經(jīng)院內(nèi)倫理委員會(huì)同意，收集2006～2013年上海市普陀區(qū)婦嬰保健院經(jīng)常規(guī)病理診斷為HM的病例100例，另隨機(jī)挑選自然流產(chǎn)常規(guī)病理診斷為絨毛水腫的病例40例為對(duì)照組。所有病例經(jīng)p57kip2及CD34免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的婦科病理醫(yī)師共同確定診斷并進(jìn)一步對(duì)100例HM進(jìn)行分型，完全性HM 61例，部分性HM 39例。

1.2 試劑

兔抗人Ki67單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司，克隆號(hào)：SP6）、Bcl-2單克隆抗體（美國(guó)Abnova公司，克隆號(hào)：SP66）和兔抗人Livin多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司，克隆號(hào)：ab97350）均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；凋亡檢測(cè)試劑盒（英國(guó)abcam公司，克隆號(hào)：QIA33-1EA）購(gòu)自艾博抗上海貿(mào)易有限公司。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

全部標(biāo)本均為常規(guī)外檢組織，經(jīng)多聚甲醛液固定、脫水、石蠟包埋和切片，分別行HE和免疫組織化學(xué)法染色。

1.3.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) EnVision法檢測(cè)胎塊滋養(yǎng)葉細(xì)胞中Ki67、Livin與Bcl-2的表達(dá)操作按試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行，一抗：兔抗人Ki67單克隆抗體、兔抗人Livin多克隆抗體和Bcl-2單克隆抗體，用PBS代替一抗為陰性對(duì)照，在光鏡下觀察。Ki67、Livin和Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)均為棕黃色或黃色顆粒，其中Ki67定位于細(xì)胞核，Livin定位于細(xì)胞質(zhì)，Bcl-2定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，選取200個(gè)滋養(yǎng)葉細(xì)胞觀察，Ki67、Livin和Bcl-2的表達(dá)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.2 TUNEL法檢測(cè) 操作按試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行，脫水、封片和干燥，在光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以絨毛間質(zhì)細(xì)胞著棕色為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)數(shù)10個(gè)連續(xù)高倍鏡（×400）視野的絨毛間質(zhì)細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出凋亡指數(shù)（apoptosis Index，AI）=絨毛間質(zhì)凋亡細(xì)胞數(shù)/mm2。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后，采用q檢驗(yàn)作兩兩比較。Ki67、Livin與Bcl-2表達(dá)與AI指數(shù)的相關(guān)性分析采用Pearson積差相關(guān)分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較

絨毛水腫組、部分性HM組和完全性HM組3個(gè)組別的年齡、體重指數(shù)、妊娠時(shí)間和是否初產(chǎn)婦等一般情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

2.2 3組胎塊的Ki67、Livin與Bcl-2表達(dá)比較

3組胎塊Livin、Bcl-2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與絨毛水腫組比，部分性HM組和完全性HM組的Ki67表達(dá)增高（P＜0.05），與部分性HM組比，完全性HM組的Ki67表達(dá)增高（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

表1 3個(gè)組別的臨床資料比較

表2 3組胎塊的Ki67、Livin與Bcl-2表達(dá)比較 （±s，%）

表2 3組胎塊的Ki67、Livin與Bcl-2表達(dá)比較 （±s，%）

注：1）與絨毛水腫組比較，P＜0.05，2）與部分性HM組比較，P＜0.05

組別Bcl-2絨毛水腫組（n=40） 7.31±1.53 42.08±6.48 38.67±5.47部分性HM組（n=39） 18.84±4.271）44.87±5.97 39.12±5.39完全性HM組（n=61） 31.64±8.171）2）43.27±7.04 40.26±5.12F值 208.58 1.78 1.22P值 0.000 0.17 0.30Ki67Livin

圖1 3組胎塊的Ki67、Livin與Bcl-2表達(dá)比較 （×200）

2.3 3組胎塊的間質(zhì)細(xì)胞凋亡比較

絨毛水腫組絨毛間質(zhì)中幾乎無(wú)凋亡細(xì)胞，部分性HM組與完全性HM組均可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，散在分布，與絨毛水腫組比較，部分性HM組和完全性HM組的AI增高（P＜0.05），部分性HM組和完全性HM組的AI比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3和圖2。

2.4 Ki67、Livin與Bcl-2與AI的相關(guān)性比較

Ki67、Livin與Bcl-2與AI的相關(guān)系數(shù)分別為0.54（P＜0.05）、0.27（P＞0.05）與0.31（P＞0.05），Ki67與AI呈正相關(guān)（P＜0.05）。

表3 3組胎塊的AI比較

圖2 3組胎塊間質(zhì)細(xì)胞凋亡比較 （×400）

3 討論

HM屬于印跡基因比例嚴(yán)重異常的疾病，發(fā)生與異常受精有關(guān)。根據(jù)病理和預(yù)后分型為部分性HM與完全性HM，前者來(lái)源于父系和母系基因組的三倍體，后者為來(lái)源于父系的二倍體。

目前臨床鑒別完全性HM、部分性HM與流產(chǎn)伴絨毛水腫仍然主要依賴于組織學(xué)特征。與完全性HM比，部分性HM的病理變化較少，這點(diǎn)容易鑒別完全性HM與部分性HM，但部分性HM的病理變化非常細(xì)微，臨床醫(yī)師或病理醫(yī)師容易將部分性HM誤認(rèn)為自然流產(chǎn)，從而容易造成部分性HM漏診或誤診，耽誤了治療。

結(jié)合筆者早期的研究，本研究對(duì)HM及早期正常妊娠絨毛的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了深入觀察，發(fā)現(xiàn)絨毛水腫、絨毛水池形成、滋養(yǎng)葉細(xì)胞增生（包括增生模式、增生程度及增生不典型性）和間質(zhì)細(xì)胞凋亡在HM分型和鑒別HM與絨毛水腫胎塊鑒別有重要價(jià)值。

對(duì)于滋養(yǎng)葉細(xì)胞增生，本檢測(cè)了凋亡/增殖相關(guān)蛋白Ki67、Livin與Bcl-2，3者均明顯增高。Ki67是細(xì)胞增殖標(biāo)記物，可用于鑒別腫瘤與反應(yīng)性增生病變，Ki67表達(dá)在除G0期以外其他細(xì)胞周期的細(xì)胞，甄別細(xì)胞增殖活性和良惡性組織生長(zhǎng)狀態(tài)[11]。本次實(shí)驗(yàn)中，Ki67在各組絨毛的細(xì)胞滋養(yǎng)葉細(xì)胞均有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)，在絨毛水腫組、部分性HM組和完全性HM組呈逐漸增多，各組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與ALIREZA等[12]的研究一致，說(shuō)明HM的絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增殖活性要高于普通的絨毛組織。Livin基因（又稱KIAP、ML-1AP），是凋亡抑制基因家族中的成員，可以通過(guò)多種途徑發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用，Livin在正常組織中低表達(dá)或未見(jiàn)表達(dá)，而在許多腫瘤細(xì)胞中都呈高表達(dá)[13]。Bcl-2基因是最早被發(fā)現(xiàn)的抗凋亡基因，可通過(guò)阻止細(xì)胞凋亡促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖以及存活，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。CANDELIER等[14]研究發(fā)現(xiàn)其在HM惡性發(fā)展的診斷價(jià)值。但在本研究中未發(fā)現(xiàn)Livin及Bcl-2蛋白在HM與絨毛水腫的滋養(yǎng)葉細(xì)胞中的表達(dá)僅有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有可能與納入病例較少有關(guān)，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證，因此Livin及Bcl-2蛋白在滋養(yǎng)葉細(xì)胞的表達(dá)是否有助于提高鑒別絨毛水腫、部分性HM和完全性水泡狀的準(zhǔn)確性還需試驗(yàn)驗(yàn)證。

HM的絨毛間質(zhì)可見(jiàn)雜亂分布的核碎片與凋亡小體，但在正常早期絨毛間質(zhì)中難以見(jiàn)到，核碎片與凋亡小體的數(shù)量與病變程度密切相關(guān)，因此這類形態(tài)指標(biāo)可用于鑒別完全性、部分性HM與早期正常絨毛組織。有研究證實(shí)，HM間質(zhì)細(xì)胞核碎裂與凋亡比率明顯高于正常早期胎盤[8-9]，而且HM惡變與滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡活性相關(guān)，可見(jiàn)多種凋亡相關(guān)因子參與了絨毛組織的病變過(guò)程[6]。本研究采用TUNEL法原位檢測(cè)間質(zhì)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示絨毛間質(zhì)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)在HM組和絨毛水腫組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，前者的凋亡細(xì)胞高于后者，與早前研究中光鏡下觀察到的絨毛間質(zhì)凋亡小體/核碎片的情況相一致，但在完全性與部分性HM之間細(xì)胞凋亡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外滋養(yǎng)葉細(xì)胞的Ki67的表達(dá)與AI指數(shù)呈正相關(guān)，提示HM病例并存絨毛滋養(yǎng)葉細(xì)胞的高增殖活性及絨毛間質(zhì)細(xì)胞的高度凋亡。

綜上所述，難以依賴于病理形態(tài)學(xué)的改變進(jìn)行HM的診斷與分型是婦產(chǎn)科病理診斷的難點(diǎn)。本次研究結(jié)果提示，檢測(cè)間質(zhì)細(xì)胞的凋亡聯(lián)合滋養(yǎng)葉細(xì)胞Ki67表達(dá)可用于HM的診斷與分型，也可用于鑒別HM與絨毛水腫。

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（張西倩 編輯）

Value of trophoblastic cell proliferation-related gene and interstitial cell apoptosis in diagnosis of hydatidiform moles*

Yan Zhang1,Ping Lu1,Shu-ling Yang1,Xuan Liu1,Lin Zhang2,Yi Wang1
(1.Department of Pathology,2.Department of Gynecology,Maternity and Infant Health Care Hospital of Putuo District,Shanghai 200062,China)

R737.33

A

2016-12-08

上海市普陀區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)自主創(chuàng)新科研資助項(xiàng)目（No：普KW2012308）；上海市普陀區(qū)臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目（No：PW-2-14-02）

王一，E-mail：wangyi6151@126.com；Tel：13681713686

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.004

1005-8982（2017）22-0020-05