金 葉 李廣興 劉 義 駱蓮新 李明富

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧,530004；2.廣西清潔化制漿造紙與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧,530004)

·竹青色素提取·

粉單竹竹青色素提取工藝及其成分分析

金 葉 李廣興 劉 義 駱蓮新*李明富

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧,530004；2.廣西清潔化制漿造紙與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧,530004)

粉單竹竹青；色素；超聲波提取

木材是世界造紙工業(yè)最常用的原料，而我國(guó)木材資源十分緊缺，原料的供應(yīng)成為制約造紙工業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題之一[1]。我國(guó)竹資源豐富，素有“竹子王國(guó)”之稱，竹子是優(yōu)質(zhì)的造紙?jiān)?，但是竹子高得率漿具有漂白難、易返黃的特性，其高得率法制漿尚處于研究階段[2]。

圖1 葉綠素與類胡蘿卜素分子結(jié)構(gòu)

竹青(竹子外表皮)，中醫(yī)上又稱竹茹，《中藥辭?！分杏涊d，竹茹為禾本科剛竹屬、箣竹屬和牡竹屬中一些竹種的莖稈所刮下的外皮層或相鄰一層[3],綠色植物的顏色來(lái)自于葉綠素[4]，綠葉中色素的提取物主要是葉綠素、類胡蘿卜素以及一些無(wú)色的物質(zhì)。其中葉綠素具有較強(qiáng)的抗氧化能力[5]，類胡蘿卜素也具有強(qiáng)大的抗氧化活性，且是一種很好的自由基清除劑[6-7]。在H2O2的漂白過(guò)程中,色素的存在會(huì)消耗一部分H2O2。大部分綠色植物主要含有葉綠素a和葉綠素b，其分子結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示，在分子結(jié)構(gòu)中，一部分是含有四吡咯環(huán)構(gòu)成的卟啉環(huán)骨架，一部分是一個(gè)很長(zhǎng)的脂肪烴側(cè)鏈，稱為葉綠醇[8-9]。類胡蘿卜素分為胡蘿卜素和葉黃素，其分子結(jié)構(gòu)如圖1(b)、圖1(c)所示，二者在結(jié)構(gòu)上均由8個(gè)類異戊二烯單元演變而成，具有多個(gè)共軛雙鍵[10-12]。樓鼎鼎[13]采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)從剛竹屬竹子莖稈的外皮層中提取“竹子三菇皂戒元”，該物質(zhì)是一種標(biāo)準(zhǔn)化制劑由木栓酮、羽扇豆烯酮及其同系物為主的五環(huán)三菇類化合物組成(EZR2002)；Nishina A等人[14]從毛竹的莖皮中檢出了抗菌活性成分2，6-二甲氧基對(duì)苯醌。由此可知，竹青組分含有不飽和鍵的發(fā)色或助色基團(tuán)，在高得率竹漿制備過(guò)程中，如果這些基團(tuán)殘留在竹漿中，會(huì)對(duì)竹子高得率漿白度及白度穩(wěn)定性造成不利影響[15]。前人研究表明，通過(guò)揉搓分絲可破壞竹子的表皮蠟質(zhì)層能有效改善漂白效果，增加預(yù)浸、水洗人工剝離表皮色素量，可提高竹子化機(jī)漿白度2%～3%，并降低紙漿返黃程度[16]。筆者初步研究了粉單竹去除竹皮與未去除竹皮磺化化學(xué)機(jī)械漿(SCMP)，發(fā)現(xiàn)未去除竹皮SCMP返黃值(1.05)大于去除竹皮SCMP返黃值(0.66)，且在相同漂白條件下，去除竹皮SCMP白度的增加略大于未去除竹皮SCMP白度的增加。

本實(shí)驗(yàn)主要研究粉單竹竹青色素提取工藝及其成分分析，為今后提高竹子高得率漿白度提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1原料

從廣西林業(yè)科學(xué)研究院取得2～3年生的新鮮粉單竹。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

FZ102微型植物試樣粉碎機(jī),北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；PL-S80超聲波清洗儀,東莞康士潔超聲波科技有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠；Analytik Jena紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、Magnet System 500′54 Ascend核磁共振波譜儀、Tensor II傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)布魯克分析儀器公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1原料的制備

將剛采伐的粉單竹洗凈、刮皮、風(fēng)干，經(jīng)植物粉碎機(jī)粉碎，然后將磨成粉的竹青過(guò)60目篩得竹青粉，密封避光冷藏備用。

1.3.2超聲波提取法

稱量竹青粉1 g于100 mL燒杯中，加入乙醇溶液。將浸潤(rùn)的樣品放入頻率40 kHz、額定功率1500 W的超聲波清洗儀中進(jìn)行超聲處理，得到竹青粗提液。

1.4竹青色素定性及定量檢測(cè)方法

將竹青粗提液用0.45 nm有機(jī)濾膜過(guò)濾，過(guò)濾液用乙醇稀釋9倍。在紫外可見(jiàn)光區(qū)(400～800 nm)測(cè)稀釋過(guò)濾液的紫外光譜圖，并選擇合適吸收峰波長(zhǎng)作為定性檢測(cè)。讀取645、663 nm波長(zhǎng)吸光度，按Arnon公式[17]計(jì)算葉綠素a和葉綠素b含量以及提取的葉綠素總含量。

Ma=(12.71A663-2.59A645)·9V/(1000W)

(1)

Mb=(22.88A645-4.67A663)·9V/(1000W)

(2)

Mc=Ma+Mb

(3)

式中，Ma為葉綠素a的含量，mg/g；Mb為葉綠素b的含量，mg/g；Mc為葉綠素總含量；mg/g；V為提取液的體積，mL；W為竹青粉質(zhì)量，g；A645為645 nm處的吸光度。A663為663 nm處的吸光度。

1.5竹青粗提液的柱層析分離

竹青色素純化：取5 g竹青粉，按照最佳提取方法提取竹青色素，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)提取液到20 mL，用10 mL石油醚(30～60℃)萃取，取上層液，然后用蒸餾水洗滌上層液兩次，放置備用。

柱層析分離：層析柱的固定相為中性氧化鋁(100～200目)，用石油醚平衡，洗脫劑依次為石油醚-丙酮(10∶1)、石油醚-丙酮(5∶2)、石油醚-丙酮(5∶3)、甲醇階梯洗脫，收集分離的色素，然后在400～800 nm處測(cè)紫外光光譜圖。

1.6核磁譜圖的分析

將竹青粗提液純化后的竹青色素旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)通氮?dú)飧稍铮缓笕芙庠陔确?CDCl3)中，在500 MHz的頻率下測(cè)其1H-NMR譜圖。

1.7紅外光譜分析

將竹青粗提液純化后的色素旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)通氮?dú)飧稍?，與KBr混合壓片進(jìn)行紅外光譜測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1超聲波提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

葉綠素a和葉綠素b在紅光區(qū)最大吸收峰分別為663、645 nm附近，在藍(lán)光區(qū)最大吸收峰為453、429 nm附近[18]。藍(lán)光區(qū)易受類胡蘿卜素的干擾。竹青粗提液在400～800 nm的紫外可見(jiàn)光吸光光譜圖如圖2所示，該圖與芒果樹(shù)葉葉綠素粗提液吸收光譜圖相似[19],在666 nm處有明顯的吸收峰。故本實(shí)驗(yàn)選擇666 nm作為竹青色素的定性檢測(cè)紅外波長(zhǎng)。

圖2 竹青粗提液紫外可見(jiàn)吸收光譜

2.1.1乙醇濃度

葉綠素是一種酯，易溶于有機(jī)溶劑，由于丙酮、乙醚有毒，且價(jià)格相對(duì)較高，所以本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇為提取劑。在料液比1∶30、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度55℃的條件下，研究乙醇濃度對(duì)葉綠素含量和吸光度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，當(dāng)乙醇濃度由60%增加到90%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)，葉綠素含量和吸光度不斷增加；當(dāng)乙醇濃度超過(guò)90%時(shí)，吸光度減小，這可能是由于葉綠素a與葉綠素b結(jié)構(gòu)中均有一個(gè)極性的“頭部”，所以用含有一定水量的有機(jī)溶劑來(lái)提取葉綠素效果更好，故乙醇提取的最佳濃度為90%。

圖3 乙醇濃度對(duì)葉綠素含量和吸光度的影響

2.1.2超聲溫度

在乙醇濃度90%、料液比1∶30、超聲時(shí)間60 min的條件下，研究超聲溫度對(duì)葉綠素含量和吸光度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)超聲溫度由35℃升高到55℃時(shí)，葉綠素含量逐漸增加，當(dāng)溫度超過(guò)55℃時(shí)，葉綠素含量下降，這是因?yàn)槿~綠素不穩(wěn)定，溫度過(guò)高可能使葉綠素結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或竹青粉內(nèi)雜質(zhì)溶出，不利于葉綠素的提取，所以超聲溫度最佳為55℃。

2.1.3超聲時(shí)間

在乙醇濃度90%、超聲溫度55℃、料液比1∶30的條件下，超聲時(shí)間對(duì)葉綠素含量和吸光度的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,當(dāng)超聲時(shí)間由20 min延長(zhǎng)到40 min時(shí)，葉綠素含量不斷增加，超聲時(shí)間超過(guò)40 min后隨著超聲時(shí)間的增加，葉綠素含量逐漸減小，其原因可能是過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間導(dǎo)致其他雜質(zhì)的溶出從而導(dǎo)致葉綠素含量下降。超聲持續(xù)的機(jī)械振動(dòng)與空化作用導(dǎo)致葉綠素的分子結(jié)構(gòu)受到破壞也會(huì)導(dǎo)致吸光度降低，所以超聲時(shí)間應(yīng)選擇40 min。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)葉綠素含量和吸光度的影響

2.1.4料液比

料液比是提取過(guò)程的一個(gè)重要影響因素，在乙醇濃度90%、超聲溫度55℃、超聲時(shí)間60 min的條件下，料液比對(duì)葉綠素含量和吸光度的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，在料液比1∶20～1∶35范圍內(nèi)，隨著提取液的增加，葉綠素含量不斷增加，當(dāng)超過(guò)1∶35時(shí)，葉綠素含量反而減小。從傳質(zhì)速率的角度看：主要表現(xiàn)在影響固相主體和液相主體之間的濃度差，即傳質(zhì)推動(dòng)力。料液比大，提取過(guò)程中液相濃度增加快，兩相間的濃度差減少加快，從而使傳質(zhì)推動(dòng)力衰減加快，影響傳質(zhì)速率。料液比的減小必然會(huì)在較大的程度上提高傳質(zhì)推動(dòng)力，但是過(guò)低的料液比可能會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)析出，影響葉綠素的提取，同時(shí)考慮到成本以及提取液的回收，較佳的料液比為1∶35。

圖6 料液比對(duì)葉綠素含量和吸光度的影響

從圖3～圖6可知，竹青色素定性測(cè)量的變化趨勢(shì)與Arnon公式計(jì)算葉綠素含量的變化趨勢(shì)相一致。

2.1.5提取次數(shù)

在乙醇濃度90%、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度55℃、料液比1∶35的最佳工藝條件下，依次提取竹青葉綠素四次，每提取一次，使用紫外光譜儀檢測(cè)一次，并根據(jù)Arnon公式計(jì)算葉綠素含量，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，經(jīng)過(guò)兩次提取，竹青葉綠素已基本提取完全，從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，竹青葉綠素可以提取兩次,提取率約為0.39%。

2.2紫外光譜分析

通過(guò)石油醚萃取，下層液含有許多雜質(zhì)，將上層液通過(guò)柱層析分離，依次得到橙黃色、藍(lán)綠色、黃色和綠色4種色素，這4種色素分別在可見(jiàn)光區(qū)測(cè)紫外光譜圖，結(jié)果如圖7～圖9所示。

表1 提取次數(shù)對(duì)葉綠素含量影響

注A666是波長(zhǎng)666 nm處的吸光度。

圖7 橙黃色色素紫外光譜圖

圖8 藍(lán)綠色和綠色色素紫外光譜圖

圖9 黃色色素紫外光譜圖

葉綠素a和葉綠素b及其衍生物對(duì)紅光區(qū)(620～700 nm)和藍(lán)紫光區(qū)(400～500 nm)的光吸收特別強(qiáng)烈,而對(duì)綠光區(qū)(520～580 nm)的光則吸收較弱,因而葉綠素呈現(xiàn)綠色[20]。由圖8可知，藍(lán)綠色色素和綠色色素分別在藍(lán)光區(qū)410 nm、437 nm處有最大吸收峰，在紅光區(qū)667 nm、665 nm處有最大吸收峰，并且與相關(guān)文獻(xiàn)[21-24]的葉綠素a、葉綠素b的紫外光譜圖相似，類胡蘿卜素由于分子結(jié)構(gòu)中具有共軛雙鍵這個(gè)獨(dú)特的發(fā)色基團(tuán)，所以在紫外藍(lán)光區(qū)(400～500 nm)有特征吸收峰，能呈現(xiàn)出紅、橙、黃色[7]，圖7和圖9分別在447 nm、449 nm處出有最大吸收峰，并且與相關(guān)文獻(xiàn)[9，24]的類胡蘿卜素的紫外光譜相似。通過(guò)以上分析可判斷提取的色素分別是葉綠素和類胡蘿卜素。

圖11 竹青粗提液純化后的紅外光譜圖

2.3核磁譜圖分析

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)可知[12,25-27]，δ為7.26處為CDCl3溶劑峰，δ大于11.7處是雜峰，δ為11.2～8.5處為四吡咯環(huán)上的H,主要來(lái)源于葉綠素及其衍生物上的次甲基質(zhì)子，由于葉綠素b上含有醛基，所以峰位在前段,δ為8.0～7.0處存在芳香族上的H，δ為7.0～5.4處為類胡蘿卜素萜烯的鏈以及與其他有著共軛雙鍵峰(葉綠素及其衍生物上的共軛雙鍵)重疊峰的區(qū)域，δ為5.4～5.0之間可能存在著脂肪酸上雙鍵質(zhì)子，δ為5.0～3.0處是氧原子上的飽和氫，可能是甾醇、甘油樹(shù)脂等產(chǎn)生的，而δ為2.4～0.8是脂肪族上的飽和氫，δ為-1.5～-2.0是葉綠素卟啉類化合物上的N—H鍵上的H引起的。由圖10可知，竹青色素純化液中除了色素可能還含有其他物質(zhì)，如脂肪酸、甾醇等。

圖10 竹青粗提液純化后的核磁譜圖

2.4紅外光譜分析

3 結(jié) 論

3.1以乙醇為提取劑，超聲波提取法提取粉單竹竹青色素，得出最佳提取條件為：乙醇濃度90%，料液比1∶35，超聲時(shí)間40 min, 超聲溫度55℃；從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，竹青葉綠素可以提取兩次，提取率為0.39%。

3.2竹青提取液經(jīng)石油醚萃取純化后通過(guò)柱層析分離色素得到橙黃色、藍(lán)綠色、黃色、綠色4種色素，通過(guò)測(cè)4種色素紫外光譜圖，可知所測(cè)光譜圖與葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素圖相似。

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(責(zé)任編輯：董鳳霞)

ExtractionTechnologyandCompositionAnalysisofBambooBarkPigmentfromBambusaChungii

JIN Ye LI Guang-xing LIU Yi LUO Lian-xin*LI Ming-fu

(1.CollegeofLightIndustryandFoodEngineering,GuangxiUniversity,Nanning,GuangxiZhuangAutonomousRegion, 530004; 2.GuangxiKeyLabofCleanPulpingandPapermakingandPollutionControl,Nanning,GuangxiZhuangAutonomousRegion， 530004)

BambusaChungii bamboo bark; pigment; ultrasonic extraction

金 葉女士，在讀碩士研究生；主要研究方向：清潔化制漿造紙新技術(shù)與污染控制。

TS721+.2

A

10.11980/j.issn.0254- 508X.2017.09.005

2017- 08- 02(修改稿)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“高得率竹漿中非木素組分的光熱誘導(dǎo)返色機(jī)理和生物調(diào)控”(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：31660182)。

*通信作者：駱蓮新，副教授；研究方向：清潔化制漿造紙新技術(shù)與污染控制。

(*E-mail: lxluo919@163.com)