王 柱，周中新，關(guān)秋華，張 昊，劉志偉，董紅燕，張中明△

(1.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心胸外科，江蘇徐州 221006；2.徐州醫(yī)科大學生物化學與分子生物學研究中心，江蘇徐州 221004；3.徐州醫(yī)科大學形態(tài)學科研實驗中心，江蘇徐州 221004)

論著·基礎(chǔ)研究

色素上皮衍生因子對缺氧條件下H9C2心肌細胞保護作用*

王 柱1，周中新1，關(guān)秋華2，張 昊1，劉志偉3，董紅燕3，張中明1△

(1.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心胸外科，江蘇徐州 221006；2.徐州醫(yī)科大學生物化學與分子生物學研究中心，江蘇徐州 221004；3.徐州醫(yī)科大學形態(tài)學科研實驗中心，江蘇徐州 221004)

目的探討色素上皮衍生因子(PEDF)對H9C2心肌細胞在低氧無血清條件下的保護作用及其可能的機制。方法體外培養(yǎng)H9C2細胞進行低氧無血清處理，將細胞分為對照組(H9C2)、缺氧組(缺氧+H9C2)、PEDF組(缺氧+H9C2+PEDF)、殘粒體分裂抑制劑(Medivi-1)組(缺氧+H9C2+Mdivi-1)。TUNEL染色檢測H9C2心肌細胞凋亡率；Western blot檢測動力相關(guān)蛋白1(Drp1)、活化半胱天冬酶-3 (Cleaved-Caspase3)的蛋白水平；電鏡及MitoTracker Red檢測線粒體形態(tài)；采用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)檢測線粒體膜電位，MitoSOXTM檢測線粒體活性氧簇(ROS)水平。結(jié)果缺氧誘導H9C2細胞線粒體分裂，缺氧組(6 h)與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，PEDF減少缺氧條件下線粒體分裂，PEDF組與缺氧組(6 h)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，PEDF和Mdivi-1可以減少缺氧條件下(24 h)細胞凋亡，與缺氧組(24 h)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論PEDF通過抑制缺氧條件下H9C2細胞線粒體分裂減少細胞凋亡。

細胞凋亡；缺氧；心臟；H9C2細胞；色素上皮衍生因子;動力相關(guān)蛋白1;線粒體分裂

急性心肌梗死(acute myocardium infarction，AMI)是一種較常見的心血管疾病，對其的有效防治是醫(yī)學界關(guān)注的熱點[1-2]。AMI是持續(xù)而嚴重的心肌缺血所致的急性心肌細胞壞死[3]，抑制缺血心肌細胞的凋亡與壞死及提高AMI預后是治療的關(guān)鍵。色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)作為重要的內(nèi)源性血管抑制因子，在多個組織中均有表達，并具有多種生物活性[4-6]。本課題組的前期研究也提示PEDF具有抗血管滲透，保護缺血后心肌細胞凋亡，改善心肌梗死后心臟功能等作用[7-9]。本實驗旨在通過構(gòu)建H9C2細胞缺氧模型模擬心肌梗死，研究PEDF對細胞內(nèi)線粒體分裂的調(diào)控，明確PEDF改善缺氧條件下H9C2細胞存活相關(guān)機制，為進一步完善缺血性心臟病的治療提供理論基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠心肌細胞 H9C2購自北京北納創(chuàng)聯(lián)公司，DMEM培養(yǎng)基、D-Hanks 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；動力相關(guān)蛋白1(Drp1，#8570),活化半胱天冬酶-3 (Cleaved Caspase-3，#9664),β肌動蛋白(β-actin，#13E5) 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；線粒體熒光探針Mito-Tracker?Red購自英國Invitrogen公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自南京凱基公司；大鼠重組PEDF購自武漢華美生物科技公司；MitoSOXTMRed線粒體活性氧簇(ROS)檢測試劑盒購自美國Life Technologies公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) H9C2心肌細胞株來源于大鼠胚胎期心臟組織，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中。大鼠心肌細胞選取生長密度相似，生長狀況良好的對數(shù)期心肌細胞進行分組：(1)對照組(H9C2)：未經(jīng)缺氧處理，在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(2)缺氧組(缺氧+H9C2)：心肌細胞用無糖 D-Hanks 培養(yǎng)液替代正常培養(yǎng)基，在經(jīng)過1%O2+5%CO2混合氣平衡的單向氣流缺氧裝置中，于37 ℃培養(yǎng)； 缺氧時間分別為3、6、12、24 h。(3)PEDF組(缺氧+H9C2+PEDF)：預處理的D-Hanks培養(yǎng)液中加入終濃度為10 nmol/L PEDF后缺氧處理，作為加藥組；(4)Mdivi-1組(缺氧+H9C2+Mdivi-1)：預處理的 D-Hanks 培養(yǎng)液中加入終濃度為1 μmol/L的Mdivi-1做同樣的缺氧處理。

1.2.2Western blot檢測蛋白表達 將各組心肌細胞培養(yǎng)皿置于冰上，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，加入 4 ℃預冷的RIPA細胞蛋白裂解液，線粒體及胞質(zhì)蛋白的提取方法如前所述[9]，蛋白定量檢測采用二喹啉甲酸法(BCA)。蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后用恒流濕法轉(zhuǎn)膜。加入5%脫脂奶粉-TBST 封閉液于室溫封閉 1 h，再分別加入稀釋的Drp1、Cleaved Caspase-3和β-actin一抗，4 ℃輕搖過夜；隨后加入相應(yīng)的二抗(1∶100稀釋)，37 ℃恒溫搖床孵育1 h。蛋白的相對表達量用待測蛋白與β-actin的灰度值比值計算。

1.2.3熒光顯微鏡觀察線粒體形態(tài) 細胞培養(yǎng)于48孔板中，經(jīng)分別處理后，使用 MitoTracker Red(200 nmol/L)標記心肌細胞線粒體，予室溫孵育20 min后，PBS沖洗3遍，即可采用熒光顯微鏡觀察線粒體形態(tài)。

1.2.4電鏡觀察線粒體分裂 細胞培養(yǎng)于6孔板中待細胞生長約4×105/孔，分別加入藥物處理，作用20 min后棄去培養(yǎng)基上清液，用0.25%胰酶消化收集各組細胞，洗滌后加2.50%戊二醛浸沒細胞團塊。經(jīng)過一系列脫水、染色并切片后觀察線粒體分裂情況。

1.2.5線粒體膜電位檢測試劑盒JC-1檢測細胞線粒體膜電位 細胞培養(yǎng)于48孔板中，經(jīng)分別處理后，使用JC-1(10 μg/mL)標記線粒體膜電位，避光孵育15 min,PBS洗3遍，即可采用熒光顯微鏡觀察。

1.2.6線粒體ROS的測定 取對數(shù)生長期的H9C2細胞予48孔板常規(guī)培養(yǎng),分別處理后,每孔加入200 μL MitoSOXTM試劑(將1 mmol/L的MitoSOX Red儲存液按照1∶1 000 的比例加入到無血清培養(yǎng)基中，充分混勻即為MitoSOX Red工作液) 與細胞培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃共孵育10 min。之后用PBS清洗細胞3次，hoechst3342染色細胞核15 min，熒光顯微鏡下觀察。以紅色熒光強度代表各組細胞線粒體ROS水平。

1.2.7TUNEL 熒光染色檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的H9C2細胞予48孔板常規(guī)培養(yǎng)，缺氧24 h后，經(jīng)分別加藥處理，使用4 ℃預冷的多聚甲醛固定細胞10 min,PBS沖洗3遍，加入10%驢血清(0.3%trition稀釋)封閉，PBS沖洗3遍，避光條件下加入事先準備好的TUNEL反應(yīng)液，37 ℃水浴1 h。PBS沖洗后，加入DAPI染色5 min，PBS洗孔板內(nèi)細胞后熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1PEDF對缺氧H9C2細胞線粒體分裂的影響 熒光和電鏡的結(jié)果顯示，對照組H9C2細胞線粒體成網(wǎng)格狀分布，呈條索狀，分裂比例少。缺氧組(6 h)線粒體呈現(xiàn)為不規(guī)則，大小不一，球型，分裂比例占大部分。PEDF處理后，H9C2細胞線粒體分裂狀態(tài)明顯減少，部分呈現(xiàn)網(wǎng)狀分布，見圖1。

A:線粒體熒光探針檢測H9C2細胞內(nèi)線粒體分裂情況(Scale bar,20 μm),局部放大5倍；B:電鏡檢測H9C2細胞內(nèi)線粒體分裂情況(Scale bar，1 μm)

圖1 3組缺氧H9C2細胞線粒體分裂情況

A:對照組與缺氧組線粒體及細胞質(zhì)Drp1蛋白水平；B：3組Drp1蛋白在線粒體及細胞質(zhì)中的水平

圖2 3組Drp1蛋白Western blot圖

2.2缺氧對Drp1蛋白線粒體轉(zhuǎn)位的影響及PEDF對Drp1的作用 Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，線粒體Drp1的蛋白水平隨著缺氧時間(3、6、12、24 h)的延長而不斷增加。胞質(zhì)Drp1的蛋白水平隨著缺氧時間的延長而不斷減少(P<0.05)，見圖2A。與缺氧組(6 h)相比，PEDF組線粒體Drp1的蛋白水平明顯下降，而胞質(zhì)Drp1的蛋白水平明顯上升(P<0.05)，見圖2B。

2.3PEDF對缺氧條件下H9C2細胞內(nèi)線粒體ROS及線粒體膜電位的影響 線粒體ROS熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，缺氧組(6 h),線粒體ROS紅色熒光明顯增加(P<0.05)；與缺氧組(6 h)相比，Mdivi-1組和PEDF組線粒體ROS水平下降(P<0.05)，見圖3A。與對照組相比，缺氧組(6 h)線粒體膜電位降低(P<0.05)，而PEDF組及Mdivi-1組可以抑制缺氧條件下線粒體膜電位下降(P<0.05)，見圖3B。

A:線粒體ROS熒光探針(紅色)檢測H9C2細胞線粒體ROS水平(Scale bar,20 μm),B:JC-1檢測線粒體膜電位情況(Scale bar,20 μm)

圖3 4組H9C2細胞線粒體ROS水平及線粒體膜電位比較

2.4PEDF及Mdivi-1對細胞存活的影響 TUNEL和Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，缺氧組(24 h)細胞凋亡率明顯上升(P<0.05)，與缺氧組(24 h)相比，PEDF組及Mdivi-1組凋亡率下降(P<0.05)，見圖4。

A:TUNEL染色檢測(Scale bar,50μm)，B:Western blot檢測

圖4 4組細胞凋亡TUNEL和Western blot檢測圖

3 討 論

近年來PEDF對缺血性心臟的保護作用成為研究的熱點。本課題組前期的研究亦表明，PEDF在保護缺血心臟發(fā)揮重要的作用。本實驗認為PEDF可通過抑制缺氧心肌細胞內(nèi)線粒體分裂而抑制心肌細胞凋亡和壞死，為缺血性心臟病的治療提供了新的方向。

線粒體是高度動態(tài)的細胞器，在細胞內(nèi)彼此連接，呈現(xiàn)立體的管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且發(fā)生頻繁地融合與分裂。線粒體連接成網(wǎng)絡(luò)有利于能量在其中的傳遞，也有利于信息溝通，包括膜電位快速傳遞及線粒體內(nèi)容物的交換[10-11]。大量研究顯示，線粒體的融合或分裂與細胞凋亡密切相關(guān)，線粒體融合不足、過度分裂導致線粒體的片斷化是細胞凋亡的前提[12]。在凋亡過程中，線粒體從連續(xù)網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)變成顆粒狀的結(jié)構(gòu)[13]。不平衡的線粒體分裂在許多疾病中都存在，比如癌癥，心血管疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病及糖尿病等[14]。然而，少有研究證實PEDF與線粒體分裂的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧的H9C2細胞中，線粒體分裂增加，PEDF可以明顯地抑制線粒體分裂之后的片段化，改善線粒體功能，抑制細胞凋亡。

線粒體分裂是一種動態(tài)平衡的過程，這種狀態(tài)有相關(guān)的蛋白調(diào)控[15]。Drp1是一種重要的分裂蛋白，主要存在與細胞的胞質(zhì)中，當分裂開始時，Drp1從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，在潛在分裂位點處多個 Drp1 分子形成多聚體，圍繞線粒體外膜形成指環(huán)結(jié)構(gòu)，并通過 GTP 水解改變分子間的距離或角度，逐漸壓縮直至線粒體分裂。線粒體分裂完成后，Drp1 重新回到胞質(zhì)，如此循環(huán)往復，這種線粒體分裂復合物介導線粒體膜電位的下降和線粒體內(nèi)容物的釋放促進凋亡的發(fā)生[16]。在本研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，H9C2細胞線粒體Drp1增加，胞質(zhì)中Drp1減少，同時細胞內(nèi)線粒體ROS上升，膜電位下降，這些結(jié)果表明缺氧可以誘導線粒體分裂增加和線粒體功能的下降，進而可導致細胞凋亡。然而，PEDF可減少缺氧導致的DRP1的線粒體轉(zhuǎn)位，線粒體膜電位下降，以及線粒體ROS的釋放。因此，本研究認為PEDF是通過抑制線粒體的分裂改善了線粒體功能。

本課題組前期均已經(jīng)表明，PEDF可以明顯的提高心肌細胞的生存率，改善心臟功能，但其保護作用的機制卻是各不相同。Gao等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，PEDF及其相關(guān)肽段通過抗氧化作用減少心肌細胞凋亡。而Wang等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧的條件下，PEDF可以通過PEDFR抑制P53的線粒體膜轉(zhuǎn)位，減少線粒體膜通透性的開放，改善心肌細胞的存活。本研究發(fā)現(xiàn)PEDF是通過抑制細胞內(nèi)Drp1線粒體轉(zhuǎn)位，減少線粒體的分裂，改善線粒體的功能。然而抑制線粒體分裂可以改善缺氧條件下心肌細胞的凋亡，因此，本研究認為PEDF可以通過抑制線粒體的分裂減少缺氧條件下心肌細胞的凋亡。此實驗結(jié)果既驗證了PEDF對心肌細胞的保護作用，又提出了本實驗的另一條心肌保護的分子機制，為治療缺血性心臟病提供了新的治療方案。

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ProtectiveeffectofPEDFonH9C2myocardialcellsunderhypoxiacondition*

WangZhu1,ZhouZhongxin1,GuanQiuhua2,Zhanghao1,LiuZhiwei3，DongHongyan3,ZhangZhongming1△

(1.DepartmentofCardiothoracicSurgery,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221006,China；2.ResearchCenterforBiochemistryandMolecularBiology,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221004,China;3.MorphologyScientificResearchandExperimentCenter,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221004,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects and possible mechanism of pigment epithelium derived faetor (PEDF) on myocardial cells H9C2 under hypoxia and serum-free condition.MethodsH9C2 cells were culture in vitro and performed the hypoxia and serum-free processing.The cells were divided into the control group(H9C2),hypoxia group(hypoxia+ H9C2),PEDF group(hypoxia+H9C2 +PEDF) and mitochondrial fission inhibitor(Mdivi-1) group(hypoxia+h9C2+Mivi-1).The apoptotic rate was detected by TUNNEL staining.The proteins levels of dynamin related peptide1(Drp1) and cleaved-caspase 3 were measured by Western blot.Electron Microscopy and MitoTracker Red were used to detect the mitochondria morphology,the mitochondrial membrane potential was evaluated by cationic dye JC-1.MitoSOXTMwas used to detect mitochondrial reactive oxygen species (ROS).ResultsHypoxia induced mitochondrial fission(P<0.05).The hypoxia group (6 h) and control group had statistical difference(P<0.05).PEDF reduces mitochondrial fission under hypoxia condition(P<0.05),which had statistical difference between the PEDF group and hypoxia group (6 h)(P<0.05).PEDF and Mdivi-1 could decrease cell apoptosis under hypoxia condition(24 h),compared with the hypoxia group,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionPEDF decrease cell apoptosis by inhibiting H9C2 cells mitochondrial fission under hypoxia condition.

apoptosis；anoxia;cardiac；H9C2 cells;pigment epithelium derived factor;dynamin related peptide1;mitochondrial fission

R654.2

A

1671-8348(2017)26-3605-03

2017-02-11

2017-06-03)

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.002

國家自然科學基金資助項目(81270173)；江蘇省衛(wèi)生廳科技計劃項目青年基金(Q201407)。

王柱 (1984-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事PEDF對缺血性心臟病的保護作用方面研究?！?/p>

，E-mail:zhang_zhongming@xzmc.edu.cn。