趙紅偉，張 建，和麗麗，郎曉猛，朱葉珊，劉建平△

(1.河北省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院老年病科，石家莊 050051；3.河北省中醫(yī)院脾胃科，石家莊 050071；4.河北省唐山市中醫(yī)院脾胃科 063000)

論著·基礎(chǔ)研究

1,25(OH)2D3對潰瘍性腸炎小鼠紅細胞及脾臟免疫功能的影響

趙紅偉1，張 建1，和麗麗2，郎曉猛3，朱葉珊4，劉建平3△

(1.河北省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院老年病科，石家莊 050051；3.河北省中醫(yī)院脾胃科，石家莊 050071；4.河北省唐山市中醫(yī)院脾胃科 063000)

目的探討1,25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]對腸炎模型小鼠紅細胞、脾臟免疫機制的作用。方法30只小鼠隨機分為空白對照組、模型組、1,25(OH)2D3組，建立動物模型；觀察小鼠一般情況、結(jié)腸病理變化，酵母菌花環(huán)法檢測紅細胞免疫復(fù)合物(RCIC)和紅細胞表面C3b受體(RC3bR)花環(huán)變化，測量脾臟質(zhì)量、長度，流式細胞術(shù)測脾臟免疫細胞陽性率。結(jié)果與模型組比較，1,25(OH)2D3組、空白對照組血中RBC-C3bR明顯增高，紅細胞免疫復(fù)合物花環(huán)(RBC-ICR)明顯降低(P<0.01)。與空白對照組相比，模型組脾臟單個核細胞中CD3、CD4、CD8、CD45R細胞陽性率明顯升高(P<0.01)；經(jīng)1,25(OH)2D3干預(yù)后，1,25(OH)2D3組脾臟單個核細胞中CD3、CD4、CD8、CD45R細胞陽性率與模型組比較明顯下降(P<0.01)。結(jié)論1,25(OH)2D3對慢性腸炎的紅細胞及外周脾臟淋巴細胞均有免疫調(diào)節(jié)作用。

1,25(OH)2D3；紅細胞免疫；脾臟淋巴細胞；潰瘍性結(jié)腸炎；慢性動物模型

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因尚不明確的慢性非特異性炎癥性結(jié)腸病變。根據(jù)流行病學(xué)資料提示，本病的發(fā)病率在國內(nèi)外均有逐年上升的趨勢。此病遷延數(shù)月，反復(fù)發(fā)作，嚴重影響患者的正常生活和工作。目前關(guān)于其發(fā)病機制的基本共識是：易感個體在特定的環(huán)境因素作用下，有害物質(zhì)觸發(fā)了機體的免疫系統(tǒng)發(fā)生并產(chǎn)生過度的級聯(lián)免疫反應(yīng)，使炎癥反復(fù)發(fā)生[1-2]；1,25-二羥維生素D3[1,25(OH)2D3]是維生素D的活性代謝產(chǎn)物，具有免疫調(diào)節(jié)作用，有研究顯示其可緩解UC癥狀[3-5]，本研究旨在探索1,25(OH)2D3對慢性UC模型小鼠的治療作用是否通過紅細胞免疫和脾臟淋巴細胞免疫機制進行調(diào)節(jié)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 30只雄性C57BL/6小鼠(7～12周，體質(zhì)量18～22 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)；1,25(OH)2D3(瑞士羅氏有限公司)；右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS，相對分子質(zhì)量36 000～50 000，美國Sigma公司)；酵母多糖試劑；2%DSS配制：10 g DSS 溶于500 mL蒸餾水中，配成2%濃度的液體，放入4 ℃冰箱保存且備用。

1.2方法

1.2.1造模方法 動物造模與實驗分組慢性期造模及1,25(OH)2D3干預(yù)：30只雄性C57BL/6小鼠按隨機數(shù)字表隨機分入空白對照組、模型組和1,25(OH)2D3組，每組10只。第1～28天空白對照組一直飲用蒸餾水；模型組和1,25(OH)2D3組小鼠飲用2%DSS的時間段分別為第1～5天、第8～12天、第15～19 天、第22～28天，其他時間段均飲用蒸餾水。各組在造模第14天時給予干預(yù)，空白對照組與模型組均給予等體積花生油灌胃以做對照，1,25(OH)2D3組給予1,25(OH)2D3(0.005 μg/d，溶于花生油中)灌胃干預(yù)，每天1次，共干預(yù)14 d；所有的動物均在第29天處死。

A：空白對照組；B：模型組；C：1,25(OH)2D3組

圖1各組小鼠結(jié)腸黏膜組織光鏡下病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×200)

1.2.2一般情況及結(jié)腸病理組織染色 從實驗第1天開始每天觀察小鼠體質(zhì)量變化、便血情況、大便性狀、精神狀態(tài)、飲食等。在第29天實驗結(jié)束時處死動物，同時截取部分結(jié)腸段置于多聚甲醛內(nèi)固定，進行包埋和切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，行組織病理學(xué)觀察。

1.2.3紅細胞免疫的檢測 紅細胞C3b受體酵母菌花環(huán)(RBC-C3bR)：實驗結(jié)束時迅速從小鼠眼球取血1 mL，注入枸櫞酸鈉抗凝管中離心，從上層取出血漿備用，從下層取出50 μL紅細胞加450 μL生理鹽水混勻，檢測紅細胞濃度，加生理鹽水稀釋，終濃度1.25×107/mL。將冷凍致敏酵母菌充分吹打混勻，50 μL配好紅細胞+50 μL血漿+50 μL酵母菌，50 μL配好紅細胞+50 μL酵母菌，混勻37 ℃水浴，加入0.25%戊二醛25 μL，分別取1/2的量以毛細吸管涂片，吹干，加2滴甲醇固定，瑞士染液與緩沖液(1∶3)染色30 s，自來水沖洗去染液，濕片鏡檢計數(shù)紅細胞花環(huán)形成率(與紅細胞結(jié)合2個以上酵母菌)。同法檢測紅細胞表面C3b受體(RC3bR)。

1.2.4脾臟長度和脾臟質(zhì)量的測量 第29天實驗結(jié)束處死動物后留取各組小鼠的脾臟，分別稱取、測量脾臟量長度和質(zhì)量，并記錄，統(tǒng)計各組脾臟質(zhì)量、脾臟長度的變化。

1.2.5脾臟中免疫細胞陽性率的檢測 分離脾臟中單個核細胞，用生理鹽水漂洗2～3次，最終將其濃度調(diào)整為2×105/50 μL，第1管加入FITC標記的免疫球蛋白G(IgG) 5.0 μL和PE-Cy5標記的IgG2b 12.5 μL；第2管加入FITC標記抗小鼠CD4+2.5 μL，PE-Cy5標記的抗小鼠CD3+2.5 μL 和PE標記的抗小鼠CD8+抗體2.5 μL；第3管加入FITC標記CD45R 2.5 μL和IgG Cy5標記CD3+2.5 μL；避光作用30 min后，生理鹽水洗1～3次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，100 μL生理鹽水重懸，用流式細胞儀熒光法檢測。

2 結(jié) 果

2.1各組實驗動物的一般情況 從實驗研究第1天開始，各組動物的體質(zhì)量均增加，進食及飲食均較多；從第3天開始模型組、1,25(OH)2D3組實驗動物的體質(zhì)量開始逐漸下降，進食量及飲水明顯減少，精神狀態(tài)差、大便松散，但無稀便，無黏液及膿血便；第13～15天時實驗動物的體質(zhì)量下降較明顯，精神萎靡，進食量及飲水量均明顯減少，少動并出現(xiàn)稀便，肛周可見黏液及膿血便；1,25(OH)2D3組從第14天起給予1,25(OH)2D3灌胃干預(yù)，干預(yù)后動物的體質(zhì)量仍繼續(xù)下降，精神狀態(tài)差，并出現(xiàn)稀便及血便；自第17天起1,25(OH)2D3組中的動物體質(zhì)量下降不明顯，基本平穩(wěn)，精神癥狀均有好轉(zhuǎn)，活動增多；從第18天起，1,25(OH)2D3組動物的體質(zhì)量逐漸增加，但不太明顯，大便稀且量多，便血不明顯，精神可，進食及飲水增加；第29天，動物的體質(zhì)量基本回到初始體質(zhì)量的水平，大便量多，稀松但無膿血，精神狀態(tài)良好，進食及飲水量較正常。

2.2各組實驗動物結(jié)腸組織病理學(xué)變化 空白對照組動物的結(jié)腸病理光鏡下觀察可見黏膜光滑、完整，無缺損，無糜爛、水腫、充血等表現(xiàn)；模型組動物的結(jié)腸病理光鏡下觀察可見結(jié)腸黏膜不完整、紊亂、缺損，可見黏膜、黏膜下層大量炎性細胞浸潤，隱窩增生，炎癥細胞廣泛浸潤，呈典型慢性炎癥改變。1,25(OH)2D3組結(jié)腸病理光鏡下觀察可見結(jié)腸黏膜稍完整，缺損不明顯，黏膜層及黏膜下層炎癥細胞浸潤較模型組減少，炎癥程度較模型組明顯減輕，見圖1。

2.3紅細胞免疫的檢測 與模型組比較，1,25(OH)2D3組、空白對照組血中RBC-C3bR明顯增高，紅細胞免疫復(fù)合物花環(huán)(RBC-ICR)明顯降低(P<0.01)，見表1。

表1 紅細胞免疫的比較

a：P<0.01，與模型組比較

2.4脾臟長度、質(zhì)量的變化 3組小鼠脾臟長度和質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組脾臟長度和質(zhì)量比較

2.5脾臟CD3、CD4、CD8、CD45R細胞陽性率的改變 與空白對照組相比，模型組脾臟單個核細胞中CD3、CD4、CD8、CD45R細胞陽性率明顯升高(P<0.01)；經(jīng)1,25(OH)2D3干預(yù)后，1,25(OH)2D3組脾臟單個核細胞中CD3、CD4、CD8、CD45R細胞陽性率與模型組比較明顯下降(P<0.01)，見表3。

表3 脾臟CD3、CD4、CD8、CD45R細胞陽性率的改變

a：P<0.01，與模型組比較

3 討 論

UC發(fā)病機制目前認為是有害物質(zhì)引起宿主反應(yīng)，使免疫失衡作用的結(jié)果，故免疫調(diào)節(jié)在本病的發(fā)病中起重要作用。1,25(OH)2D3是機體內(nèi)活性的維生素D，維生素D3受體在淋巴細胞中誘導(dǎo)表達，從而在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究表明，IL-10敲除小鼠，當維生素D缺乏時，小鼠很快自發(fā)便血、消耗等結(jié)腸炎癥狀并伴隨很高的病死率。給予足量的維生素D或1,25(OH)2D3會緩解癥狀[6-10]。

脾臟是重要的免疫器官，富含大量淋巴細胞，在免疫應(yīng)答中起調(diào)節(jié)CD4+T細胞，傳遞抗原信息，CD8+T細胞為抑制性和殺傷性T細胞，具有抑制CD4+T細胞的功能，也有免疫抑制作用，CD4+/CD8+T細胞比值是反映T淋巴細胞活性的重要指標。研究表明，人類紅細胞膜含有免疫黏附作用的C3b受體，它能清除血液循環(huán)中的免疫復(fù)合物。UC患者紅細胞免疫黏附功能降低，清除免疫復(fù)合物(CIC)的能力減退，使體內(nèi)CIC增高，即RBC-ICR增高，CIC可通過多種途徑引起免疫損傷，最終導(dǎo)致UC的發(fā)生[11-13]。

實驗結(jié)果顯示2%DSS予小鼠飲用，可造成腹瀉、血便，體質(zhì)量下降等，結(jié)腸病理可見炎性細胞浸潤和水腫，說明模型復(fù)制成功。給予1,25(OH)2D3干預(yù)后黏膜組織水腫情況有明顯改善，增加血清中RC3bR水平，降低了免疫復(fù)合物在腸道黏膜上的大量沉積；使外周脾臟細胞中CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞降低，從而調(diào)節(jié)了免疫系統(tǒng)反應(yīng)，其機制可能是通過減少免疫細胞數(shù)量，降低免疫性細胞活性，從而降低炎性細胞因子對結(jié)腸黏膜的損傷。

[1]Dupont A,Kaconis Y,Yang I,et al.Intestinal mucus affinity and biological activity of an orally administered antibacterial and anti-inflammatory peptide[J].Gut,2015,64(2):222-232.

[2]Long TM,Nisa S,Donnenberg MS,et al.Enteropathogenic Escherichia coli inhibits type Ⅰ interferon-and RNase L-mediated host defense to disrupt intestinal epithelial cell barrier function[J].Infect Immun,2014,82(7):2802-2814.

[3]Mohammadi M,Zahedi MJ,Nikpoor AR,et al.Determination of vitamin D serum levels and status of the C3435T polymorphism of multidrug resistance 1 gene in southeastern iranian patients with ulcerative colitis[J].Middle East J Dig Dis,2015,7(4):245-252.

[4]Lima CA,Lyra AC,Rocha R,et al.Risk factors for osteoporosis in inflammatory bowel disease patients[J].World J Gastrointest Pathophysiol,2015,6(4):210-218.

[5]Amiriani T,Besharat S,Pourramezan Z,et al.Correlation between low bone density and disease activity in patients with ulcerative colitis[J].Middle East J Dig Dis,2015,7(1):25-30.

[6]Del PR,Pietropaoli D,Chandar AK,et al.Association between inflammatory bowel disease and vitamin D deficiency:a systematic review and meta-analysis[J].Inflamm Bowel Dis,2015,21(11):2708-2717.

[7]Krela-Ka?mierczak I,Szymczak A,Lykowska-Szuber L,et al.The importance of vitamin D in the pathology of bone metabolism in inflammatory bowel diseases[J].Arch Med Sci,2015,11(5):1028-1032.

[8]Piodi LP,Poloni A,Ulivieri FM.Managing osteoporosis in ulcerative colitis:something new[J].World J Gastroenterol,2014,20(39):14087-14098.

[9]Mouli VP,Ananthakrishnan AN.Review article:vitamin D and inflammatory bowel diseases[J].Aliment Pharmacol Ther,2014,39(2):125-136.

[10]Ananthakrishnan AN,Cheng SC,Cai T,et al.Association between reduced plasma 25-hydroxy vitamin D and increased risk of cancer in patients with inflammatory bowel diseases[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2014,12(5):821-827.

[11]Singh D,Srivastava S,Pradhan M,et al.Inflammatory bowel disease:pathogenesis,causative factors,issues,drug treatment strategies,and delivery approaches[J].Crit Rev Ther Drug Carrier Syst,2015,32(3):181-214.

[12]Stocco G,Cuzzoni E,De Iudicibus S,et al.Thiopurine metabolites variations during co-treatment with aminosalicylates for inflammatory bowel disease:effect of N-acetyl transferase polymorphisms[J].World J Gastroenterol,2015,21(12):3571-3578.

[13]Ricanek P,Lunde LK,Frye SA,et al.Reduced expression of aquaporins in human intestinal mucosa in early stage inflammatory bowel disease[J].Clin Exp Gastroenterol,2015(8):49-67.

Effectsof1,25-dihydroxyvitaminD3onimmunefunctionofRBCandspleeninulcerativecolitismice

ZhaoHongwei1,ZhangJian1，HeLili2，LangXiaomeng3，ZhuYeshan4，LiuJianping3△

(1.DepartmentofGastroenterology,HebeiProvincialPeople′sHospital,Shijiazhuang,Hebei050051,China;2.DepartmentofGerontology,HebeiProvincialPeople′sHospital,Shijiazhuang,Hebei050051,China;3.DepartmentofSpleenandStomach,HebeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Shijiazhuang,Hebei050071,China;4.DepartmentofSpleenandStomach,TangshanMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Tanghan,Hebei063000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of 1,25-dihydroxy vitamin D3[1,25(OH)2D3] on immune mechanism of RBC and spleen in colitis model mice.MethodsThirty mice were randomly grouped as follows:blank control group,model group and 1,25(OH)2D3group.The animal models were established.Then the general condition and colon pathological changes in mice were observed,the changes of the RBC immune compound(RCIC) and RBC surface C3b receptor(RC3bR) wreath were detected by the yeast wreath method,the weight and length of spleen were measured，the positive rates of spleen immune cells were detected by flow cytometry.ResultsCompared with the model group,RBC-C3bR in the 1,25(OH)2D3group and blank control group was significantly increased and RBC-ICR was significantly decreased (P<0.01).Compared with the blank control group,the positive rates of CD3,CD4,CD8 and CD45R in spleen mononuclear cell were significantly increased (P<0.01);after the 1,25(OH)2D3intervention,the positive rates of CD3,CD4,CD8 and CD56R in spleen mononuclear cells were significantly decreased compared with the model group(P<0.01).Conclusion1,25(OH)2D3has the immune regulatory effect on RBC and peripheral spleen lymphocytes in chronic colitis mice.

1,25(OH)2D3;RBC immune;spleen lymphocytes；ulcerative colitis;chronic animal model

R974

A

1671-8348(2017)26-3617-03

2017-02-18

2017-06-06)

趙紅偉(1979-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事胃腸疾病方面研究?！?/p>

,E-mail:13603396653@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.006