徐玉玲， 謝 敏， 張 佳， 賀楨翔， 鐘林江， 劉 濤

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106)

川明參提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)建

徐玉玲， 謝 敏， 張 佳， 賀楨翔， 鐘林江， 劉 濤

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106)

為構(gòu)建川明參提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，按照《中國(guó)藥典》2015年版及相關(guān)文獻(xiàn)方法分別建立川明參提取物性狀、薄層色譜鑒別、水分、灰分、熾灼殘?jiān)⒅亟饘俚软?xiàng)目的檢查方法并規(guī)定限度.以歐前胡素為指標(biāo)，采用HPLC法測(cè)定川明參提取物中歐前胡素的含量.通過(guò)測(cè)定浸膏的吸濕性、流動(dòng)性、堆密度等物理特性，從物理、化學(xué)角度全面控制川明參提取物的質(zhì)量.結(jié)果顯示：供試品與對(duì)照品在相同位置處呈現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，清晰可見(jiàn)，分離度好.川明參提取物的水分<9.0%，灰分<12.0%，熾灼殘?jiān)?13.0%，歐前胡素含量>0.108%.川明參提取物的臨界相對(duì)濕度為52%，休止角不應(yīng)超過(guò)59.0°，堆密度不應(yīng)超過(guò)0.8 g/cm3.方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可控性高，可操作性強(qiáng)，所建標(biāo)準(zhǔn)可用于川明參提取物的質(zhì)量控制.

川明參提取物；高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；物理性質(zhì)；歐前胡素

0 引 言

川明參，別名明參、土明參等，為傘形科川明參屬植物川明參的干燥根[1]，具有滋陰、健脾等功效，常用于脾虛食少、肺陰虛證等病癥的治療[2-4]，其產(chǎn)區(qū)主要分布于四川金堂、蒼溪、巴中等地，作為可藥食兩用的藥材，川明參的市場(chǎng)需求量較大[5].川明參僅在2010年版《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》有簡(jiǎn)單的外觀性狀描述，而《中國(guó)藥典》2015年版中尚未對(duì)其收載[6].目前，中藥及中藥提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多對(duì)其中的化學(xué)成分進(jìn)行定性定量控制，但該方法可控性較差.此外，中藥提取物大都為藥品、保健食品或化妝品的中間體或原料藥，其理化性質(zhì)對(duì)于其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用有著較大的影響.本課題組前期已完成川明參提取物的制備工藝研究，為進(jìn)一步控制其質(zhì)量，本研究擬在相關(guān)技術(shù)要求和指導(dǎo)原則的基礎(chǔ)上，借鑒物理指紋圖譜的概念，研究并建立基于物理化學(xué)參數(shù)及化學(xué)成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，擬為川明參提取物在生產(chǎn)應(yīng)用中的質(zhì)量控制提供依據(jù).

1 儀器及試藥

1.1 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：P230II型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)，F(xiàn)A-2004型分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)，BS-6KH型電子天平(上海友聲衡器有限公司)，SX-2.5-10型馬弗爐、DZF-6050A型真空恒溫干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，HH-6型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)，DZTW型電子調(diào)溫電熱套(天津市靜?？h工興電器廠)，酒精計(jì)(河北省武強(qiáng)縣同輝儀表廠).

1.2 試 藥

實(shí)驗(yàn)所用試藥包括：川明參，共3批，分別采收于四川省蒼溪縣龍山鎮(zhèn)、閬中市老觀鎮(zhèn)構(gòu)溪鄉(xiāng)和閬中市千佛鎮(zhèn)，經(jīng)成都大學(xué)劉濤研究員檢驗(yàn)為傘形科植物川明參的干燥根；川明參提取物(批號(hào)，20160312、20160318、20160426、20160517、20160518、20160723、20161010、20170104、20170113、20170206)，自制；歐前胡素對(duì)照品(批號(hào)，16070704，HPLC≥98%)，四川省維克奇生物科技有限公司；銅(單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液GSB 04-1725-2004)、汞(單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液GSB 04-1729-2004)、砷(單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液GSB 04-1714-2004)、鎘(單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液GSB 04-1721-2004)、鉛(單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液GSB 04-1742-2004)；甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 制備方法

稱(chēng)取川明參藥材適量，加入6倍量60%乙醇，每次提取0.5 h，共3次，合并提取液，均勻混合后抽濾，取濾液并濃縮至密度約為1.1，制得浸膏，并將浸膏在80 ℃條件下減壓干燥.

測(cè)量結(jié)果表明，10批川明參提取物(批號(hào)為，20160312、20160318、20160426、20160517、20160518、20160723、20161010、20170104、20170113、20170206)的出膏率分別為，17.13%、14.32%、6.24%、6.08%、5.75%、15.32%、11.66%、16.32%、14.32%、10.38%.

2.2 性狀觀察

取川明參提取物樣品，進(jìn)行性狀觀察，并規(guī)定其性狀標(biāo)準(zhǔn)為:本品為均勻黃褐色粉末，氣芳香，味微苦.

2.3 物理性質(zhì)

2.3.1 臨界相對(duì)濕度測(cè)定.

選取川明參提取物(批號(hào)為，20170104、20170113、20170206),研磨成細(xì)粉,待用.分別稱(chēng)取1 g左右的浸膏粉末，平鋪于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，稱(chēng)重并干燥至恒重，備用.配制4種濃度不同的硫酸溶液，分別置干燥器中，密閉放置12 h，使其內(nèi)部環(huán)境濕度分別為48%、51%、55.4%、61.2%.將已恒重的樣品精密稱(chēng)重后置于不同濕度環(huán)境的干燥器中，每個(gè)干燥器中放3份，放置48 h后，25 ℃恒溫吸濕至恒重，精密稱(chēng)重并計(jì)算吸濕百分率計(jì)算公式見(jiàn)式(1)，

(1)

以吸濕百分率為縱坐標(biāo)，RH%為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖1、表1所示.

圖1吸濕百分率與相對(duì)濕度關(guān)系圖

繪制如圖1所示吸濕曲線兩端的切線，兩切線交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)即為臨界相對(duì)濕度(critical relative humidity,CRH)，由此測(cè)得此浸膏的CRH為52%.

表1 不同相對(duì)濕度條件下浸膏吸濕率

2.3.2 流動(dòng)性(休止角)測(cè)定.

將3只漏斗串聯(lián)后固定于水平放置的坐標(biāo)紙上的適宜高度處，將浸膏粉末緩緩地倒入最上面的漏斗中，直到最下面的漏斗形成的圓錐體粉末尖端接觸到漏斗下口為止，測(cè)出圓錐底部的直徑(2R)及漏斗下口距坐標(biāo)紙的距離(H).根據(jù)，α=tan-1(H/R)，計(jì)算休止角α，其結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 粉末休止角

結(jié)果表明，川明參提取物粉末的平均休止角為49.18 °，高于40 °，休止角較大，流動(dòng)性較差.按照平均值的+20%規(guī)定其限度，規(guī)定本品休止角不得超過(guò)59.0 °.

2.3.3 堆密度測(cè)定.

取浸膏粉末適量，小心裝入10 cm3的量筒中，每隔2 s用玻璃棒輕輕擊打量筒5 cm處，共擊4次，直到裝滿10 cm3的量筒.根據(jù)量筒中樣品質(zhì)量(W)除以量筒的容積，計(jì)算樣品的堆密度ρ.4批浸膏樣品的堆密度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 粉末堆密度

結(jié)果表明，川明參提取物粉末的平均堆密度為0.66 g/cm3.按照平均值的+20%規(guī)定其限度，規(guī)定本品堆密度不得超過(guò)0.8 g/cm3.

2.4 薄層色譜定性鑒別研究

2.4.1 對(duì)照品溶液制備.

稱(chēng)取歐前胡素適量，加甲醇制成每1 mL含0.24 mg歐前胡素的對(duì)照品溶液.

2.4.2 供試品溶液制備.

稱(chēng)取川明參提取物(批號(hào)，20160312)約0.5 g，加入乙醚10 mL，超聲處理20 min，使之充分溶解，濾過(guò)，濾液揮干，加乙酸乙酯2mL溶解殘?jiān)频霉┰嚻啡芤?

2.4.3 川明參提取物的薄層色譜鑒別.

分別吸取供試品溶液及對(duì)照品溶液各6 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)—乙醚(1∶5)為展開(kāi)劑，待其展開(kāi)，取出晾干，置于紫外光燈(365 nm)下檢視.結(jié)果顯示，供試品色譜中與歐前胡素對(duì)照品在相同位置處顯相同顏色的斑點(diǎn)(見(jiàn)圖2).

1、3為對(duì)照品溶液，2、4為供試品溶液

圖2川明參提取物薄層色譜圖

2.5 檢 測(cè)

2.5.1 水 分.

取10批川明參提取物細(xì)粉適量，精密稱(chēng)定，按照《中國(guó)藥典》2015年版四部的水分測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 水分含量測(cè)定結(jié)果

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，所測(cè)樣品水分含量最高為7.88%，最低為6.37%，平均為7.69%.按照平均值的+20%規(guī)定其限度，規(guī)定本品水分不得超過(guò)9.0%.

2.5.2 灰 分.

取6批川明參提取物細(xì)粉約2 g，精密稱(chēng)定，按照《中國(guó)藥典》2015版四部的總灰分測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5.

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，所測(cè)樣品灰分含量最高為11.64%，最低為8.31%，平均為10.02%.按照平均值的+20%規(guī)定其限度，規(guī)定本品灰分不得超過(guò)12.0%.

表5 灰分測(cè)定結(jié)果

2.5.3 熾灼殘?jiān)?

取6批川明參提取物細(xì)粉約1.5 g，精密稱(chēng)定，按照《中國(guó)藥典》2015年版四部的熾灼殘?jiān)鼨z查法進(jìn)行檢查，結(jié)果見(jiàn)表6.

表6 熾灼殘?jiān)鼨z查結(jié)果

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，所測(cè)樣品熾灼殘?jiān)孔罡邽?2.47%，最低為8.42%，平均為10.84%.按照平均值的+20%規(guī)定其限度，規(guī)定本品熾灼殘?jiān)坏贸^(guò)13.0%.

2.5.4 重金屬及有害元素.

取5批次川明參提取物細(xì)粉約1.5 g，精密稱(chēng)定，按照《中國(guó)藥典》2015年版四部的鉛(Pb)、鎘(Cd)、銅(Cu)、砷(As)、汞(Hg)測(cè)定法進(jìn)行含量檢查，結(jié)果見(jiàn)表7.

表7 重金屬及有害元素檢查結(jié)果(mg·kg-1)

根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版的相關(guān)規(guī)定，規(guī)定本品鉛不超過(guò)5 mg/kg、鎘不超過(guò)0.3 mg/kg、銅不超過(guò)20 mg/kg、砷不超過(guò)2.0 mg/kg、汞不超過(guò)0.2 mg/kg.

2.6 川明參提取物含量測(cè)定

2.6.1 色譜條件.

實(shí)驗(yàn)色譜條件為：色譜柱為Global Chromatography C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相為甲醇—水(62∶38)；流速為1 mL·min-1；柱溫為20 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm.

2.6.2 對(duì)照品溶液制備.

稱(chēng)取歐前胡素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇25 mL，制成每毫升含0.24 mg歐前胡素的對(duì)照品溶液.精密移取0.24 mg/mL歐前胡素對(duì)照品溶液5 mL于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度線，搖勻，制得48.00 μg/mL的對(duì)照品溶液.

2.6.3 供試品溶液制備.

稱(chēng)取明參提取物粉末(60目)1 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液5 mL于10 mL的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，微孔濾膜濾過(guò)，制得供試品溶液.

2.6.4 線性關(guān)系考察.

分別精密移取歐前胡素對(duì)照品溶液3、4、5、6、7 mL于10 mL容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻.在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定歐前胡素峰面積，并以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程，Y=3 622.8X+5.611(r=0.9997).結(jié)果表明，歐前胡素的進(jìn)樣量在0.144～0.336 ug范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系.

2.6.5 精密度實(shí)驗(yàn).

精密吸取“2.6.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算其RSD.結(jié)果顯示，RSD值為0.47%，表明儀器精密度良好.

2.6.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn).

取同一批次川明參提取物粉末(批號(hào)，20161010)，平行6份，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算其RSD.結(jié)果顯示，RSD值為1.99%，表明該方法重現(xiàn)性良好.

2.6.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn).

精密吸取同一供試品溶液，分別于 0、1、2、3、4、5、6、7、8 h后進(jìn)樣.結(jié)果顯示，RSD值為1.38%，表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.6.8 加樣回收實(shí)驗(yàn).

精密稱(chēng)取含有量已知的川明參提取物粉末(批號(hào)，20161010)共6份，每份0.5 g，各加入歐前胡素對(duì)照品溶液適量，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表8.結(jié)果顯示，RSD值為2.07%，表明回收率良好.

表8 歐前胡素加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6.9 樣品含量測(cè)定.

取10批川明參提取物，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定歐前胡素的峰面積，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算出各批次提取物中歐前胡素的含量，結(jié)果如表9所示.

表9 各批次提取物含量測(cè)定

結(jié)果顯示，所測(cè)樣品中歐前胡素含量平均為0.135%.按照平均值的-20%規(guī)定其限度，規(guī)定川明參中歐前胡素的含量不低于0.108%.

3 結(jié) 語(yǔ)

川明參為我國(guó)特有的單種屬植物，但該藥材尚未收載入相關(guān)藥典標(biāo)準(zhǔn)，缺乏合適的質(zhì)量控制方法.本課題組在完成川明參提取物制備工藝基礎(chǔ)上[8]，以川明參提取物為研究對(duì)象，初步測(cè)定其物理化學(xué)性質(zhì).研究結(jié)果表明，采用物理參數(shù)控制提取物的質(zhì)量，可更直觀全面地展現(xiàn)和控制提取物的質(zhì)量.

中藥浸膏的物理性質(zhì)是影響浸膏質(zhì)量的重要因素，與固體制劑成型工藝密切相關(guān).中藥浸膏的質(zhì)量控制不應(yīng)僅局限于指標(biāo)成分的含量測(cè)定、定性鑒別、外觀性狀及檢查，還應(yīng)加入堆密度、吸濕性、流動(dòng)性等物理指標(biāo).本研究為了建立基于物理化學(xué)特性的川明參提取物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和體系，對(duì)提取物的3個(gè)物理參數(shù)，即吸濕性、流動(dòng)性與堆密度進(jìn)行了測(cè)定，從物理化學(xué)角度控制川明參提取物的質(zhì)量.

研究發(fā)現(xiàn)，川明參根部主要化學(xué)成分為多糖類(lèi)、香豆素類(lèi)及黃酮類(lèi)等[9].本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，川明參提取物中7-甲基香豆素含量過(guò)低，不能將其作為指標(biāo)成分，而歐前胡素具有平喘、抗過(guò)敏等作用，性質(zhì)較穩(wěn)定，具有較大的研究?jī)r(jià)值，故確定選擇以歐前胡素作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[10-11].

本研究按照確定的制備工藝，由3批不同產(chǎn)地的川明參藥材制備出了不同批次的川明參提取物，用于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.基于充分的物理性質(zhì)研究和定性、定量分析，建立了川明參提取物的質(zhì)量控制方法和標(biāo)準(zhǔn)，涉及性狀、物理性質(zhì)、薄層色譜鑒別以及含量測(cè)定.在薄層色譜鑒別方法考察過(guò)程中，分別選擇了氯仿—甲醇(2∶1)、二氯甲烷—甲醇(1∶1)、石油醚(60～90 ℃)—乙醚(3∶2)、以石油醚(60～90 ℃)∶乙醚(1∶5)等多種溶劑系統(tǒng)比較對(duì)歐前胡素的薄層展開(kāi)效果.結(jié)果表明，以石油醚(60～90 ℃)—乙醚(1∶5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)效果較好，斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)、分離度好.采用HPLC法，以歐前胡素作為檢測(cè)指標(biāo)，測(cè)定其含量并規(guī)定川明參提取物中歐前胡素含量不得低于0.108%.本研究所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可控性高，能全面有效地控制川明參提取物的質(zhì)量，為川明參提取物的質(zhì)量控制提供了可靠保障.

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Abstract:According to the “Chinese Phar-macopoeia” 2015 edition and based on the literature method,the quality standard of Chuanminshen violanceum extract is respectively established for its characters,TLC,physical properties,water content,ash content,residue on ignition,heavy metals,and other items.The corresponding limits are constituted.The imperatorin is used as an index,and the HPLC is applied to determine the contents of imperatorin for Chuanminshen violanceum extract.Through the test of the moisture obsorption performance,mobility and bulk density,etc.,of the extract,the quality of the extract is controlled completely from both physical and chemical perspective.The experimental results show that the sample extract and the contrast extract take on fluorescent spots of the same color and have good resolution which can be clearly seen at the same position.CRH of Chuanminshen violanceum extract is 52%,angle of repose is no more than 59.0°,bulk density is no more than 0.8 g/cm3,water<9.0%,ash<12.0%,residue on ignition <13.0%,imperatorin is <0.108%.It is thus demonstrated that the methods are accurate and reliable,with strong repeatability,controllability,operability,so that it can be used for the study of the quality standard of Chuanminshenviolanceum extract.

Keywords:Chuanminshen violaceum extract;HPLC;quality standard;physical property;imperatorin

ConstructionofQualityStandardofChuanminshenViolanceumExtract

XUYuling,XIEMin,ZHANGJia,HEZhenxiang,ZHONGLinjiang,LIUTao

(School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

1004-5422(2017)03-0230-05

2017-06-01.

四川省千人計(jì)劃(2013332)資助項(xiàng)目.

徐玉玲(1975 — )， 女， 碩士， 高級(jí)工程師， 從事中藥制劑開(kāi)發(fā)與中成藥質(zhì)量再評(píng)價(jià)研究.

R284.2

A

文章編號(hào)：1004-5422(2017)03-0235-04