張 煜 孟冬麗 楊 磊 張 偉 卜勇軍 吳 輝 石如玲

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

高飽和脂肪飲食對(duì)老年大鼠學(xué)習(xí)記憶和腦Aβ生成的影響及機(jī)制

張 煜 孟冬麗 楊 磊1張 偉 卜勇軍2吳 輝2石如玲2

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的觀察高飽和脂肪飲食對(duì)老年大鼠學(xué)習(xí)記憶和腦β-淀粉樣蛋白(Aβ)生成的影響及機(jī)制。方法26只雄性老年大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和高飽和脂肪組各13只，對(duì)照組大鼠給予正常飼料，高飽和脂肪組大鼠給予含15%牛油飼料，喂養(yǎng)3個(gè)月。用Morris水迷宮測(cè)定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定海馬Aβ含量，用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腦內(nèi)β-淀粉樣前體蛋白(APP)表達(dá)，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清及腦組織總超氧化物歧化酶(SOD)活性。結(jié)果與對(duì)照組相比，高飽和脂肪組大鼠平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，穿越原平臺(tái)所在位置次數(shù)顯著減少(P<0.01)，腦皮質(zhì)和海馬區(qū)APP蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.01，P<0.05)，海馬Aβ含量顯著升高(P<0.01)，血清及腦組織總SOD水平均顯著降低(P<0.01，P<0.05)。結(jié)論高飽和脂肪飲食降低學(xué)習(xí)記憶能力、增加APP和Aβ水平，其機(jī)制可能與降低腦抗氧化能力有關(guān)。

高飽和脂肪；學(xué)習(xí)記憶；β-淀粉樣蛋白；氧化應(yīng)激；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(AD)病因至今不明。β-淀粉樣蛋白(Aβ)是AD老年斑的主要成分，來(lái)自于β-淀粉樣前體蛋白(APP)的裂解，Aβ的過(guò)度產(chǎn)生和聚集是AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。食物脂肪類(lèi)型與大腦認(rèn)知功能及AD發(fā)生相關(guān)，攝入過(guò)多飽和脂肪使AD發(fā)生率升高，而補(bǔ)充多不飽和脂肪則保護(hù)認(rèn)知功能，降低AD的發(fā)生〔1～3〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)食物中增加飽和脂肪及膽固醇損害大鼠認(rèn)知能力〔4,5〕。本實(shí)驗(yàn)觀察高飽和脂肪飲食對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦Aβ生成的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組及取材 將雄性老年SD大鼠20月齡，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，分為對(duì)照組和高飽和脂肪組，每組13只。對(duì)照組大鼠給予普通飼料，高飽和脂肪組給予高飽和脂肪飼料(普通飼料+15%牛油)，喂養(yǎng)3個(gè)月。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束1 w后，每組各取3只大鼠，麻醉后4%多聚甲醛全身灌流固定，取腦用于APP免疫組化染色。其余大鼠禁食一夜，麻醉后股動(dòng)脈放血處死。取血分離血清-20℃保存，用于測(cè)定血清總超氧化物歧化酶(SOD)活性。迅速剝腦，分離海馬和大腦皮質(zhì)置于液氮中，然后-80℃保存，用于測(cè)定Aβ和總SOD。

1.2試劑與儀器 主要試劑：Aβ酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(Cusabio公司)、APP單克隆抗體6E10(英國(guó)Abcam公司)、二抗和免疫組織化學(xué)染色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)、SOD測(cè)定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；主要儀器：Morris水迷宮(上海移數(shù)信息科技有限公司)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo公司)、分光光度計(jì)(UNICO公司)、光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)、形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá))。

1.3Morris水迷宮測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 正式實(shí)驗(yàn)前1 d讓大鼠自由游泳2 min熟悉水迷宮環(huán)境。采用定位航行實(shí)驗(yàn)測(cè)量學(xué)習(xí)能力，歷時(shí)4 d。每天訓(xùn)練3次，每次訓(xùn)練間隔4 min，每次訓(xùn)練隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)。將大鼠面向池壁放入水池，同一次訓(xùn)練所有大鼠入水點(diǎn)相同。記錄2 min內(nèi)找到水下平臺(tái)所需的時(shí)間，即逃避潛伏期。如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，將其引至平臺(tái)，這時(shí)潛伏期計(jì)為120 s。將3次訓(xùn)練的逃避潛伏期取平均值，反映大鼠的學(xué)習(xí)能力。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，第5天撤除水下平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)測(cè)定記憶能力。在同一入水點(diǎn)將大鼠放入水中，記錄其120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.4APP免疫組織化學(xué)染色及圖像分析 將固定后的腦組織脫水、包埋、切片(厚度5 μm)等處理，石蠟切片脫蠟至水后，過(guò)氧化物酶封閉，用甲酸修復(fù)抗原，采用SP法染色，鼠抗APP抗體1∶50稀釋。顯微鏡下觀察大腦皮質(zhì)和海馬APP陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目，陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)呈棕黃色。400倍光鏡下掃描海馬和皮質(zhì)圖像，用視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值表示海馬或皮質(zhì)APP的蛋白表達(dá)量。

1.5ELISA測(cè)定海馬Aβ40的含量 稱(chēng)取100 mg海馬組織加入1 ml冷磷酸鹽緩沖液(PBS)冰浴電動(dòng)勻漿，勻漿液反復(fù)凍融2次后，4℃離心，8 000 r/min，10 min，取上清用于Aβ40含量檢測(cè)。

1.6血清及腦皮質(zhì)總SOD活性的測(cè)定 用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定總SOD活性。待測(cè)腦皮質(zhì)加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，4℃離心，3 000 r/min，10 min，上清用于總SOD活性測(cè)定及蛋白定量；血清直接用于總SOD活性測(cè)定。SOD活性測(cè)定方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 定位航行試驗(yàn)中，高飽和脂肪組平均逃避潛伏期〔(51.31±12.70)s〕較對(duì)照組顯著延長(zhǎng)〔(42.65±9.63)s，P<0.05〕，表明高飽和脂肪飲食使大鼠學(xué)習(xí)能力下降?？臻g探索試驗(yàn)中，飽和脂肪組穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)〔(4.27±1.16)次〕較對(duì)照組顯著減少〔(5.83±1.26)次，P<0.01〕，表明高飽和脂肪飲食使大鼠記憶能力降低。

2.2皮質(zhì)和海馬區(qū)APP免疫組織化學(xué)染色 APP陽(yáng)性反應(yīng)物為棕黃色，分布于細(xì)胞膜及胞質(zhì)，細(xì)胞核不顯色。與對(duì)照組相比，高飽和脂肪組皮質(zhì)(0.269±0.029)和海馬各區(qū)(0.127±0.010)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，著色增強(qiáng)較對(duì)照組顯著增高(0.185±0.014，0.105±0.008，P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組皮質(zhì)和海馬APP表達(dá)(DAB，×400)

2.3海馬Aβ40含量 高飽和脂肪組海馬Aβ40含量〔(2.77±0.44)pg/mg〕較對(duì)照組〔(1.84±0.62)pg/mg〕顯著增高，是對(duì)照組的1.5倍(P<0.01)。

2.4血清及腦組織總SOD活性 與對(duì)照組血清〔(92.42±4.72)×103U/L〕和腦組織總SOD〔(148.42±13.91)×103U/g〕活性相比，高飽和脂肪組血清〔(82.47±9.47)×103U/L〕及腦組織總SOD活性〔(132.18±11.6)×103U/g〕均顯著降低(P<0.01，P<0.05)。

3 討 論

研究表明高飽和脂肪飲食損害學(xué)習(xí)記憶能力、增加AD發(fā)生率〔5,6〕。本研究表明高飽和脂肪飲食對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力具有損害作用。Aβ是各種原因誘發(fā)AD的關(guān)鍵因子，在啟動(dòng)AD的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)高飽和脂肪飲食大鼠不僅腦內(nèi)APP表達(dá)增多，海馬Aβ40水平也升高，從整體水平上證明高飽和脂肪飲食促進(jìn)APP表達(dá)和Aβ生成，這可能是高飽和脂肪飲食增加AD的機(jī)制之一。研究表明氧化應(yīng)激可增加APP、β分泌酶表達(dá)，促進(jìn)Aβ生成〔7〕；Aβ增多又通過(guò)增強(qiáng)氧化應(yīng)激進(jìn)一步促進(jìn)Aβ產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)〔8〕。SOD是機(jī)體抗氧化體系的重要酶之一，其活力的高低反映機(jī)體清除氧自由基的能力。研究表明高脂飲食增強(qiáng)氧化應(yīng)激〔9〕，降低SOD活性〔10〕。本研究也發(fā)現(xiàn)高飽和脂肪飲食大鼠血清及腦組織抗氧化酶SOD總活性降低，推測(cè)高飽和脂肪飲食降低學(xué)習(xí)記憶能力、促進(jìn)Aβ生成的機(jī)制可能與腦抗氧化能力降低有關(guān)。

1Solfrizzi V,Panza F,Frisardi V,etal.Diet and Alzheimer′s disease risk factors or prevention:the current evidence〔J〕.Exp Rev Neurother,2011;11(5):677-708.

2Morris MC,Tangney CC.Dietary fat composition and dementia risk〔J〕.Neurobiol Aging,2014;35(2):S59-64.

3Lim GP,Calon F,Morihara T,etal.A diet enriched with the omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid reduces amyloid burden in an aged Alzheimer mouse model〔J〕.J Neurosci,2005;25(12):3032-40.

4Granholm AC,Bimonte-Nelson HA,Moore AB,etal.Effects of a saturated fat and high cholesterol diet on memory and hippocampal morphology in the middle-aged rat〔J〕.J Alzheimers Dis,2008;14(2):133-45.

5Oksman M,Iivonen H,Hogyes E,etal.Impact of different saturated fatty acid,polyunsaturated fatty acid and cholesterol containing diets on beta-amyloid accumulation in APP/PS1 transgenic mice〔J〕.Neurobiol Dis,2006;23(3):563-72.

6Berti V,Murray J,Davies M,etal.Nutrient patterns and brain biomarkers of Alzheimer′s disease in cognitively normal individuals〔J〕.J Nutr Health Aging,2015;19(4):413-23.

7Arimon M,Takeda S,Post KL,etal.Oxidative stress and lipid peroxidation are upstream of amyloid pathology〔J〕.Neurobiol Dis,2015;84(15):109-19.

8Standridge JB.Vicious cycles within the neuropathophysiologic mechanisms of Alzheimer′s disease〔J〕.Curr Alzheimer Res,2006;3(2):95-108.

9Noeman SA,Hamooda HE,Baalash AA.Biochemical study of oxidative stress markers in the liver,kidney and heart of high fat diet induced obesity in rats〔J〕.Diabetol Metab Syndr,2011;3(1):17.

10Ozay R,Uzar E,Aktas A,etal.The role of oxidative stress and inflammatory response in high-fat diet induced peripheral neuropathy〔J〕.J Chem Neuroanat,2014;55:51-7.

〔2016-09-06修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

Effectofhigh-saturated-fatdietonlearningandmemoryandAβgenerationofagedratbrainanditsmechanism

ZHANGYu，MENGDong-Li，YANGLei，etal.

DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology，XinxiangMedicalUniversity，Xinxiang453003，Henan，China

ObjectiveTo explore the effects of high-saturated-fat diet on learning and memory and Aβ generation of rat brain and investigate its mechanism.MethodsTwenty six males aged rats were randomly divided into control and high-saturated-fat groups (n=13 each). The control group was given a normal diet, and the high-saturated-fat group was given high-saturated-fat diet containing 15% beef tallow for three months. The spatial learning and memory abilities were examined by Morris water maze test. Aβ40 content in hippocampal was measured by ELISA. β-amyloid-precursor protein (APP) expression was measured by immunohistochemistry staining. Serum and brain total superoxide dismutase (SOD) activities were measured by detecting xanthine oxidase activity.ResultsCompared with the control group, the average escape latency prolonged and platform crossing number were decreased in the high-fat group. Cerebral cortex and hippocampus APP protein expression and hippocampal Aβ40 content were increased significantly in the high-fat group. Total SOD activities in serum and brain tissue in the high-fat group were significantly lower than those of control group.ConclusionsHigh-saturated-fat diet might reduce the ability of learning and memory and promote Aβ generation, and its mechanism might be related to decreasing antioxidant capacity of brain.

Saturated fat; Learning and memory; β-amyloid; Oxidative stress; Alzheimer′s disease

Q547;R741

A

1005-9202(2017)19-4705-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.007

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81500984)；河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.152102310112)

1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院 2 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院

石如玲(1970-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事脂類(lèi)代謝與老年癡呆發(fā)病機(jī)制研究。

張 煜(1977-)，男，講師，主要從事老年癡呆發(fā)病機(jī)制研究。