金 華 劉志軍 顏春魯 劉峰林 陳 麗 張秋菊 徐厚謙 胡繼宏 竇榮海 溫鑫洋

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

貝那普利和氨氯地平對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠酪酪肽表達(dá)的影響

金 華 劉志軍 顏春魯 劉峰林 陳 麗 張秋菊 徐厚謙 胡繼宏 竇榮海 溫鑫洋

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

目的探討貝那普利和氨氯地平對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)酪酪肽(PYY)表達(dá)的影響。方法14周齡雄性SHR 45只隨機(jī)分為模型組(n=15)、貝那普利組(鹽酸貝那普利灌服0.90 mg·kg-1·d-1，n=15)、氨氯地平組(苯磺酸氨氯地平灌服0.45 mg·kg-1·d-1，n=15)，以同源雄性WKY大鼠作為正常對(duì)照(n=15)，模型組及WKY 組每日灌服同體積的蒸餾水，干預(yù)8 w后，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中PYY的含量，采用免疫組化法和RT-PCR法分別檢測(cè)結(jié)腸中PYY及其mRNA的表達(dá)。結(jié)果干預(yù)8 w后，模型組血清中PYY及其mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，各給藥組血清中PYY及其mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與WKY組比較，模型組結(jié)腸組織中PYY及其mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，貝那普利組與氨氯地平組結(jié)腸組織中PYY及其mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，與貝那普利組比較，氨氯地平組結(jié)腸組織中PYY及其mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。結(jié)論SHR大鼠結(jié)腸組織中PYY調(diào)節(jié)失衡，貝那普利、氨氯地平的降壓作用很可能還通過(guò)調(diào)節(jié)PYY的表達(dá)而達(dá)到降壓目的。

自發(fā)性高血壓大鼠；酪酪肽；貝那普利；氨氯地平

酪酪肽(PYY)是由36個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，主要分布在腸道遠(yuǎn)端的內(nèi)分泌L-細(xì)胞，是一種重要的胃腸激素類腦腸肽。PYY3-36是PYY的主要存在形式，PYY可自由通過(guò)血腦屏障與下丘腦弓狀核Y2受體結(jié)合〔1〕。然而，有關(guān)PYY這一高相關(guān)胃腸激素在高血壓發(fā)病過(guò)程中的變化及ACEI、CCB等藥物對(duì)其的影響尚無(wú)實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)擬分析自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)PYY的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 14周齡SPF級(jí)雄性SHR 45只，體重(350±20)g；同源雄性 WKY大鼠15只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(恒溫22℃±2℃，恒濕55%±5%，人工光照明暗各12 h)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 45只SHR常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為模型組、貝那普利組、氨氯地平組各15只；同時(shí)以WKY大鼠15只作為正常對(duì)照組。以蒸餾水為溶劑配制貝那普利和氨氯地平混懸液，貝那普利組灌服貝那普利0.90 mg·kg-1·d-1；氨氯地平組灌服氨氯地平0.45 mg·kg-1·d-1。模型組及正常對(duì)照組每日灌服同體積的蒸餾水。共干預(yù)8 w。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于灌胃不當(dāng)?shù)仍驅(qū)е聜€(gè)別動(dòng)物死亡。

1.3藥物、試劑和儀器 鹽酸貝那普利(洛汀新，10 mg，北京諾華制藥有限公司，批號(hào)：X1936)，苯磺酸氨氯地平(絡(luò)活喜，5 mg，輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：1205120)。PYY酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)20130402B)。PYY一抗，批號(hào)為：ab15879，Lot：147843-1；Goat anti-Rabbit IgG(H+L)，ab6702；上述均購(gòu)置于美國(guó)abcam公司。免疫組化染色試劑盒購(gòu)置于武漢博士德生物工程有限公司。RNA提取試劑盒(QIAGEN公司，批號(hào)74104)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche公司)、熒光染料(Roche公司)、PCR引物(金唯智生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成)、全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(Bio-Rad公司，型號(hào)iMark)、熒光PCR儀(Bio-Rad公司，型號(hào)CFX96)、凝膠掃描成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)、電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)FA2004N)、醫(yī)用低速離心機(jī)(金壇市恒豐儀器廠，型號(hào)LX-820)等。

1.4取血 末次給藥24 h后，并禁食 10 h(過(guò)夜)，次日測(cè)量所有大鼠的體質(zhì)量，隨后腹腔注射10%的水合氯醛(1.5 ml/100 g體質(zhì)量) 麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血5 ml，4℃ 3 500 r/min(半徑7 cm)離心15 min，分離血清，-20℃保存，待測(cè)。

1.5血清中PYY含量的檢測(cè) 用ELISA檢測(cè)血清中PYY的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作。批內(nèi)變異系數(shù)為8.5%，批間變異系數(shù)為13.5%。

1.6免疫組化法測(cè)定結(jié)腸中PYY的表達(dá) 取部分結(jié)腸組織，作適當(dāng)?shù)男拚蠓湃?%多聚甲醛中固定。①石蠟切片：40℃過(guò)夜，60℃烤片1 h；②常規(guī)脫蠟至水；③抗原修復(fù)：枸櫞酸緩沖液(pH6.0)恒溫水浴至95℃～98℃，放入玻片，維持60 min；室溫放置自然冷卻，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次；④滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉液，避光室溫孵育10 min；PBS沖洗5 min×3次；⑤封閉：滴加正常山羊血清，37℃孵育15 min，甩干不洗；⑥滴加稀釋5-HT抗體，然后4℃過(guò)夜。用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，約12～16 h；次日取出，室溫放置10 min，PBS洗5 min×3次；⑦滴加二抗工作液，37℃孵育30 min；PBS洗5 min×3次；⑧滴加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育15 min；PBS洗5 min×3次；⑨DAB顯色：DAB按試劑說(shuō)明書配置，鏡下觀察，至目的組織出現(xiàn)陽(yáng)性顆粒而周圍組織無(wú)非特異顯色時(shí)，蒸餾水終止；⑩蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1～2 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，鏡下控制，自來(lái)水返藍(lán)10 min；脫水、透明、封片。

1.7RT-RCR法測(cè)定結(jié)腸中PYY mRNA表達(dá) ①總RNA的提?。喝?0 mg組織提取總RNA，液氮速凍后碾磨組織，加入600 μl RLT裂解液裂解組織，將所得溶液于離心機(jī)4℃、12 000 r/min(半徑7 cm)離心3 min；加入70%乙醇600 μl后，立即轉(zhuǎn)移700 μl溶液(包括沉淀)至柱子上，離心15 s，完全濾過(guò)溶液；分別加入700 μl Buffer RW1、500 μl Buffer RPE，按上述條件離心，棄濾液，加入500 μl Buffer RPE離心2 min，棄濾液；將柱子移入至新的2 ml試管中，離心1 min干燥濾膜，將柱子移入之新的1.5 ml試管中加入30～50 μl無(wú)酶水，離心1 min得到RNA；同時(shí)取2 μl RNA樣品稀釋50倍后測(cè)定樣品在260 nm和280 nm的吸收值，OD260/280 在1.8～2.0視為提取的總RNA質(zhì)量純度較好。② 逆轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA：使用羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒(No 0489686-6001)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄總mRNA，合成第一鏈cDNA文庫(kù)，反應(yīng)產(chǎn)物在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。反?yīng)條件：25℃、10 min，55℃、30 min，85℃、5 min，4℃保存。引物設(shè)計(jì)與合成：β-actin：正義：3′AGGGAAATCGTGCGTGAC5′，反義：3′CGCTCATTGCCGATAGTG5′；PYY：正義：3′CTGCGCCACTACCTCAAVVT5′，反義：3′TCTCGCTGTCGTCTGTGAAGA5′。③cDNA的PCR擴(kuò)增：使用FastStart Universal SYBR Green MASTER(ROX)，實(shí)驗(yàn)步驟參照其說(shuō)明書，采用總體積50 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃、5 min，95℃、10 s，55℃、20 s，75℃、30 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-△△CT法做相對(duì)定量分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1血清中PYY含量的變化 與正常對(duì)照組(0.74±0.03)比較，模型組PYY血清濃度(0.80±0.07)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組(0.82±0.05)和氨氯地平組(0.79±0.08)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2PYY在結(jié)腸中的表達(dá) PYY在各組大鼠的結(jié)腸中均有表達(dá)。與正常對(duì)照組(81.15±0.35)比較，模型組PYY的表達(dá)(94.89±0.83)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組和氨氯地平組(97.13±0.30，82.38±0.87)明顯降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，氨氯地平組明顯降低(P<0.05)。鏡下觀察顯示，PYY在黏膜下腺體上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)較弱，而在黏膜層底部表達(dá)增強(qiáng)，正常對(duì)照組PYY在黏膜層底部表達(dá)較弱，模型組PYY在黏膜層底部表達(dá)增強(qiáng)，貝那普利組和氨氯地平組PYY在黏膜層底部表達(dá)減弱，而氨氯地平組的表達(dá)減弱更顯著，見圖1。

2.3PYY mRNA在結(jié)腸中的表達(dá) 與正常對(duì)照組(0.27±0.07)比較，模型組PYY mRNA在結(jié)腸中的表達(dá)(1.00±0.32)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組和氨氯地平組(0.92±0.09，0.31±0.09)表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，氨氯地平組表達(dá)降低(P<0.05)。

2.4PYY 在結(jié)腸中的蛋白表達(dá) PYY蛋白在WKY組結(jié)腸組織中處于低表達(dá)狀態(tài)。與正常對(duì)照組(0.68±0.02)比較，模型組結(jié)腸組織中PYY蛋白表達(dá)(1.04±0.05)升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組和氨氯地平組(0.89±0.03，0.76±0.04)蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)；與貝那普利組比較，氨氯地平組蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)。見圖2。

圖1 各組大鼠結(jié)腸中PYY表達(dá)(免疫組化染色，×400)

圖2 各組大鼠結(jié)腸中PYY蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

研究表明，胃腸激素是消化系統(tǒng)和心血管的一類重要調(diào)節(jié)因子，胃腸激素調(diào)節(jié)異?？赡苁歉哐獕喊l(fā)病的重要因素〔2〕。胃腸激素通過(guò)“迷走傳入神經(jīng)-孤束核”將信號(hào)傳導(dǎo)至下丘腦弓狀核，進(jìn)而參與食物攝入和能量平衡的調(diào)節(jié)〔3，4〕。PYY是含有 36 個(gè)氨基酸的直鏈多肽類物質(zhì)，是一種重要的胃腸激素。PYY主要有PYY1-36和PYY3-36兩種類型，而PYY3-36是血液循環(huán)中的主要存在形式〔5〕。PYY作為一種調(diào)節(jié)肽，通過(guò)位于靶細(xì)胞的PYY受體向組織細(xì)胞內(nèi)傳遞信息〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)〔7〕，迷走神經(jīng)、腦干介導(dǎo)的通路通過(guò)PYY3-36 而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，Y2 受體就位于迷走傳入神經(jīng)的終端，如果腹部切斷迷走神經(jīng)或者橫斷丘腦-后腦將會(huì)抑制 PYY 的減食欲作用，下丘腦將不會(huì)被激活。而由十二指腸注入食物時(shí)，在營(yíng)養(yǎng)素抵達(dá)PYY生成的主要部位—腸道遠(yuǎn)端之前，血漿PYY水平就已升高，提示PYY的釋放可通過(guò)神經(jīng)反射—迷走神經(jīng)反射引起〔8〕。PYY參與營(yíng)養(yǎng)、攝食、能量平衡的調(diào)節(jié)〔9〕，是一個(gè)調(diào)節(jié)攝食的飽感信號(hào)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA檢測(cè)血清中PYY的含量，結(jié)果顯示，與WKY組比較，模型組大鼠血清中PYY含量表達(dá)升高，SHR大鼠血清中PYY表達(dá)含量升高，這可能與血壓升高相關(guān)。

貝那普利和氨氯地平均具有良好的降壓作用，而且在降壓的同時(shí)能有成效逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)〔11，12〕。但關(guān)于二者對(duì)“胃腸激素-酪酪肽”表達(dá)的影響，目前尚未見相關(guān)研究文獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，氨氯地平可使SHR結(jié)腸中PYY mRNA的表達(dá)降低，進(jìn)而達(dá)到降壓的目的。從而推測(cè)，SHR大鼠結(jié)腸組織中PYY調(diào)節(jié)失衡，氨氯地平的降壓作用很有可能是通過(guò)調(diào)節(jié)“胃腸激素-酪酪肽”的的表達(dá)，最終降低血壓。

高血壓的發(fā)生是多因素影響的結(jié)果，而遺傳易感性和環(huán)境因素可能通過(guò)胃腸激素影響血壓調(diào)控。“胃腸激素-酪酪肽”的研究從一個(gè)全新的角度對(duì)高血壓的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探索，而胃腸激素可能是影響血壓調(diào)控的重要因素之一。研究胃腸激素與高血壓的相關(guān)性，可能是對(duì)高血壓發(fā)病機(jī)制中的神經(jīng)、體液調(diào)節(jié)的一項(xiàng)重要補(bǔ)充，但氨氯地平和貝那普利通過(guò)調(diào)節(jié)胃腸激素降低血壓的具體作用機(jī)制及途徑還有待更深入地研究。

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〔2016-12-11修回〕

(編輯 李相軍)

R544

A

1005-9202(2017)19-4717-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.012

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160477)；甘肅省自然科學(xué)研究基金計(jì)劃( 1107RJZA220)；甘肅省高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(2010-5)

金 華(1970-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士，主要從事心腦血管疾病及其危險(xiǎn)因素的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。