譚莉明 向明均 米長忠 李中正 田紫華 向 波 周衛(wèi)華

(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

重樓總皂甙對小鼠哮喘模型氣道炎癥的影響及機(jī)制

譚莉明 向明均 米長忠 李中正 田紫華 向 波1周衛(wèi)華

(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

目的探討重樓總皂甙對小鼠哮喘模型的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法將24只BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對照組，模型組，重樓總皂甙低劑量組(LRTPS)和重樓總皂甙高劑量組(HRTPS)，每組6只。除空白對照組小鼠外，其余各組采用卵蛋白致敏建立支氣管哮喘小鼠模型，治療組在造模的同時灌胃給予不同劑量的重樓總皂甙治療。通過肺組織病理切片、酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)法檢測肺泡灌洗液中的白細(xì)胞介素(IL)-4和干擾素(IFN)-γ水平，Q-PCR 檢測肺組織IL-4和IFN-γ mRNA表達(dá)水平。結(jié)果空白對照組小鼠肺組織支氣管無炎性細(xì)胞浸潤，氣道無明顯黏液分泌，模型組支氣管和血管周圍炎性細(xì)胞浸潤明顯，黏膜及黏膜下層水腫明顯。治療組支氣管和血管周圍炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔和支氣管腔無滲出物。哮喘組小鼠的肺泡灌洗液IL-4水平和肺組織IL-4 mRNA表達(dá)顯著高于對照組；治療組顯著低于哮喘組(P<0.05)。哮喘組小鼠的肺泡灌洗液IFN-γ水平和肺組織IFN-γ mRNA表達(dá)顯著低于對照組，治療組顯著高于哮喘組(P<0.05)。結(jié)論重樓總皂甙能明顯減輕哮喘氣道炎性反應(yīng)，其機(jī)制可能與恢復(fù)局部Th1 / Th2細(xì)胞因子平衡有關(guān)。

哮喘；重樓總皂甙；白細(xì)胞介素(IL)-4；干擾素(IFN)-γ

中醫(yī)藥防治哮喘有一定的優(yōu)勢，尋求有效的防治哮喘的中醫(yī)藥是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。重樓是百合科植物重樓(paris polyphylla smith)的干燥根莖,主要產(chǎn)于云南、貴州、重慶和湖南武陵山區(qū)等地。重樓具有抗腫瘤、抑菌、抗病毒、止咳平喘和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用〔1～3〕。重樓皂甙是重樓的主要有效成分具有抗炎作用，但重樓皂甙是否具有抗炎平喘的作用未見報道。本文擬研究重樓總皂甙對小鼠哮喘模型的保護(hù)作用，為臨床治療支氣管哮喘提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物 重樓總皂甙購自成都曼思特生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動物 雌性BALB/c小鼠24 只，體重(20±2)g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，12 h光照周期。

1.3試劑 卵清蛋白(OVA)、氫氧化鋁粉，來自美國Sigma公司，TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Mix試劑盒均購自唯贊生物科技有限公司，白細(xì)胞介素(IL)-4和干擾素(IFN)-γ試劑盒來自武漢博士德生物有限公司；其他試劑為分析純，來自上海生工生物有限公司。

1.4動物分組及給藥 小鼠隨機(jī)分為空白對照組(NC組)，模型組(OVA組)，重樓總皂甙低劑量組(LRTPS)和重樓總皂甙高劑量組(HRTPS)。除NC組外，其他各組小鼠在第1、14天開始致敏，即腹腔注射致敏混合液200 μl /只(50 g OVA，10% Al(OH)3，pH6.5)。在致敏后的第21～27天給予霧化吸入5% OVA 5 ml。進(jìn)行腹腔注射和霧化吸入時，NC組以0.9% NaCl代替OVA。治療組于致敏后第14～27天分別給予相應(yīng)劑量的藥物灌胃，灌胃1 h后予霧化吸入。LRTPS組及HRTPS組分別給予重樓總皂甙2.5 mg/kg和10 mg/kg進(jìn)行灌胃，NC組和DVA組分別給予同等量的生理鹽水灌胃。

1.5ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)IL-4和IFN-γ 處死小鼠后，每只小鼠留取左肺組織進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，右肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗。支氣管肺泡灌洗：切開氣管，插管，用pH7.4的PBS灌洗3次，回收灌洗液即為BALF。離心后取上清，按小鼠細(xì)胞因子檢測試劑盒說明書操作，檢測IL-4和IFN-γ水平。

1.6實(shí)時熒光定量PCR(Q-PCR)檢測肺組織IL-4和IFN-γ mRNA表達(dá)水平 用TRIzol試劑提取肺組織RNA，采用Nandrop核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度，根據(jù)試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 2×SYBR Green Mix進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測肺組織中IL-4和IFN-γ的表達(dá)水平，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延長20 s，設(shè)置40個循環(huán)，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。Q-PCR引物序列，GAPDH前向：AATGGATTTGGACGCATTGGT，反向TTTGCACTGGTACGTGTTGAT；IL-4前向：CCCCAGCTAGTTGTCATCCTG，反向CAAGTGATTTTTGTCGCATCCG；IFN-γ前向：ATGAACGCTACACACTGCATC，反向CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC。引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

1.7肺組織病理切片 末次激發(fā)24 h后處死小鼠，支氣管肺泡灌洗和肺灌注后，用1 ml冰上冷卻過的PLP 固定劑(0.01 mmol/L sodium mperiodat, 0.075 mol/L lysine, 1% paraformaldehyde)注入肺內(nèi)，用手術(shù)縫合線系住氣管，取下完整的肺并放進(jìn)PLP固定液中4℃過夜。24 h后，用蒸餾水沖洗并保存于70%酒精中。石蠟包埋后，切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠肺組織病理變化 NC組小鼠肺組織支氣管無炎性細(xì)胞浸潤，氣道無明顯黏液分泌；OVA組支氣管和血管周圍炎性細(xì)胞浸潤明顯(主要為嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤)，黏膜及黏膜下層水腫明顯，氣道腔中可見較多的黏液和黏液栓。LRTPS組和HRTPS組小鼠肺組織支氣管和血管周圍炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔和支氣管腔無滲出物，與OVA組比較差異明顯。見圖1。

圖1 小鼠肺組織切片

2.2各組小鼠BALF中IL-4和IFN-γ表達(dá)水平 OVA組BALF中IL-4水平〔(84.6±9.76)mg/ml〕較NC組〔(18.9±2.84)ng/ml〕顯著升高，IFN-γ水平顯著降低〔(96.5±13.58)pg/ml vs (324.8±36.48)pg/ml〕(P<0.05)。經(jīng)重樓總皂甙治療后，BALF中IL-4的水平〔LRTPs組(42.5±5.62)mg/ml,HRTPS組(34.7±4.86)mg/ml〕與OVA組比較明顯下降，IFN-γ水平〔(156.8±19.76)pg/ml,(242.3±21.57)pg/ml〕明顯回升(P<0.05)。

2.3各組小鼠肺組織中IL-4和IFN-γ mRNA表達(dá)水平 OVA組肺組織IL-4 mRNA(4.8±0.76)表達(dá)較NC組(1)顯著升高，IFN-γ mRNA表達(dá)(0.34±0.08)顯著降低(P<0.05)。經(jīng)重樓總皂甙治療后，肺組織IL-4 mRNA的表達(dá)(LRTPS組：2.3±0.36，HRTPS組：1.9±0.23)與OVA組相比明顯下降，IFN-γ mRNA表達(dá)(LRTPS組：0.76±0.13，HRTPS組：0.84±0.15)明顯回升(P<0.05)。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，灌胃給予重樓總皂甙能顯著減輕肺組織炎癥，降低肺組織和肺泡中的IL-4水平，明顯升高肺組織和肺泡中的IFN-γ水平。IL-4是重要的Th2型關(guān)鍵細(xì)胞因子，在人類過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔4〕。IL-4促進(jìn)Th2型T細(xì)胞的分化和增殖，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG1和IgE〔5, 6〕；在過敏小鼠中，IL-4單克隆抗體能顯著降低IgE水平和氣道嗜酸性粒細(xì)胞增多〔7〕。這些Th2細(xì)胞因子，與Th1產(chǎn)生的IFN-γ相反，能促進(jìn)細(xì)胞增強(qiáng)IgG2a的產(chǎn)生，抑制抗原誘導(dǎo)的AHR、IgE產(chǎn)生和抗原誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞募集，從而抑制哮喘樣表型〔8〕。本研究清楚地證明了口服重樓總皂甙可劑量依賴性抑制Th2產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-4，并恢復(fù)降低的Th1細(xì)胞因子IFN-γ，恢復(fù)局部Th1/Th2細(xì)胞因子平衡，可以解釋重樓皂甙能減少氣道炎癥和細(xì)胞浸潤以及減少總IgE水平。因此，局部Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的恢復(fù)是開發(fā)過敏性哮喘新療法的合理策略。

1滕文靜,周 超,曹曉靖,等.重樓皂苷影響JAK/STAT3通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡〔J〕.時珍國醫(yī)國藥,2015；26(4):808-11.

2周滿紅,于 紅,賀華經(jīng),等.重樓總皂苷對熱滅活大腸桿菌誘導(dǎo)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNFα-及IL-1β的影響〔J〕.四川中醫(yī),2008；26(4): 24-6.

3周滿紅,杜文勝,龍勝雙,等.重樓總皂苷對脂多糖誘導(dǎo)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及IL-1β的影響〔J〕.四川中醫(yī),2008；26(3): 14-6.

4Cohn L,Elias JA,Chupp GL.Asthma:mechanisms of disease persistence and progression〔J〕.Annu Rev Immunol,2004;22:789-815.

5Blaeser F,Bryce PJ,Ho N,etal.Targeted inactivation of the IL-4 receptor alpha chain I4R motif promotes allergic airway inflammation〔J〕.J Exp Med,2003;198(8):1189-200.

6Corry DB.Emerging immune targets for the therapy of allergic asthma〔J〕.Nat Rev Drug Discov,2002;1(1):55-64.

7Renz H,Enssle K,Lauffer L,etal.Inhibition of allergen-induced IgE and IgG1 production by soluble IL-4 receptor〔J〕.Int Arch Allergy Immunol,1995;106(1):46-54.

8Iwamoto I, Nakajima H,Endo H,etal.Interferon gamma regulates antigen-induced eosinophil recruitment into the mouse airways by inhibiting the infiltration of CD4+T cells〔J〕.J Exp Med,1993;177(2):573-6.

〔2017-03-15修回〕

(編輯 李相軍)

R562.25

A

1005-9202(2017)19-4703-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.006

國家自然科學(xué)基金(No.81560038，81460766)；湖南省教育廳青年項(xiàng)目(No.13B090)；吉首大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性項(xiàng)目(JSU-CX-2013-28)；湖南省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(B2014-184)

1 湘西自治州人民醫(yī)院

周衛(wèi)華(1978-)，男，副教授，主要從事民族醫(yī)藥的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用研究。

譚莉明(1981-)，女，講師，主要從事民族醫(yī)藥的免疫調(diào)節(jié)藥理作用研究。