王文麗，吳致君，劉志薇，王永鑫，李輝，崔新，莊靜

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茶樹類黃酮3′-羥化酶基因的克隆與表達(dá)特性分析

王文麗，吳致君，劉志薇，王永鑫，李輝，崔新，莊靜*

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，茶葉科學(xué)研究所，江蘇南京210095

類黃酮3′-羥化酶（Flavonoid 3′-hydroxylase, F3′H）是細(xì)胞色素P450酶家族（Cytochrome P450，CYP450）的單加氧酶，在植物次生代謝和逆境調(diào)控方面起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)以茶樹品種龍井43作為試驗(yàn)材料，利用RT-PCR方法，從cDNA中克隆得到茶樹中編碼類黃酮3′-羥化酶基因，命名為′。序列分析顯示，′基因開放閱讀框?yàn)??530?bp，編碼509個氨基酸，含有相對保守的P450酶系結(jié)合域。進(jìn)化樹分析表明，CsF3′H1與CsF3′H3的進(jìn)化樹關(guān)系相近，與CsF3′H2的進(jìn)化樹關(guān)系較遠(yuǎn)。序列多重比對顯示，CsF3′H1蛋白具有F3′H蛋白的特征基序，并與高粱、獼猴桃、楊樹、擬南芥和葡萄同源蛋白一致性為66.48%。氨基酸組分、理化性質(zhì)、親水性/疏水性和無序化分析顯示，CsF3′H1是親水性蛋白，無序化特征不明顯。利用實(shí)時熒光定量PCR對′基因在茶樹不同組織和不同激素處理下的表達(dá)譜進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：不同組織中，′基因的表達(dá)水平在第一葉中最高，之后隨著葉片的成熟逐漸下降，′基因在老葉和根中幾乎不表達(dá)，表達(dá)水平從高到低依次為第一葉>第二葉>第三葉>第四葉>嫩莖>根>老葉；在不同激素處理中，′在SA激素處理下的表達(dá)量最高，為對照的2.24倍，在MeJA處理下表達(dá)量最低，為對照的0.43倍。

茶樹；類黃酮3′-羥化酶；進(jìn)化樹分析；組織表達(dá)；激素處理

類黃酮3′-羥化酶是細(xì)胞色素P450（Cytochrome 450）酶家族中的單加氧酶[1]。細(xì)胞色素單加氧酶P450（CYP450）在生物界中廣泛存在，是一大類定位在膜上的血紅素蛋白[2]。Brugliera等從矮牽牛（）中首次分離了′基因，被鑒定屬于CYP75B2基因家族[3]。F3′H蛋白具有催化多種依賴NADPH或NADH的底物氧化反應(yīng)的功能[3-5]。之后陸續(xù)在擬南芥（）、玉米（）、金魚草（）、矢車菊（）、紫莖澤蘭（）、大豆（）、葡萄（）和蘋果（）等眾多植物中分離和鑒定了′基因[6-11]。

茶具有抗癌、抗心血管疾病、抗輻射、抗氧化和減肥等功能。茶的這些功能與茶葉中富含多酚類次生代謝產(chǎn)物密切相關(guān)[6, 12-14]。類黃酮代謝途徑是茶樹中重要的次級代謝途徑。類黃酮代謝途徑中的中間產(chǎn)物能保護(hù)植物免受UV照射和昆蟲的傷害，能通過調(diào)控花朵和種子的色素沉積，來吸引授粉者和種子傳播者[15-16]。類黃酮3′-羥化酶（Flavonoid 3′-hydroxylase, F3′H）催化柚皮素（Naringenin）和二氫山奈素（2,3-dihydrokaempf, DHK）的B-環(huán)3′位置羥基化，分別生成圣草酚（Eriodictyol）和二氫槲皮素（2,3-dihydroquercetin, DHQ），是類黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶[17]。

本實(shí)驗(yàn)從茶樹品種龍井43的cDNA中克隆得到1個′基因，命名為′。對該基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了序列比對、理化性質(zhì)和親/疏水性等方面的分析。本實(shí)驗(yàn)通過熒光定量PCR方法檢測了′基因在龍井43茶樹不同組織中和激素處理下的表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究茶樹中類黃酮代謝途徑及不同激素處理下′響應(yīng)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實(shí)驗(yàn)材料選用種植在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所的兩年生龍井43（cv.）扦插盆栽幼苗。取龍井43扦插幼苗的幼嫩葉，提取RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為′基因克隆的模板。

選取龍井43茶樹兩年生植株，對其葉片進(jìn)行脫落酸（0.1?mmol·L-1ABA）、生長素（1?mmol·L-1IAA）、水楊酸（1?mmol·L-1SA）、赤霉素（1?mmol·L-1GA3）和茉莉酸甲酯（1?mmol·L-1MeJA）激素處理2?h。未做任何處理的茶樹葉片作為對照。另外選取多株龍井43兩年生植株的第一葉混樣、第二葉混樣、第三葉混樣、第四葉混樣、老葉混樣、嫩莖混樣和根混樣作為不同組織基因表達(dá)材料。對上述取得的樣品進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于實(shí)時熒光定量。

1.2 總RNA的提取及cDNA合成

使用Biotake Corporation（南京華普生物科技有限公司）試劑盒提取根組織的總RNA，使用Quick RNA Isolation Kit（北京華越洋公司）試劑盒提取葉和嫩莖組織的總RNA。用Nanodrop ND 1000（上海譜元儀器有限公司）檢測提取的RNA樣品濃度。用1.2%凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（大連TaKaRa公司）試劑盒將提取的總RNA樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 茶樹CsF3′H1基因克隆

基于本實(shí)驗(yàn)室課題組茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18]，得到1個茶樹′轉(zhuǎn)錄本序列，并根據(jù)此序列設(shè)計1對克隆引物：

CsF3′H1-QF：ATGGAGACTCATTCCTGGATTGT；

CsF3′H1-QR：CTAATAAAGGCGACCTGAGAGC

擴(kuò)增體系：2×Plus Master Mix酶10?μL、ddH2O 7?μL、模板1?μL和引物各1?μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5?min；94℃ 30?s，55℃ 30?s，72℃ 90?s，共32個循環(huán)；72℃ 10?min。之后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的分離和回收。以pMD 19-T作為載體進(jìn)行連接，成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌上后送測。委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

核苷酸和蛋白質(zhì)的BLAST比對和保守域預(yù)測在NCBI（美國國立生物技術(shù)中心）網(wǎng)站完成。氨基酸序列的多重比對和親疏水性分析利用DNAMAN 6.0軟件完成。利用在線工具包(SMS) (http://www.bio-soft.net/sms）和ExPASy- ProtParam (http://web.expasy.org/protparam）分析氨基酸的組成及理化性質(zhì)。利用MEGA 5.0[19]軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。熒光定量PCR數(shù)據(jù)的分析和圖表繪制在Origin 6.0軟件上進(jìn)行。

1.5 茶樹CsF3′H1基因的表達(dá)特性分析

實(shí)時熒光定量PCR（Quantitative real time RT-PCR）的步驟按照SYBR Premix試劑盒（大連TaKaRa公司）的操作說明進(jìn)行。CFX96real-time PCR system作為熒光定量PCR平臺，設(shè)計1對檢測引物：

CsF3′H1-JF：CTATTGCAGCTTCTTGATGATCCGA

CsF3′H1-JR：GCTCTTTGGTTGCTTTGTTGATTAG

以茶樹基因作為組織表達(dá)和激素處理的內(nèi)參基因[20]：

TBP-JF：GGCGGATCAAGTGTTGGAAGGGAG

TBP-JR：ACGCTTGGGATTGTATTCGGCATTA

相對定量計算采用2–ΔΔT方法[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsF3′H1基因的克隆

提取正常生長的龍井43扦插幼苗嫩葉的RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物CsF3′H1-QF和CsF3′H1-QR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增片段進(jìn)行測序。結(jié)果如下：′基因開放閱讀框長度為1?530?bp，編碼509個氨基酸（圖1）。

2.2 茶樹CsF3′H1蛋白進(jìn)化樹分析

為了分析CsF3′H1蛋白在P450超基因家族蛋白的進(jìn)化樹關(guān)系。利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建CsF3′H1蛋白與擬南芥P450超基因家族的進(jìn)化樹。結(jié)果顯示（圖2），CsF3′H1和CsF3′H3蛋白的進(jìn)化樹關(guān)系較接近，與CsF3′H2蛋白的進(jìn)化樹關(guān)系較疏遠(yuǎn)。

2.3 茶樹CsF3′H1蛋白氨基酸序列比對

利用NCBI對CsF3′H1氨基酸序列進(jìn)行BLAST同源檢索與比對（圖3）。結(jié)果顯示，CsF3′H1蛋白含有P450家族典型的保守域，是P450超基因家族中的一員[22]。選取高粱、獼猴桃、擬南芥、葡萄和楊樹4個代表性物種中的F3′H1同源蛋白與茶樹的CsF3′H1蛋白進(jìn)行序列的多重比對（圖4）。結(jié)果顯示，6個蛋白氨基酸序列的一致性為66.48%。在蛋白序列的N端含有膜的錨定位點(diǎn)基序，在C端含有與血紅素結(jié)合區(qū)有關(guān)的氨基酸基序。

圖1 茶樹CsF3′H1基因核苷酸序列與推測的氨基酸序列

圖2 茶樹CsF3′H1蛋白的進(jìn)化樹分析

圖3 茶樹CsF3′H1蛋白的保守域預(yù)測

注：a：膜的錨定位點(diǎn)；b：與底物的選擇和結(jié)合有關(guān)的氨基酸殘基；c：與血紅素結(jié)合區(qū)有關(guān)的氨基酸殘基。

Note: a: The residues proposed to anchor. b: Residues of the active site hydrogen bond network. c: Residues of the heme-binding region.

圖4 茶樹′基因推導(dǎo)蛋白保守域及與其他物種氨基酸序列的多重比對

Fig. 4 The conserved domain and multiple alignment of CsF3′H1 protein

2.4 茶樹CsF3′H1蛋白氨基酸的理化性質(zhì)分析

F3′H1蛋白組成成分和理化性質(zhì)的分析采用Gasteiger等[23]的方法（表1），結(jié)果顯示上述植物的F3′H1蛋白氨基酸殘基數(shù)在507~518之間，相對分子量為（5.59~5.83）×104。理論等電點(diǎn)（）均在7~10之間。堿性氨基酸的平均含量為14%，酸性氨基酸的平均含量為10%左右，芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸平均含量分別為7%和25%，總平均疏水性在蛋白質(zhì)可溶性預(yù)測中處于－0.333~0.048之間?？傊?，不同的物種中F3′H1蛋白的理化性質(zhì)存在一定差異，親緣關(guān)系相近的物種差異相對較小。

表1 不同植物中F3′H1氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析

2.5 茶樹CsF3′H1蛋白推導(dǎo)的氨基酸親/疏水性和無序化分析

利用DNAMAN 6.0軟件對茶樹′基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行親水性/疏水性分析。如圖5顯示，該蛋白疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是在第373位的纈氨酸（Val），其次是第9位的亮氨酸（Leu）；親水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是265位的谷氨酸（Glu），其次是第151的谷氨酸（Glu）?？偟目磥恚蠖鄶?shù)的氨基酸屬于親水性氨基酸。CsF3′H1蛋白氨基酸序列的折疊無序化分析結(jié)果（圖6）顯示，CsF3′H1無序化區(qū)域在整個氨基酸序列中占5個，最長的無序化區(qū)域含有氨基酸數(shù)為9個。無序化區(qū)域共含有37個氨基酸殘基（圖6中下劃線部分），無序化比例為7.27%?？傮w而言，CsF3′H1蛋白氨基酸序列無序化程度不明顯。

注：有下劃線標(biāo)注的是無序狀態(tài)氨基酸，無下劃線標(biāo)注的是有序狀態(tài)氨基酸。

Note: Amino acids represented non-ordered and ordered regions are showed in underline and non-underline, respectively.

圖6 茶樹CsF3′H1折疊狀態(tài)的分析

Fig. 6 Analysis of the folding state of CsF3′H1

2.6 茶樹CsF3′H1基因在不同組織中的表達(dá)分析

通過熒光定量PCR，檢測了龍井43茶樹中′基因在不同組織中的表達(dá)情況（圖7）。結(jié)果顯示，′基因在不同組織中表達(dá)差異很大，在第一葉中的表達(dá)量最高，隨著葉片的發(fā)育，在第二、三、四葉中表達(dá)量逐漸下降，在根和老葉中的表達(dá)量幾乎檢測不到；′基因在第一葉中的表達(dá)量分別是根和老葉中的250倍和500倍；在不同組織中′基因的表達(dá)水平從高到低依次為：第一葉>第二葉>第三葉>第四葉>嫩莖>根>老葉。

2.7 茶樹CsF3′H1基因在不同激素處理下的表達(dá)分析

用水楊酸、赤霉素、茉莉酸甲酯、脫落酸、吲哚乙酸5種激素分別處理茶樹葉片2?h，結(jié)果（圖8）顯示，在水楊酸處理下′基因的表達(dá)量最高，為對照的2.24倍；′基因在茉莉酸甲酯處理下表達(dá)量最低，僅為對照的43%；與對照相比，′基因只有在水楊酸處理下表達(dá)量顯著上調(diào)，在茉莉酸甲酯處理下表達(dá)量顯著下調(diào)。

注：不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

圖8 CsF3′H1基因在茶樹不同激素處理下的表達(dá)分析

3 討論

類黃酮代謝途徑是高等植物中重要的次級代謝途徑之一。在植物中，′在決定植物花色、種皮和莖葉著色等性狀方面發(fā)揮著重要的作用，′與′′的比例決定著葡萄果實(shí)著色的程度[17]。在茶樹中，類黃酮途徑中的代謝產(chǎn)物兒茶素能幫助人體提高抗癌、抗氧化、抗誘變、抗腫瘤和抗心血管疾病的能力[12-14]。類黃酮3′-羥化酶是類黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶，能催化柚皮素和二氫山奈素的B環(huán)3′位置羥基化。柚皮素和二氫山奈素被氧化形成一系列類黃酮途徑中重要的中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗氧化功能與F3′H酶類密切相關(guān)[24]。Zhou等[25]的酶活實(shí)驗(yàn)中，鑒定了柚皮素是CsF3′H的最適底物[25]。

P450家族是植物中古老的超基因家族，按功能分類，主要分為參與生物合成和生物解毒兩大類[26]。經(jīng)鑒定，CsF3′H蛋白的F439GSGRRMCPG448血紅蛋白結(jié)合區(qū)是P450超基因家族的典型特性基序，N端存在的P34PGP37保守位點(diǎn)是膜的錨定位點(diǎn)，G308TDTSA313基序一般是與底物選擇相結(jié)合的殘基位點(diǎn)[27-28]。進(jìn)化樹分析顯示，CsF3′H1蛋白和CsF3′H3蛋白的進(jìn)化樹關(guān)系較接近，與CsF3′H2蛋白的進(jìn)化樹關(guān)系較遠(yuǎn)，CsF3′H2蛋白屬于CYP75B1亞家族。這與Zhou等[25, 29]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致。

本實(shí)驗(yàn)從茶樹中克隆獲得1個編碼F3′H酶的′基因，該基因開放閱讀框長度為1?530?bp，編碼509個氨基酸。大多數(shù)氨基酸屬于親水性氨基酸，無序化程度不明顯。通過定量表達(dá)分析該基因在不同組織和不同激素下表達(dá)量的變化，不同組織中，熒光定量PCR分析顯示′基因的表達(dá)水平在第一葉中表達(dá)量最高，從第一葉到老葉表達(dá)量依次遞減，在老葉和根中的表達(dá)水平幾乎檢測不到，在嫩莖中的表達(dá)水平遠(yuǎn)小于鮮葉。推測′基因存在組織特異性，在鮮葉中的表達(dá)較高。Jiang等[18, 30]的研究表明茶樹葉片中多酚類物質(zhì)主要集中在嫩葉部位，推測′基因在類黃酮代謝途徑中起正調(diào)控作用。

激素能通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動或阻遏下游相關(guān)基因來發(fā)揮其作用。外源激素的噴施能明顯地影響茶樹的生長發(fā)育和鮮葉內(nèi)含物質(zhì)的生成[31]。響應(yīng)不同激素刺激方面，′的表達(dá)水平除了在水楊酸處理下顯著升高外，在其余激素處理下的表達(dá)量均處于下調(diào)狀態(tài)。推測水楊酸能誘導(dǎo)′基因的表達(dá)，茉莉酸甲酯則抑制′基因的表達(dá)，赤霉素、脫落酸和吲哚乙酸對′的影響不大。

本實(shí)驗(yàn)研究了′基因在不同組織和激素刺激中的表達(dá)情況，推測′基因可能影響了兒茶素的合成。為進(jìn)一步研究茶樹中F3′H1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定一定的理論基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression Analysis of the Gene Encoding Flavonoid 3′-Hydroxylase in Tea Plant ()

WANG Wenli, WU Zhijun, LIU Zhiwei, WANG Yongxin, LI Hui, CUI Xin, ZHUANG Jing*

Tea Science Research Institute, College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjin 210095, China

Flavonoid 3′-hydroxylase (F3′H) belongs to the family of cytochrome P450 monooxygenases (CYP450) and plays important roles in plant secondary metabolism and stress reponses. In this study, a gene encoding F3’H-like protein was cloned by RT-PCR method using a cDNA template from tea () cultivar ‘Longjing43’. This gene is named as′. Sequence analysis showed that the open reading frame ofwas 1,530 bp length, encoding 509 amino acids. CsF3′H1 protein contains the conserved binding domain of P450 enzyme. Analysis of phylogenetic tree showed that CsF3'H1 protein has high similarity with CsF3'H3 protein and has low similarity with CsF3'H2 protein. Multiple alignments showed that CsF3'H1 protein has high similarity with the F3′H homologs from,,,, and(66.48% identity). CsF3'H1 protein contains the characterized motifs of F3'H-type protein. Analysis of amino acid composition, physical and chemical properties, hydrophilicity/hydrophobicity, and disordered residues of CsF3′H1protein showed that the disordered residues of CsF3′H1 protein are not obvious and most amino acids of CsF3′H1 protein are hydrophilic. The expression profiles of′gene in different tissues of tea plant or under hormonal treatments were detected using quantitativereal-time PCR analysis. Results showed that:gene has the highest expression level in the first leaf. The tissue expression profiles showed that the successive order ofgene expression levels was the first leaf > the second leaf > the third leaf > the fourth leaf > stem > roo > old leaf. The expression levelofgene was highest under SA treatment, which was 2.24 times high than the control.gene had the lowest expression level under MeJA treatment.

, flavonoid 3′-hydroxylase, phylogenetic tree, tissue expression, hormonal treatments

S571.1；Q52

A

1000-369X(2017)01-108-11

2016-08-22

2016-10-24

國家自然科學(xué)基金（31570691）

王文麗，女，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學(xué)研究，E-mail：493930696@qq.com。

zhuangjing@njau.edu.cn