師維，李煜惠，鎖顯，楊啟煒，楊亦文，邢華斌

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離子液體選擇性萃取分離磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿

師維，李煜惠，鎖顯，楊啟煒，楊亦文，邢華斌

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310029）

同系物分離是高純度藥物單體和化學(xué)品制備中的重要環(huán)節(jié)，磷脂酰絲氨酸是一類重要的藥物和功能添加劑，其制備過程中的關(guān)鍵技術(shù)是磷脂酰絲氨酸與其他磷脂同系物的分離，但同系物之間結(jié)構(gòu)相似、分離難度大。報(bào)道了以離子液體為介質(zhì)選擇性萃取分離磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿的方法，系統(tǒng)研究了離子液體結(jié)構(gòu)和濃度、萃取溫度對(duì)分離性能的影響。研究表明，離子液體的陰離子結(jié)構(gòu)顯著影響同系物的分離選擇性，且離子液體與極性稀釋劑之間存在協(xié)同萃取效應(yīng)，離子液體的摩爾濃度僅為5%時(shí)，1-乙基-3-甲基咪唑溴/甲醇-正己烷兩相體系中的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿的選擇性高達(dá)29.48。采用量子化計(jì)算初步研究了萃取機(jī)理，結(jié)果表明離子液體與磷脂之間形成了多重氫鍵和靜電相互作用，從而促進(jìn)了磷脂同系物之間的選擇性分離。

離子液體；分離；萃??；磷脂酰絲氨酸；磷脂酰膽堿

引 言

動(dòng)植物組織內(nèi)存在一系列結(jié)構(gòu)相似的天然活性同系物，而不同結(jié)構(gòu)的同系物之間的生理活性常存在很大差異，某些單體具有獨(dú)特的生理活性，因此同系物間的分離十分必要。磷脂是一類具有多重生理功能的天然活性物質(zhì)，廣泛存在于生物體細(xì)胞組織中，主要由磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）等一系列磷脂同系物單體組成。這些磷脂同系物在生理功能和活性上存在一定差異，其中，PS因?qū)Υ竽X有特殊的生理活性而受到人們的廣泛關(guān)注，并被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品行業(yè)中[1]。有臨床研究表明，PS對(duì)修復(fù)腦細(xì)胞、改善記憶力、緩解精神壓力、防治老年癡呆以及治療抑郁癥等方面有顯著療效[2-5]，這使得高純度PS的市場(chǎng)需求越來越大?，F(xiàn)有制備PS的方法主要是提取分離法和酶轉(zhuǎn)化法，而通過上述兩種方法只能制備出低純度的PS，其產(chǎn)品中還會(huì)含有以PC為主的多種磷脂組分雜質(zhì)，這些磷脂同系物因結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，導(dǎo)致磷脂單體分離困難。因此，PS和其他磷脂同系物的選擇性分離，尤其是PS和PC的選擇性分離成為高純PS制備過程中的關(guān)鍵。

目前，PS和其他磷脂同系物的分離技術(shù)有柱色譜分離法、離心分離法、膜分離法以及超臨界流體萃取法等。柱色譜分離法在磷脂同系物分離中較為常見[6-7]，例如，Hanahan等[7]用中性氧化鋁作為吸附劑，以氯仿-甲醇（體積比為1:1）混合溶劑為洗脫劑，對(duì)低純度PS的混合磷脂進(jìn)行分離，可將PC和中性脂質(zhì)混合物洗脫出，之后再經(jīng)薄層色譜分離，最終可得到純度達(dá)90%以上PS產(chǎn)品。柱色譜分離法雖然可獲得較高的產(chǎn)品純度，但存在樣品處理量有限、溶劑消耗量大、能耗高等問題。離心分離法主要是依據(jù)各磷脂單體在不同溶劑中的溶解性差異，選擇合適的溶劑對(duì)磷脂同系物進(jìn)行離心分離。龔雁[8]將低純度PS的混合磷脂溶解于正己烷-異丙醇（體積比為1:1）混合溶劑中，充分振蕩后高速離心，離心后的沉淀固體即為PS產(chǎn)品，其純度達(dá)90%以上。離心法操作簡單，但其產(chǎn)品收率過低、處理量小，因而不適于高純PS的大規(guī)模生產(chǎn)。膜分離法對(duì)PS進(jìn)行分離純化的原理是根據(jù)PS與其他磷脂單體的分子大小及分子量差異，選擇合適的半透膜，使得各磷脂單體通過膜的難易程度不同，從而將PS從混合磷脂中分離出來[9]。膜分離法因膜再生困難、重復(fù)性能差等問題推廣受限。超臨界CO2萃取法雖在磷脂的分離中有應(yīng)用[10]，但是由于該法對(duì)各磷脂單體的選擇性較差，目前還不能用于高純PS的分離制備。綜上，亟需研發(fā)既經(jīng)濟(jì)又高效的PS與其他磷脂同系物的分離方法。

離子液體是一類完全由離子組成的化合物，具有蒸氣壓低、熱穩(wěn)定性高、溶解能力好和液程寬等優(yōu)良特性。此外，離子液體結(jié)構(gòu)和性質(zhì)具有可設(shè)計(jì)性，且內(nèi)聚能高易與其他溶劑形成液-液兩相體系，因而適合作萃取劑用于萃取分離過程[11-14]。近年來，以離子液體為介質(zhì)的液-液萃取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的分離過程中，并在天然活性物質(zhì)[15-16]、有機(jī)化合物[17-18]以及低碳烴[19]等分離純化領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。特別是在天然活性同系物的分離中，離子液體已被用于生育酚[15-16,20]、多不飽和脂肪酸酯[21]、甾醇和生物堿[22-23]等相似結(jié)構(gòu)的天然活性物質(zhì)的分離，但離子液體在PS分離制備中的應(yīng)用研究尚未見報(bào)道。因此，本工作研究了離子液體在PS和PC萃取分離過程中的應(yīng)用，考察了離子液體結(jié)構(gòu)、離子液體濃度以及萃取溫度對(duì)分離性能的影響。此外，本工作還通過量子化學(xué)計(jì)算對(duì)萃取機(jī)理進(jìn)行初步研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 1-乙基-3-甲基咪唑溴鹽（[EMIm]Br，99%）、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[EMIm]BF4，99%）、四乙基溴化銨（[N2222]Br，99%）、1-乙基-3-甲基咪唑三氟甲烷磺酸鹽（[EMIm]CF3SO3，99%）、1-乙基-3-甲基咪唑高氯酸鹽（[EMIm]ClO4，99%）、-乙基吡啶溴鹽（[EPy]Br，99%）、1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽（[BMIm]Br，99%）、1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽（[EMIm]Cl，99%）、1-己基-3-甲基咪唑溴鹽（[HMIm]Br，99%）、1-辛基-3-甲基咪唑溴鹽（[OMIm]Br，99%），購自中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所綠色化學(xué)與催化中心；溴化膽堿（[Ch]Br，98%），購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；正己烷（分析純）、甲醇（分析純），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷脂酰絲氨酸（PS，97%），購自Sigma公司；磷脂酰膽堿（PC，98%），購自德國Lipoid公司；粉末磷脂原料購于陜西帕尼爾生物科技有限公司。以上各離子液體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 高效液相色譜儀（包括1525二元高壓梯度泵，717 plus自動(dòng)進(jìn)樣器，2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器），Waters公司；恒溫振蕩器（ZQZY-70B），上海知楚儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 萃取實(shí)驗(yàn)

（1）預(yù)平衡實(shí)驗(yàn)。將離子液體與甲醇按一定比例混合配制成復(fù)合萃取劑，取適量與一定量的正己烷加入50 ml具塞錐形瓶中，然后置于ZQZY-70B恒溫振蕩器中，在一定溫度下以215 r·min?1的速度振蕩2 h，之后在相同溫度下靜置至兩相完全分層；取出徹底分離后的上下兩相放于錐形瓶中待用。

（2）萃取實(shí)驗(yàn)。用平衡后的正己烷，將粉末磷脂原料溶解配制成3 mg·ml?1的原料液。取5 ml原料液與相同體積平衡后的復(fù)合萃取劑加入25 ml的具塞錐形瓶中，將此錐形瓶置于恒溫振蕩器中，在預(yù)平衡實(shí)驗(yàn)溫度下，以215 r·min?1的速度振蕩2 h，然后在相同溫度下靜置至兩相完全分層；以注射器分別對(duì)上相、原料液取樣，然后進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）分析。

1.2.2 色譜分析方法 色譜柱為硅膠柱（Waters Sunfire Prep Silica，5.0 μm，4.6 mm × 250 mm）；柱溫30℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器增益為100，氣壓為50 psi（pounds per square inch，1 psi=6.895 kPa），漂移管溫度為60℃；流動(dòng)相為氯仿、甲醇、水和氨水的混合溶劑（75/24/0.5/0.5，體積比），流速為1 ml·min?1；進(jìn)樣量為10 μl。

分配系數(shù)A，以及溶質(zhì)A對(duì)溶質(zhì)B的選擇性A/B的計(jì)算公式如下

(2)

式中，oA和eA分別表示溶質(zhì)A在原料液中的濃度和萃取平衡后上相中的濃度，mg·ml?1。

1.3 量子化學(xué)計(jì)算

通過Gaussian 09量子化學(xué)計(jì)算軟件，在HF/6-31G(d)水平下進(jìn)行優(yōu)化構(gòu)型計(jì)算。在對(duì)離子液體-磷脂復(fù)合物構(gòu)型進(jìn)行優(yōu)化之前，首先要對(duì)離子液體進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。由于離子液體是由陽離子和陰離子組成的化合物，所以對(duì)離子液體進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化時(shí)，要考慮陰、陽離子的空間相對(duì)位置。在設(shè)定離子液體的最初構(gòu)型時(shí)，將陰離子放于陽離子四周的多個(gè)區(qū)域，并通過Gaussian 09軟件對(duì)各初始構(gòu)型進(jìn)行優(yōu)化計(jì)算。之后，對(duì)優(yōu)化后的構(gòu)型進(jìn)行頻率計(jì)算，得出離子液體的穩(wěn)定構(gòu)型。比較各穩(wěn)定構(gòu)型的生成熱，其中，最低能量構(gòu)型即為離子液體的最優(yōu)構(gòu)型[24-25]。得到離子液體的最優(yōu)構(gòu)型后，將其放于磷脂周圍多個(gè)區(qū)域進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而得出離子液體-磷脂復(fù)合物的最低能量構(gòu)型。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 離子液體結(jié)構(gòu)對(duì)萃取分離效果的影響

磷脂分子在結(jié)構(gòu)上含有非極性和極性部分（圖2），非極性部分由兩條飽和和不飽和脂肪酸鏈（R1、R2）組成；極性部分由磷酸根和其他取代基團(tuán)構(gòu)成。磷脂同系物的結(jié)構(gòu)差異主要在于極性部分的取代基團(tuán)，當(dāng)取代基團(tuán)為絲氨酸時(shí)即為PS，當(dāng)取代基團(tuán)為膽堿時(shí)即為PC。雖然PS和PC結(jié)構(gòu)相似，但二者的理化性質(zhì)仍會(huì)受不同取代基團(tuán)的影響[26]，在極性和氫鍵酸堿性方面存在微小差異，因此有望利用離子液體較強(qiáng)的氫鍵堿性和氫鍵作用能力[27-28]，實(shí)現(xiàn)選擇性分離。

純離子液體由于在常溫下黏度高且極性大，不適合作為萃取劑用于脂溶性物質(zhì)的萃取分離。因此，在離子液體液-液萃取體系中，可選用合適的有機(jī)溶劑作為離子液體的稀釋劑，組成離子液體-有機(jī)溶劑復(fù)合萃取劑。根據(jù)PS和PC在有機(jī)溶劑中的溶解度差異，并結(jié)合有機(jī)溶劑對(duì)離子液體的溶解性，選取對(duì)磷脂有良好溶解性的正己烷為非極性相，離子液體-甲醇混合溶液為極性相，構(gòu)建了離子液體/甲醇-正己烷液-液兩相萃取體系。離子液體的結(jié)構(gòu)是影響萃取分離性能的關(guān)鍵因素，所以從離子液體的陰離子、陽離子側(cè)鏈長度及陽離子母核結(jié)構(gòu)3個(gè)方面，考察在離子液體/甲醇-正己烷體系中離子液體結(jié)構(gòu)改變對(duì)萃取性能的影響。

2.1.1 陰離子對(duì)萃取分離的影響 根據(jù)PC和PS的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可知，PC的取代基團(tuán)中含有帶正電的季銨結(jié)構(gòu)，而PS的取代基團(tuán)則為整體顯電中性的氨基酸結(jié)構(gòu)。由此，考慮到離子液體中帶負(fù)電的陰離子其電負(fù)性較大，因而具有供電子形成氫鍵的能力，而陰離子供電基團(tuán)可與磷脂中的帶電基團(tuán)發(fā)生不同強(qiáng)度的相互作用，這將有望作為高選擇性分離磷脂同系物的關(guān)鍵。而陰離子結(jié)構(gòu)的不同，會(huì)使離子液體的供電子能力存在差異，并呈現(xiàn)為氫鍵堿性強(qiáng)度的差別[27]。因此，固定[EMIm]+為陽離子，選取一系列陰離子具有不同氫鍵堿性的離子液體，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，考察陰離子結(jié)構(gòu)對(duì)萃取分離效果的影響，PC的分配系數(shù)及選擇性系數(shù)如圖3所示。

圖3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，離子液體的陰離子結(jié)構(gòu)對(duì)萃取效果有較大影響，隨陰離子氫鍵堿性的增強(qiáng)，PC的分配系數(shù)（PC）出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，PC對(duì)PS的選擇性（PC/PS）大體呈上升趨勢(shì)，綜合考慮PC和PC/PS后發(fā)現(xiàn)，Br?為陰離子的離子液體/甲醇復(fù)合萃取劑表現(xiàn)出優(yōu)良的萃取性能。據(jù)文獻(xiàn)[29-30]報(bào)道，本研究所選用的離子液體陰離子的氫鍵堿性強(qiáng)弱順序?yàn)镃l?> Br?> CF3SO3?> ClO4?> BF4?。在分配系數(shù)方面，當(dāng)陰離子由BF4?變?yōu)镃F3SO3?時(shí)，陰離子氫鍵堿性增加，PC由8.96提高到了12.77；當(dāng)陰離子氫鍵堿性進(jìn)一步增加，由CF3SO3?變?yōu)锽r?時(shí)，PC有所下降，減小為11.79；陰離子變更為氫鍵堿性更強(qiáng)的Cl?時(shí)，PC的減小更為明顯，僅有8.86。這表明選擇氫鍵堿性適中的離子液體，可使PC在萃取體系中獲得較高的分配系數(shù)。在選擇性方面，陰離子按照氫鍵堿性增強(qiáng)的順序變更，由氫鍵堿性較弱的BF4?變?yōu)闅滏I堿性較強(qiáng)的Br?時(shí)，PC/PS由8.37升高至29.48，最大值是最小值的3.5倍。然而再提高氫鍵堿性，將陰離子變更為Cl?，PC/PS顯出下降趨勢(shì)，降至20.60，但仍明顯優(yōu)于BF4?等氫鍵堿性較弱的陰離子的選擇性（8.86）。這表明選用陰離子氫鍵堿性較強(qiáng)的離子液體，有利于PS和PC的選擇性分離。

綜合離子液體陰離子結(jié)構(gòu)變化對(duì)PC和PC/PS的影響，可以發(fā)現(xiàn)以CF3SO3?、Br?為陰離子的離子液體/甲醇復(fù)合萃取劑均表現(xiàn)出優(yōu)良的萃取性能。在Br?為陰離子的離子液體/甲醇-正己烷體系中，PC為11.79，PC/PS為29.48；當(dāng)離子液體陰離子為CF3SO3?時(shí)，體系的PC和PC/PS分別為12.77和20.27，與[EMIm]Br體系相比，雖然PC的分配系數(shù)略有提高，但選擇性能卻明顯不如后者。由此可見，Br?為陰離子的離子液體/甲醇復(fù)合萃取劑體現(xiàn)出更佳的萃取性能。此外，在純甲醇為萃取劑的甲醇-正己烷兩相體系中，PC和PC/PS分別為7.48和17.08，這表明當(dāng)萃取體系中加入少量[EMIm]Br后，可使PC和PC/PS分別提高57.6%和72.6%，說明離子液體的加入有效提高了萃取性能。綜上所述，當(dāng)固定陽離子為[EMIm]+，改變離子液體的陰離子，考察陰離子結(jié)構(gòu)變化對(duì)PS和PC萃取分離效果影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，萃取效果受陰離子結(jié)構(gòu)影響較大，陰離子氫鍵堿性適中的離子液體萃取性能優(yōu)異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明陰離子為Br?的離子液體與甲醇混合形成的復(fù)合萃取劑，萃取分離效果最佳。

2.1.2 陽離子側(cè)鏈長度對(duì)萃取分離的影響 選用[EMIm]Br、[BMIm]Br、[HMIm]Br和[OMIm]Br 4種離子液體，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，考察離子液體陽離子側(cè)鏈長度對(duì)PS和PC萃取分離效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)如圖4所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，PC隨離子液體陽離子側(cè)鏈長度的增加而增大。例如，當(dāng)陽離子側(cè)鏈長度由C2（乙基）延長到C8（辛基）時(shí)，PC的分配系數(shù)由11.79提高至37.11，同時(shí)PS的分配系數(shù)也由0.40提高到了1.62。由于離子液體陽離子側(cè)鏈長度的改變，會(huì)對(duì)其親脂性產(chǎn)生影響，碳鏈越長，則離子液體的親脂性越強(qiáng)。而磷脂結(jié)構(gòu)中有兩條C18長鏈，具有很強(qiáng)的親脂性，因此離子液體烷基側(cè)鏈的延長使離子液體與磷脂分子間的親和力顯著提高，使得磷脂更容易進(jìn)入離子液體相，分配系數(shù)提高。與分配系數(shù)的改變相反，隨著離子液體側(cè)鏈長度的增加，PC對(duì)PS的選擇性呈下降趨勢(shì)。例如，隨陽離子側(cè)鏈長度由C2（乙基）延長到C8（辛基），PC/PS由29.48下降至22.72。這說明延長離子液體陽離子的側(cè)鏈長度，雖然可以增加離子液體與磷脂間的親和力，但卻降低了離子液體對(duì)磷脂同系物間的選擇性。

2.1.3 陽離子母核結(jié)構(gòu)對(duì)萃取分離的影響 在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，以Br?為陰離子固定不變，改變陽離子的母核結(jié)構(gòu)，考察陽離子的母核結(jié)構(gòu)對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)表明，陽離子的母核結(jié)構(gòu)對(duì)萃取效果的影響不大。例如，當(dāng)陰離子為Br?，陽離子分別為[Ch]+、[EPy]+、[N2222]+、[EMIm]+時(shí)，PC的分配系數(shù)在10.29～11.79之間，差異較小。當(dāng)陽離子為[Ch]+時(shí)，PC對(duì)PS的選擇性相對(duì)低一些（23.39），其他3種陽離子體系中PC對(duì)PS的選擇性均將近30。因此，陽離子母核結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)PS和PC的分配系數(shù)以及選擇性的沒有產(chǎn)生較大影響。

表1 離子液體陽離子母核結(jié)構(gòu)對(duì)PC分配系數(shù)及PC對(duì)PS選擇性的影響

Note: The initial concentration of phospholipids in the hexane phase was 3 mg·ml?1. The volume ratio of feed and extraction solvent was 1:1. The extraction temperature was 25℃. The mole fraction of IL in mixed extractant (IL+methanol) was 5%.

2.2 離子液體的濃度對(duì)萃取分離的影響

以[EMIm]Br與甲醇混合物為萃取劑，在相同的萃取實(shí)驗(yàn)條件下，改變萃取劑中[EMIm]Br的含量，考察離子液體的濃度變化對(duì)萃取分離效果的影響，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以清晰看出，離子液體濃度的變化對(duì)PC的分配系數(shù)和PC對(duì)PS的選擇性影響顯著。PC隨著離子液體濃度的增加，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)離子液體在復(fù)合萃取劑中的摩爾濃度為0.05時(shí)，PC達(dá)到最大值，為11.79。與PC的變化趨勢(shì)不同，PS隨著離子液體濃度的增加呈緩慢下降趨勢(shì)。由此可見，離子液體濃度過高時(shí)，PC的分配系數(shù)顯著下降，PS的分配系數(shù)緩慢下降，這是因?yàn)殡x子液體是強(qiáng)極性物質(zhì)，離子液體濃度高時(shí)極性較強(qiáng)，降低了油溶性的PC和PS在萃取體系極性相中的溶解度，導(dǎo)致分配系數(shù)下降，不利于PC的萃取。綜合PC和PS隨離子液體濃度增加的變化規(guī)律可知，在[EMIm]Br的摩爾濃度為5%時(shí)，PC/PS達(dá)到最大值29.48。像這樣被萃取物質(zhì)的分配系數(shù)隨著復(fù)合萃取劑中離子液體濃度的升高出現(xiàn)最大值的現(xiàn)象，在其他以離子液體/有機(jī)溶劑為復(fù)合萃取劑的萃取分離過程中也有體現(xiàn)[31-32]，該現(xiàn)象可認(rèn)為是復(fù)合萃取劑中離子液體與有機(jī)溶劑協(xié)同作用的結(jié)果。離子液體濃度對(duì)萃取分離效果影響的研究表明，在離子液體/甲醇組成的復(fù)合萃取劑中，少量離子液體的加入，使得復(fù)合萃取劑與PC間的相互作用增強(qiáng)，可顯著提高磷脂同系物的分離效率，這對(duì)工業(yè)化上提高萃取效率具有一定指導(dǎo)意義。

2.3 萃取溫度對(duì)萃取分離的影響

以[EMIm]Br/甲醇-正己烷兩相體系為例，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，考察萃取溫度對(duì)萃取分離效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。當(dāng)萃取溫度由25℃升高至45℃，PC的分配系數(shù)逐漸下降，由11.79下降至8.00；而PS的分配系數(shù)則基本不變，維持在0.45左右。這可能是因?yàn)樵谳^高溫度下，磷脂與復(fù)合萃取劑間較難形成穩(wěn)定的氫鍵（詳見2.4節(jié)），從而導(dǎo)致兩者之間的相互作用力減弱，磷脂分配系數(shù)下降。此外，溫度升高會(huì)增加離子液體/甲醇-正己烷兩相體系的互溶度，使萃取效果變差。因此，在有離子液體參與的磷脂萃取分離過程，適宜在常溫下進(jìn)行。

2.4 萃取機(jī)理探究

為了探究離子液體的萃取機(jī)理，以[EMIm]Br和磷脂的作用為例，通過Gaussian 09量子化學(xué)計(jì)算軟件，得出其在HF/6-31G(d)水平優(yōu)化后的最優(yōu)構(gòu)型。根據(jù)Zhang等[33]報(bào)道，磷脂與離子液體作用時(shí)，主要是磷酸基團(tuán)與離子液體發(fā)生作用。因此，分別對(duì)PC、PS簡化后的磷脂末端磷酸基團(tuán)與離子液體形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)型優(yōu)化，得到兩者的最低能量構(gòu)型，并計(jì)算該復(fù)合物的相互作用能。計(jì)算表明，PC與[EMIm]Br之間相互作用能為?129.45 kJ·mol?1，其作用強(qiáng)度顯著大于PS與[EMIm]Br之間相互作用能（?91.70 kJ·mol?1），說明離子液體可選擇性地萃取PC，實(shí)現(xiàn)PC與PS之間的分離。與常規(guī)天然活性物質(zhì)與離子液體的作用能相比（?40～?70 kJ·mol?1）[34]，PC、PS與[EMIm]Br的作用能相對(duì)較大。這可能是由于磷脂為兩性離子化合物，其分子結(jié)構(gòu)中含有帶正電荷和負(fù)電荷的基團(tuán)，這些帶電基團(tuán)與離子液體的陰、陽離子間會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電吸引作用（詳見下文分析），從而表現(xiàn)出較大的相互作用能。

進(jìn)一步分析了PC、PS和離子液體的相互作用位點(diǎn)和作用方式。如圖7所示，離子液體主要作用于PC與PS的兩性離子部分。離子液體的陰離子Br?位于咪唑環(huán)和磷脂中帶正電的N原子之間。由于離子液體陽離子的正電性分布于整個(gè)咪唑環(huán)上，所以，探究Br?到離子液體陽離子的距離時(shí)，選定Br?到咪唑環(huán)上離Br?最近的N原子和C原子的距離為考察目標(biāo)。結(jié)果顯示，在PC-[EMIm]Br體系中，Br?到PC季銨中N原子[圖7(a)：Br49-N19]的距離為0.396 nm，Br?到[EMIm]Br中N原子和C原子的距離分別為0.391 nm[圖7(a)：Br49-N36]和0.358 nm[圖7(a)：Br49-C33]；在PS-[EMIm]Br 體系中，Br?到PS氨基中N原子[圖7(a)：Br37-N38]的距離為0.348 nm，Br?到[EMIm]Br中N原子和C原子的距離分別為0.378 nm[圖7(a)：Br49-N21]和0.344 nm[圖7(a)：Br49-C18]。綜上，Br?到磷脂中的N原子的距離與Br?到咪唑環(huán)中N原子和C原子的距離非常接近，表明PC、PS與[EMIm]Br的陰離子之間均有較強(qiáng)的靜電作用。

此外，量子化計(jì)算結(jié)果顯示[EMIm]Br中咪唑環(huán)上的H原子以及烷基側(cè)鏈上的H原子與磷脂的P＝O之間有不同強(qiáng)度的氫鍵作用，且離子液體陰離子Br?與磷脂末端取代基團(tuán)之間同樣存在不同強(qiáng)度的相互作用力，這也為離子液體能夠選擇性分離PC提供了理論支持。如圖7(a)所示，[EMIm]Br中咪唑環(huán)上的H原子以及烷基側(cè)鏈上的H原子與PC的PO雙鍵形成了多重氫鍵。例如PC中的兩個(gè)PO雙鍵與[EMIm]Br中咪唑環(huán)上H34以及烷基側(cè)鏈上的H43、H46的距離分別為0.207 nm[圖7(a)：C32-H34···O23]、0.250 nm[圖7(a)：C42-H43···O23]和0.269 nm[圖7(a)：C45-H46···O22]（H和O的范德華半徑總和為0.272 nm）。其中，咪唑環(huán)上H34到PC中PO雙鍵的距離較?。–32-H34···O23的距離為0.207 nm），說明兩者存在較強(qiáng)的相互作用，這是因?yàn)樵赱EMIm]Br的咪唑環(huán)上，位于兩個(gè)N原子之間的C原子[圖7(a)：C32]，其電子云密度相對(duì)較低，導(dǎo)致H34顯現(xiàn)出較強(qiáng)的酸性[35-36]，吸引PC中的PO基團(tuán)。如圖7(b)所示，PS的PO雙鍵也能與[EMIm]Br中咪唑環(huán)上的H原子以及烷基側(cè)鏈上的H原子形成氫鍵，距離分別為0.196 nm[圖7(b)：C20-H24···O9]和0.252 nm[圖7(b)：C26-H27···O8]。雖然PC中PO雙鍵到咪唑環(huán)上H34的距離（0.207 nm）比PS中PO雙鍵到咪唑環(huán)上H24的距離（0.196 nm）長一些，但是咪唑環(huán)烷基側(cè)鏈上的H43到PC的PO雙鍵的距離（0.250 nm）卻短于咪唑環(huán)烷基側(cè)鏈上的H27到PS的PO雙鍵的距離（0.252 nm），而且[EMIm]Br與PC之間形成了三重氫鍵，與PS之間僅形成雙重氫鍵，這表明PC與[EMIm]Br之間的氫鍵作用更強(qiáng)。再從[EMIm]Br中陰離子Br?與PS、PC的末尾取代基團(tuán)之間的相互作用分析，如圖7(a)所示，PC末端季銨結(jié)構(gòu)中的多個(gè)H原子與[EMIm]Br中陰離子Br?有很強(qiáng)的作用，比如PC末端N取代烷基上的H2、H11、H7到[EMIm]Br中陰離子Br?的距離分別為0.271 nm[圖7(a)：C1-H2···Br49]、0.274 nm[圖7(a)：C8-H11···Br49]和0.275 nm[圖7(a)：C4-H7···Br49]。Br的原子半徑比O原子大，且電負(fù)性比O原子小，但上述H原子到Br原子的距離與H和O的范德華半徑總和（0.272 nm）相當(dāng)，這表明PC末端季銨結(jié)構(gòu)與[EMIm]Br中陰離子Br?之間存在非常強(qiáng)的相互作用；而PS末端氨基結(jié)構(gòu)中的僅有一個(gè)H原子與[EMIm]Br中陰離子Br?有較強(qiáng)作用，即PS末端氨基上的H39與[EMIm]Br中陰離子Br?之間的距離為0.246 nm[圖7(b)：N38-H39···Br37]。這進(jìn)一步說明，PC與[EMIm]Br之間的相互作用要強(qiáng)于PS。[EMIm]Br可選擇性地識(shí)別PC分子，實(shí)現(xiàn)PC和PS的分離。

3 結(jié) 論

報(bào)道了以離子液體為介質(zhì)選擇性萃取分離磷脂同系物PS和PC的方法。研究結(jié)果表明，離子液體可選擇性萃取分離PC和PS，其中離子液體的陰離子結(jié)構(gòu)顯著影響分離性能，具備適宜氫鍵堿性的Br?為陰離子的離子液體不僅具有較高的分配系數(shù)，同時(shí)表現(xiàn)出出色的PC和PS分離選擇性；延長陽離子結(jié)構(gòu)可顯著提高PC的分配系數(shù)。研究表明，離子液體與稀釋劑之間存在協(xié)同萃取的現(xiàn)象，當(dāng)離子液體[EMIm]Br在復(fù)合萃取劑中的摩爾濃度為5%時(shí)，[EMIm]Br/甲醇-正己烷兩相體系中的PC和PC/PS達(dá)到最大值，分別為11.79和29.48。量子化學(xué)計(jì)算結(jié)果表明，離子液體與磷脂之間形成了多重氫鍵和靜電相互作用，PC與[EMIm]Br之間的相互作用強(qiáng)于PS，從而促進(jìn)了PC與PS間的選擇性分離。本研究不僅為磷脂同系物的分離提供必要的理論依據(jù)，也為其他結(jié)構(gòu)相似天然產(chǎn)物的分離提供了參考。

References

[1] LEIROS I, MCSWEENEY S, HOUGH E. The reaction mechanism of phospholipase D fromsp. strain PMF snapshots along the reaction pathway reveal a pentacoordinate reaction intermediate and an unexpected final product[J]. Mol. Biol., 2004, 339(4): 805-820.

[2] JORISSE B L. Safety of soy-derived phosphatidyl-serine in elderly people[J]. Nutreurosci, 2002, 5(5): 337-343.

[3] HELLHAMMER J. Effects of soy lecithin phosphatidic acid phosphatidylserine complex (PAS) on the endocrine and psychological responses tomental stress[J]. Stress, 2004, 7(2): 119-126.

[4] DELWAIDE P J. Double-blind randomized controlled study of phosphatidylserine in senile demented patients[J]. Acta Neurologica Scandinavica, 1986, 73(2): 136-140.

[5] BRAMBILLA F, MAGGIONI M. Blood levels of cytokines in elderly patients with major depressive disorder[J]. Acta Psychiatrica Scandinavica, 1998, 97(4): 309-313.

[6] 司朝勇, 吳素芳, 許海丹, 等. 含水量對(duì)氧化鋁柱色譜法同時(shí)分離純化卵磷脂和腦磷脂的影響[J]. 化工學(xué)報(bào), 2005, 56(4): 689-693. SI C Y, WU S F, XU H D,. Effects of water content on simultaneous purification of PC and PE by alumina column chromatography[J]. Journal of Chemical Industry and Engineering (China), 2005, 56(4): 689-693.

[7] HANAHAN D J, CHACKOFF I L. Analysis of phospholipase D[J]. Biol. Chem., 1974: 169-199.

[8] 龔雁. 磷脂化合物的分離制備和測(cè)定方法研究[D]. 北京: 北京化工大學(xué), 2006. GONG Y. Studies on phospholipids preparation and analysis[D]. Beijing: Beijing University of Chemical Technology, 2006.

[9] 夏玉宇. 化學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2004: 507-510. XIA Y Y. Handbook of Chemistry Lab[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2004: 507-510.

[10] 曹棟, 裘愛泳, 王興國. 超臨界流體分離大豆磷脂酰膽堿[J]. 中國油脂, 2002, 27(3): 72-74. CAO D, QIU A Y, WANG X G. Separation of soybean phosphatidylcholine by supercritical carbon dioxide/ethanol[J]. China Oils and Fats, 2002, 27(3): 72-74.

[11] 金文彬, 邢華斌, 任其龍, 等. 離子液體在結(jié)構(gòu)相似物分離中的進(jìn)展[J]. 中國科學(xué): 化學(xué), 2016, 46: 1251-1263. JIN W B, XING H B, REN Q L,. Separation of structurally-related compounds with ionic liquids[J]. Sci. Sin. Chim., 2016, 46(12): 1251-1263.

[12] 曹領(lǐng)帝, 曾少娟, 張鎖江, 等. 離子液體吸收分離硫化氫進(jìn)展[J]. 化工學(xué)報(bào), 2015, 66(S1): 1-9. CAO L D, ZENG S J, ZHANG S J,. Progress on hydrogen sulfide removal using ionic liquids[J]. CIESC Journal, 2015, 66(S1): 1-9.

[13] ROUT A, WELLENS S, BINNEMANS K. Separation of rare earths and nickel by solvent extraction with two mutually immiscible ionic liquids[J]. RSC Adv, 2014, 4(11): 5753-5758.

[14] MEINDERSMA G W, HAAN A B. Coneeptual process design for aromatic/aliphatic separation with ionic 1iquids[J]. Chemical Engineering Research and Design, 2008, 86(7): 745-752.

[15] YANG Q W, XING H B, YANG Y W,. Selective separation of tocopherol homologues by liquid-liquid extraction using ionic liquids[J]. Ind. Eng. Chem. Res., 2009, 48(13): 6417-6422.

[16] JIN W B, YANG Q W, HUANG B B,. Enhanced solubilization and extraction of hydrophobic bioactive compounds using water/ionic liquid mixtures[J]. Green Chemistry, 2016, 18(12): 3549-3557.

[17] MATSUMOTO M, INOMOTO Y, KONDO K. Selective separation of aromatic hydrocarbons through supported liquid membranes based on ionic liquids[J]. Journal of Membrane Science, 2005, 246(1): 77-81.

[18] LARRIBA M, NAVARRO P, GARCIA J,. Liquid-liquid extraction of toluene from heptane using[EMIM][DCA], [BMIM][DCA], and [EMIM][TCM] ionic liquids[J]. Industrial and Engineering Chemistry Research, 2013, 52(7): 2714-2720.

[19] ZHAO X, YANG Q W, XU D,. Design and screening of ionic liquids for C2H2/C2H4separation by COSMO-RS and experiments[J]. AIChE Journal, 2015, 61(6): 2016-2027.

[20] LIU X X, YANG Q W, BAO Z B,. Nonaqueous lyotropic ionic liquid crystals: preparation, characterization, and application in extraction[J]. Chemistry—A European Journal, 2015, 21(25): 9150-9156.

[21] LI M, PHAM P J, PITTMAN C U,. SBA-15-supported ionic liquid compounds containing silver salts: novel mesoporous 7t-complexing sorbents for separating polyunsaturated fatty acid methyl esters[J]. Microporous and Mesoporous Materials, 2009, 117(1): 436-443.

[22] JIN W B, YANG Q W, ZHANG Z G,Self-assembly induced solubilization of drug-like molecules in nanostructured ionic liquids[J]. Chemical Communications, 2015, 51(67): 13170-13173.

[23] CAO Y F, XING H B, YANG Q W,. High performance separation of sparingly aqua-/lipo-soluble bioactive compounds with an ionic liquid-based biphasic system[J]. Green Chemistry, 2012, 14(9): 2617-2625.

[24] BINI R, BORTOLINI O, CHIAPPE C,. Development of cation/anion “interaction” scales for ionic liquids through ESI-MS measurements[J]. The Journal of Physical Chemistry B, 2007, 111(3): 598-604.

[25] SHIROTA H, CASTNER E W. Why are viscosities lower for ionic liquids with? CH2Si (CH3)3vs? CH2C (CH3)3substitutions on the imidazolium cations?[J]. The Journal of Physical Chemistry B, 2005, 109(46): 21576-21585.

[26] 賀杠. 磷脂酶D催化合成磷脂酰絲氨酸（PS）的色譜分離研究[D]. 西安: 西北大學(xué), 2011. HE G. The chromatographic separation study of phosphatidylserine enzymatic synthetised by phospholipase D[D]. Xi’an: Northwest University, 2011.

[27] XU D, YANG Q W, SU B G,. Enhancing the basicity of ionic liquids by tuning the cation-anion interaction strength andthe anion-tethered strategy[J]. The Journal of Physical Chemistry B, 2014, 118(4): 1071-1079.

[28] DONG K, ZHANG S J. Hydrogen bonds: a structural insight into ionic liquids[J]. Chemistry—A European Journal, 2012, 18(10): 2748-2761.

[29] CAMMARATA L, KAZARIAN S G, SALTER P A,. Molecular states of water in room temperature ionic liquids[J]. Physical Chemistry Chemical Physics, 2001, 3(23): 5192-5200.

[30] CLAUDIO A F M, SWIFT L, HALLETT J P,. Extended scale for the hydrogen-bond basicity of ionic liquids[J]. Physical Chemistry Chemical Physics, 2014, 16(14): 6593-6601.

[31] YANG Q W, XING H B, SU B G,. Improved separation efficiency using ionic liquid-cosolvent mixturesas the extractant in liquid-liquid extraction: a multipleadjustment andsynergistic effect[J]. Chemical Engineering Journal, 2012, 181: 334-342.

[32] NI X L, XING H B, YANG Q W,. Selective liquid-liquid extraction of natural phenolic compounds using amino acid ionic liquids: a case of-tocopherol and methyl linoleate separation[J]. Ind. Eng. Chem. Res., 2012, 51(18): 6480-6488.

[33] ZHANG J Z, YU K, YANG Q W,Selective separation of zwitterionic phospholipidhomologues with functional ionic liquids asextractants[J]. RSCAdv, 2015, 5(95): 77581-77588.

[34] YANG Q W, XING H B, SU B G,. The essential role of hydrogen-bonding interaction in the extractive separation of phenolic compounds by ionic liquid[J]. AIChE Journal, 2013, 59(5): 1657-1667.

[35] 孫奇, 管生洲, 王曉武, 等. 咪唑及其衍生物N-1H保護(hù)基的研究進(jìn)展[J/OL].[2010-03-10]. http: //jonline.nwu.edu.cn/wenzhang/ 210008.pdf. SUN Q, GUAN S Z, WANG X W,. General trends in N-1H protection of imidazole and its derivatives[J/OL].[2010-03-10]. http: //jonline. nwu. edu. cn/wenzhang/210008. pdf.

[36] SHIRLEY D A, ALLEY P W. The metalation of 1-methyl-, 1-benzyl- and 1-phenylimidazole with-butyllithium[J]. Journal of the American Chemical Society, 1957, 79(18): 4922-4927.

Selective separation of phosphatidylserine and phosphatidylcholine with ionic liquids as extractants

SHI Wei, LI Yuhui, SUO Xian, YANG Qiwei, YANG Yiwen, XING Huabin

(Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of the Ministry of Education,College of Chemical and Biological Engineering,Zhejiang University,Hangzhou 310029,Zhejiang,China)

Homologues separation is a key process in the production of high-purity drugs and chemicals. High-purity phosphatidylserine (PS) is widely used as drugs and functional additives; however PS often appears in a mixture withstructurally similar homologues and the selective separation of phospholipid homologues remains challenging. Here, a novel extraction method was developed to separate PS and phosphatidylcholine (PC) with ionic liquids (ILs) as extractants. The effects of structure and concentration of ILs and temperature on extraction performance were investigated. The results showed that the structure of the IL’s anion had a significant impact on the separation selectivity, and an obvious synergistic extraction effect between IL and polar diluent was observed. In 1-ethyl-3-methylimidazolium bromide([EMIm]Br)-methanol-hexane biphasic systems, the selectivity of PC to PS (PC/PS) reached up to 29.48, when the mole fraction of IL was only 5%. Additionally,calculations were used to explore the extraction mechanism, and the results indicated that the multiple hydrogen-bonding and electrostatic interactions were formed between phospholipids and ILs, which is probably beneficial for the selective separation of phospholipid homologues.

ionic liquids; separation; extraction; phosphatidylserine; phosphatidylcholine

10.11949/j.issn.0438-1157.20170319

TQ 041+.8

A

0438—1157（2017）09—3442—09

2017-03-29收到初稿，2017-05-28收到修改稿。

邢華斌。

師維（1991—），女，碩士研究生。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21476192）；國家萬人計(jì)劃-青年拔尖人才。

2017-03-29.

XING Huabin, xinghb@zju.edu.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China (21476192) and the National Program for Support of Top-notch Young Professionals (H. X.).