侯紹章,張 婷，李 媛，伍智慧

(寧夏醫(yī)科大學(xué)：1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理系；2.護(hù)理學(xué)院，銀川 750004)

甘草酸對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響*

侯紹章1,張 婷1，李 媛2，伍智慧1

(寧夏醫(yī)科大學(xué)：1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理系；2.護(hù)理學(xué)院，銀川 750004)

目的探討甘草酸(GA)對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響。方法將HBZY-1細(xì)胞分為：正常對照組(NG組)、高糖組(HG組)、高糖+GA組(HG+GA組)。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖活性。用紫外分光光度法檢測超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平，用激光共聚焦檢測活性氧(ROS)變化。采用免疫組織化學(xué)和Western blot檢測錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)蛋白的表達(dá)，用Q-PCR檢測Mn-SOD mRNA。結(jié)果(1)各組HBZY-1細(xì)胞形態(tài)變化：HBZY-1細(xì)胞為菱形，NG組細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰可辨；HG+GA組細(xì)胞數(shù)量略增多，個(gè)別細(xì)胞胞體略肥大；HG組細(xì)胞結(jié)構(gòu)不甚清晰，細(xì)胞扁平，數(shù)量明顯增多，胞體略肥大。(2)各組HBZY-1細(xì)胞的增殖效應(yīng)：與NG組相比，HG組OD值明顯升高(P<0.05)，HG+GA組與HG組相比OD值降低(P<0.05)。(3)RDS含量：HG組RDS相對含量較NG組有所上升，HG+GA組ROS相對含量下降(P<0.05)。(4)各組細(xì)胞中Mn-SOD的表達(dá)：與NG組相比，HG組Mn-SOD相對表達(dá)減少(P<0.05)，HG+GA組與HG組相比Mn-SOD表達(dá)升高(P<0.05)。結(jié)論GA對高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞異常增殖有一定的抑制作用，GA可通過氧化應(yīng)激保護(hù)高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞所致的細(xì)胞肥大和細(xì)胞損傷，GA能調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)下Mn-SOD的表達(dá)。

甘草酸；腎小球系膜細(xì)胞；氧化應(yīng)激

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是最常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，同時(shí)是導(dǎo)致終末期腎衰竭和影響糖尿病患者生活質(zhì)量的重要原因之一[1]。DN的發(fā)病機(jī)制至今還未完全闡明，有大量研究證實(shí)，在DN的發(fā)病過程中，血流動力學(xué)改變、糖代謝紊亂、脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、血管活性物質(zhì)及細(xì)胞因子激活等起了重要作用[2-3]。由于糖、脂代謝紊亂，DN會導(dǎo)致線粒體功能紊亂和體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的升高[4]。研究證實(shí)，高糖誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體呼吸鏈產(chǎn)生過量活性氧(reactive oxygen species，ROS)是DN并發(fā)癥發(fā)生的啟動因素[5]，而氧化應(yīng)激表現(xiàn)為ROS、丙二醛(MDA)增多和抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)活性下降。另外，過多的 ROS會誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子表達(dá),使腎小球?yàn)V過增加,基底膜增厚,參與DN的發(fā)病過程,因此抑制腎臟的氧化應(yīng)激可有效防治DN[6]。

近年來，從中草藥中尋找治療DN可能的方法和藥物成為防治DN的研究熱點(diǎn)。甘草的主要成分甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)具有明顯的抗炎、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理作用[7]。已有研究表明，GA能明顯改善鏈脲佐菌素(STZ)導(dǎo)致的糖尿病，降低高血糖、高脂血癥及相關(guān)的氧化應(yīng)激，有望成為治療糖尿病的藥物。另外GA還能明顯緩解糖尿病導(dǎo)致的胰臟和腎臟異常，并且降低氧化應(yīng)激參數(shù)，激活糖異生酶的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)探討GA對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響，為DN的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 CO2培養(yǎng)箱(NUAIR-NU-5510E，美國)，超凈工作臺(BCM-1300A，蘇凈安泰)；GA(日本東京化成工業(yè)公司)，大鼠腎小球系膜細(xì)胞株 HBZY-1(北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)，TTC試劑盒 (南京凱基)，細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(Hyclone公司)。

1.2方法

1.2.1HBZY-1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 當(dāng)HBZY-1細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時(shí)，用胰酶消化傳代，置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育24、48 h。接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，繼續(xù)培養(yǎng)48 h使細(xì)胞生長融合。將細(xì)胞分為:正常對照組(NG組)、高糖組(HG組)和高糖+GA組(HG+GA組)。

1.2.2采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測 取對數(shù)生長期的HBZY-1細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組分別處理24 h，每孔加入50 μL 1×MTT(5 g/L)孵育4 h，鏡下觀察，MTT 摻入細(xì)胞內(nèi)，吸出上清液，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)使細(xì)胞內(nèi)甲臜溶解，用平板搖床搖勻振蕩10 min，待細(xì)胞完全溶解后，放入自動酶標(biāo)儀490 nm波長讀數(shù)，并記錄光密度(OD)值。

1.2.3HBZY-1細(xì)胞中ROS的表達(dá) 按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)。按照原位裝載探針的方法，取出干預(yù)24 h的培養(yǎng)板，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入300 μL稀釋好的DCFH-DA，陽性對照孔加入Rosup作為陽性對照。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，利用激光共聚焦顯微鏡觀察(488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長)。

1.2.4各組細(xì)胞上清液SOD和MDA測定 取對數(shù)生長期的HBZY-1細(xì)胞，24 h貼壁換液后，按實(shí)驗(yàn)分組處理24 h，收集各組上清液，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5免疫熒光檢測GA對錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期的HBZY-1細(xì)胞，24 h貼壁換液后，按實(shí)驗(yàn)分組處理24 h進(jìn)行免疫熒光檢測。(1)多聚甲醛室溫固定30 min；(2)0.2% TritonX-100室溫處理20 min；(3)3%H2O2孵育30 min；(4)封閉血清37 ℃ 20 min；(5)Mn-SOD一抗孵育(Mn-SOD滴度為1∶300)4 ℃過夜，陰性對照用PBS；(6)熒光二抗工作液37 ℃孵育30 min；(7)DAPI 復(fù)染核。

1.2.6Western blot分析 提取蛋白后電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗孵育，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑顯像，曝光。膜洗脫后再次孵育，β-actin作為內(nèi)對照。用計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)分析陽性強(qiáng)度。

1.2.7Q-PCR 使用Trizol試劑提取RNA，根據(jù)試劑說明書，使用寡聚(dT)18引物(0.5 μg/μL)以總體積為20 μL的RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄。 使用cDNA和SYBR Green PCR Master Mix在熒光PCR儀(IQ-5)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。引物為：Mn-SOD正向5′-AAG GAG CAA GGT CGC TTA CAG A-3′；Mn-SOD反向5′-CAA ATG GCT TTC AGA TAG TCA GGT C-3′；mRNA的相對量由2-△△Ct值計(jì)算確定。

2 結(jié) 果

2.1GA對高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞增殖的影響 本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)GA 為100 μmol/L 時(shí)對正常細(xì)胞無明顯影響，但對高糖組細(xì)胞有抑制作用，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度。GA作用于高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞24、48 h，MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖情況。與NG組相比，HG組細(xì)胞增殖明顯增加(P<0.05)，與HG組相比，HG+GA組細(xì)胞增殖受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A：各組細(xì)胞HE染色(×400)；B：MTT分析圖，*：P<0.05，與NG組比較;#：P<0.05，與HG組比較

圖1 GA對高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞增殖的影響

2.2GA對高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞ROS的影響 與NG組相比，HG組中高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞ROS產(chǎn)生增加，處理24 h后達(dá)峰值。GA處理后，ROS降低。 這些數(shù)據(jù)表明，在給予GA后，似乎有ROS產(chǎn)生的損傷或內(nèi)源性ROS清除/抗氧化能力的增加。GA可抑制HBZY-1在高糖刺激下ROS的產(chǎn)生，見圖2。

A:處理24 h各組細(xì)胞ROS水平(×400);B:激光共聚焦檢測各組細(xì)胞ROS水平；*：P<0.05，與NG組比較;#：P<0.05，與HG組比較

圖2 GA對高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞ROS的影響

2.3GA對高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞MDA水平和SOD活性的影響 HBZY-1細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下的MDA水平升高，處理24 h達(dá)峰值，而SOD活性下降，見圖3。

A：MDA水平；B：SOD活性，**：P<0.05，與NG組比較;#：P<0.05與HG組比較

圖3 GA對高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞MDA水平和SOD活性的影響

2.4GA對高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞中Mn-SOD蛋白表達(dá)的影響 與NG組相比， HG組Mn-SOD的表達(dá)水平降低。相比之下，GA治療24 h內(nèi)引起HBZY-1細(xì)胞的Mn-SOD蛋白表達(dá)增加。在各組中，Mn-SOD mRNA水平上變化與蛋白水平相似，見圖4。

A：免疫熒光法檢測各組中Mn-SOD蛋白表達(dá)(×400)；B：免疫組織化學(xué)檢測Mn-SOD的表達(dá)率；*：P<0.05，與NG組比較;#：P<0.05，與HG組比較。C：Western blot檢測各組中Mn-SOD蛋白表達(dá)；D：Mn-SOD蛋白率。E：Mn-SOD mRNA表達(dá)，*：P<0.05，與NG組比較;#：P<0.05，與HG組比較

圖4 HBZY-1細(xì)胞中Mn-SOD mRNA水平

3 討 論

DN作為糖尿病最常見的并發(fā)癥，近年來已成為糖尿病致死、致殘的主要原因，因此許多國內(nèi)外腎臟病學(xué)者把關(guān)注方向定于DN致病因素及機(jī)制研究。DN發(fā)病過程包括氧化應(yīng)激、血管活性物質(zhì)及細(xì)胞因子、糖代謝紊亂及由此導(dǎo)致的非酶糖化、多元醇通路激活、蛋白激酶C信號途徑活化、血管活性物質(zhì)及細(xì)胞因子等引起[2]。目前研究表明，氧化應(yīng)激在DN的發(fā)病過程中起重要作用。氧化應(yīng)激最主要的表現(xiàn)為ROS產(chǎn)生增多，從而引起機(jī)體一系列的損傷。糖尿病狀態(tài)下腎臟氧化應(yīng)激的發(fā)生與3個(gè)方面因素有關(guān):機(jī)體ROS 大量增加;非酶性抗氧化分子減少;腎組織內(nèi)的抗氧化酶活性改變。而ROS產(chǎn)生過多，可激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)如p38/MAPK、ERK和JNK/SAPK、活化轉(zhuǎn)錄因子、表達(dá)轉(zhuǎn)化生化因子-β(TGF-β)等活性產(chǎn)物，使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白合成增加，降解減少，導(dǎo)致DN的發(fā)生和發(fā)展[3]。在DN的發(fā)病機(jī)制中，如何有效降低氧化應(yīng)激損傷成為關(guān)注熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過MTT法檢測，發(fā)現(xiàn)GA能夠顯著提高高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷的腎小球系膜細(xì)胞活力，提高細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞內(nèi)由高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。

DN的發(fā)病機(jī)制之一就是高血糖所導(dǎo)致的代謝異常，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，即線粒體電子傳遞鏈形成的超氧化物增多。而氧化應(yīng)激的主要表現(xiàn)為ROS、MDA的增多和抗氧化酶SOD活性的下降。另外，有研究顯示，高糖所致的腎皮質(zhì)損傷也與氧化應(yīng)激有關(guān)。在DN的發(fā)病中，氧化應(yīng)激起到了關(guān)鍵的作用。在糖尿病/高血糖狀態(tài)下，大多數(shù)組織都會產(chǎn)生大量的活性氧。在DN時(shí)，腎小球系膜細(xì)胞能夠產(chǎn)生過量的ROS。同時(shí)，腎小球系膜細(xì)胞在高糖環(huán)境下生長，氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用。在高糖環(huán)境中，氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要表現(xiàn)為ROS產(chǎn)生增多[8-9]。同時(shí)，ROS可以與蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生反應(yīng)，從而引起炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖等。另外，在DN中ROS與細(xì)胞增殖和DNA合成有密切的關(guān)系。在糖尿病/高血糖中，活性氧ROS主要在線粒體產(chǎn)生，因此ROS也可以破壞線粒體[10]。除了ROS在氧化應(yīng)激中起到重要作用外，中和降解內(nèi)源性抗氧化劑在細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)中也起到了重要的作用。例如，Mn-SOD也稱作SOD2，是一種重要的抗氧化酶，Mn-SOD的主要作用是調(diào)節(jié)ROS的新陳代謝。所以，當(dāng)Mn-SOD代謝紊亂時(shí)會導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增多，進(jìn)而引起DN損傷。

另外，有研究表明，白藜蘆醇能夠改善高脂飲食引起的肥胖癥和胰島素抵抗，其主要作用也是通過調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1通路而增加Mn-SOD的合成[11]。還有研究表明，SIRT1能夠改善糖尿病/高血糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，主要是通過上調(diào)Mn-SOD的表達(dá)而發(fā)揮作用[12]。氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠?qū)е翸DA的產(chǎn)生過多，并且能夠?qū)е?-OHdG相應(yīng)的增加而誘導(dǎo)DNA氧化損傷。因此，SOD水平和MDA表達(dá)量是氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要標(biāo)志物，引起氧化應(yīng)激標(biāo)志物變化的原因之一就是抗氧化酶的活性降低，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。另外有研究證實(shí)，GA能夠通過抗氧化作用減緩四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)GA對DN具有保護(hù)作用，其涉及的可能分子機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)。本研究利用免疫組織化學(xué)及Western blot方法檢測Mn-SOD表達(dá)變化，結(jié)果表明Mn-SOD在正常腎小球系膜細(xì)胞中有表達(dá)，在高糖組中Mn-SOD蛋白表達(dá)減少，而HG+GA組中表達(dá)有所增加，說明GA能促進(jìn)高糖誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞中Mn-SOD蛋白的表達(dá)，抑制ROS,對高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，GA可以減輕高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，其主要機(jī)制與降低胞內(nèi) ROS 產(chǎn)生和增加Mn-SOD蛋白的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中GA減緩氧化應(yīng)激損傷具體機(jī)制并未闡明，還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

[1]李棟，林珊．microRNAs在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用[J]．天津醫(yī)藥，2015，43(6)：698-701．

[2]AghadavodE,KhodadadiS,BaradaranA,etal.Roleofoxidativestressandinflammatoryfactorsindiabetickidneydisease[J].IranJKidneyDis,2016,[6]Worley MJ，Liu S，Hua Y,et al.Molecular changes in endometriosis-associated ovarian clear cell carcinoma[J].Eur J Cancer,2015,360(13):1831-1842.

[7]陳安安，汪炬.腫瘤中雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究進(jìn)展[J].中國病理生理雜志,2012,28(3):570-576.

[8]Lai CR，Hsu CY，Chen YJ ，et al.Ovarian cancers arising from endometriosis:a microenvironmental biomarker study including ER,HNF-1β,p53,PTEN,BAF250a,and COX-2[J].J Chin Med Assoc,2013,76(11):629-634.

[9]DeLair D,Oliva E,Kobel M,et al.Morphologic spectrum of immunohistochemically characterized clear cell carcinoma of the ovary:a study of 155 cases[J].Am J Surg Pathol,2011,35(1):36-44.

[10]Tsuchiya A,Sakamoto M,Yasuda J,et al.Expression profiling in ovarian clear cell carcinoma:identification of hepatocyte nuclear factor-1 beta as a molecular marker and a possible molecular target for therapy of ovarian clear cell carcinoma[J].Am J Pathol,2003,163(6):2503-2512.

[11]Carli C,Metz CN,Al-Abed Y,et al.Up-regulation of cyclooxygenase-2 expression and prostaglandin E2 production in human endometriotic cells by macrophage migration inhibitory factor:involvement of novel kinase signaling pathways[J].Endocrinology,2009,150(7):3128-3137.

[12]Sivula A,Talvensaari-Mattila A,Lundin J,et al.Association of cyclooxygcnase-2 and matrix metallop roteinase-2 expression in human breast cancer[J]．Breast Cancer Res Treat，2005，89(3)：21-25.

[13]易金玲，沈艷麗，馮文廣，等.子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中miR-556-3 p、VEGF 表達(dá)變化 [J].山東醫(yī)藥，2016，56(7):50-52.

Influenceofglycyrrhizicacidonoxidativestressinjuryofglomerularmesangialcellsinducedbyhighglucose*

HouShaozhang1,ZhangTing1,LiYuan2,WuZhihui1

(1.DepartmentofPathology,BasicMedicalCollege;2.SchoolofNursing,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004，China)

ObjectiveTo investigate the influence of glycyrrhizic acid (GA) on oxidative stress injury in glomerular mesangial cells (HBZY-1) induced high glucose.MethodsHBZY-1 was cultured and divided into the normal control group,high glucose group and high glucose + GA group.The cell proliferation activity was measured by MTT assay.UV spectrophotometry was used to detect the SOD and MDA levels.And the ROS changes were detected by laser confocal microscopy.Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of Mn-SOD protein in various groups.Mn-SOD mRNA was detected by Q-PCR.Results(1)The morphological changes in each group:HBZY-1 cells were diamond-shaped,cells were normal and the structure was clear in the NG group.In the HG+GA group,the number of cells was increased slightly,individual cell body was slightly hypertrophy.The cell structure in the HG group was not clear,the cells appeared flat,the number was increased significantly,the cell body was slightly hypertrophy.(2)The proliferative effect of HBZY-1 in each group:compared with the NG group,the OD value in the HG group was significantly increased,and the OD value in the HG+GA group was decreased compared with the HG group(P<0.05).(3)The relative content of ROS in the HG group was higher than that in the NG group,and which in the HG+GA group was decreased (P<0.05).(4)The expression of Mn-SOD in each group:the relative expression of Mn-SOD in the HG group was significantly lower than that in the NG group (P<0.05),and the expression of Mn-SOD in the HG+GA group was increased compared with the HG group(P<0.05).ConclusionGlycyrrhizic acid has a certain inhibiting effect on the abnormal proliferation of HBZY-1 induced by high glucose.Glycyrrhizic acid can protect the cell hypertrophy and cell damage caused by glomerular mesangial cells via oxidative stress,and glycyrrhizic acid can regulate the Mn-SOD expression induced by high glucose.

glycyrrhizic acid;mesangial cell;oxidative stress

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.001

R364

A

1671-8348(2017)27-3745-03

2016-12-08

2017-05-26)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160106)。

侯紹章(1975-)，博士，副教授，主要從事糖尿病腎病及腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。