朱責梅， 陽際花， 楊絲絲， 何劍琴， 張愷芳， 奉水東， 凌宏艷Δ

(1. 常德職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學系， 湖南 常德 415003； 2. 南華大學生理學教研室，3. 南華大學社會醫(yī)學與衛(wèi)生事業(yè)管理學教研室， 湖南 衡陽 421001)

二氫楊梅素對2型糖尿病小鼠認知功能障礙的影響*

朱責梅1,2， 陽際花2+， 楊絲絲2， 何劍琴2， 張愷芳2， 奉水東3Δ， 凌宏艷2Δ

(1. 常德職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學系， 湖南 常德 415003； 2. 南華大學生理學教研室，3. 南華大學社會醫(yī)學與衛(wèi)生事業(yè)管理學教研室， 湖南 衡陽 421001)

目的觀察二氫楊梅素(DHM)對2型糖尿病(T2DM)小鼠認知功能障礙及海馬中BDNF蛋白表達的影響。方法將40只C57BL/6J小鼠首先隨機分為兩組：正常對照組(n=8)：普通飼料喂養(yǎng)；2型糖尿病模型組(n=32)：高糖高脂聯(lián)合100 mg/kg的STZ處理(造模過程中死亡5只，不成功3只)。24只建模成功的小鼠隨機分成3組：T2DM組、T2DM+L-DHM組和T2DM+H-DHM組，3組小鼠高糖高脂喂養(yǎng)，同時分別用等體積生理鹽水、125 mg/(kg·d) 的DHM和250 mg/(kg·d) 的DHM(1次/天，灌胃)處理16周。正常對照小鼠繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，同時用等體積生理鹽水(1次/天，灌胃)處理16周。16周后測定小鼠體重、空腹血糖、進行腹腔注射葡萄糖耐量實驗和相關(guān)行為學實驗。最后，Western blot檢測各組小鼠海馬中BDNF蛋白的表達。結(jié)果高糖高脂聯(lián)合100 mg/kg的STZ成功建立2型糖尿病小鼠模型。16周后，與正常對照組相比，T2DM組小鼠體重明顯下降，空腹血糖顯著升高，糖耐量顯著異常；而T2DM+DHM組相比T2DM組小鼠體重卻顯著增加、空腹血糖降低，且H-DHM可顯著改善T2DM小鼠糖耐量異常。行為學實驗結(jié)果顯示：與正常對照組相比，T2DM組小鼠學習記憶能力明顯下降；與T2DM組相比，T2DM+DHM組小鼠學習記憶能力得到改善，且H-DHM組更為明顯。Western blot結(jié)果顯示：與對照組相比，T2DM組小鼠海馬中BDNF蛋白表達顯著下降，而DHM組相比T2DM組小鼠其BDNF蛋白的表達明顯增加。結(jié)論二氫楊梅素可改善2型糖尿病小鼠認知功能障礙，其機制可能通過降血糖作用，并激活海馬中BDNF蛋白表達。

二氫楊梅素；2型糖尿??；小鼠；認知功能障礙；BDNF

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝紊亂綜合征，常伴視網(wǎng)膜病變、腎病、周圍神經(jīng)病變、大血管疾病等嚴重并發(fā)癥，近年來，大量研究證實糖尿病亦可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導致認知功能障礙，重者甚至可發(fā)展為癡呆[1-2]。糖尿病引起的認知障礙(diabetic cognitive impairment, DCI)主要表現(xiàn)在語義記憶，情景記憶，工作記憶，視覺空間能力，語言流暢度，知覺能力等受損[3]。研究顯示：高血糖、氧化應激、炎癥、海馬突觸可塑性改變、神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)的破壞、腦微血管損傷及腦內(nèi)胰島素信號通路的異常等因素均參與DCI的發(fā)病過程[4]，但在DCI的防治方面并不樂觀。因此，深入研究DCI的發(fā)病機制、探討其防治的新靶點，具有重要的臨床和社會意義。

植物黃酮類化合物普遍具有抗炎抗氧化，保護心血管等作用，也有文獻證實黃酮類化合物可改善認知功能、提高學習記憶等[5]。而二氫楊梅素(dihydromyricetin, DHM) 就是典型的黃酮類化合物，已有研究表明，DHM可降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖，改善D-半乳糖誘導的大鼠糖耐量異常，降低糖尿病大鼠血糖血脂[6-7]；李石飛等[8]報道二氫楊梅素能改善經(jīng)高糖、高胰島素處理后L6肌管細胞的胰島素抵抗；也有研究表明二氫楊梅素可改善阿爾茨海默癥大鼠的認知功能障礙[9]，改善缺血導致的學習和記憶缺陷[10]。這些研究提示：DHM對胰島素抵抗、糖尿病等代謝相關(guān)疾病具有防治作用，但DHM是否對糖尿病認知障礙具改善作用以及其機制探討目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J雄性小鼠，4周齡，體重18～19 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，動物使用許可證號：SCXK(蘇)2011-0003。小鼠在動物房(三或四只為一籠)適應性喂養(yǎng)一周后，正式實驗。每天晚上七點給小鼠投放鼠糧及更換飲水。動物房早晨六點至晚上六點為明，晚上六點至早晨六點為暗；環(huán)境溫度22℃～24℃、濕度40%～60%；保持充足的飼料及飲水(除測血糖，行為學測試等實驗時間外)。實驗操作遵照美國國立衛(wèi)生研究院NIH的《國家實驗動物健康與管理條例》進行。

1.2 主要實驗試劑和設備

二氫楊梅素(DHM)由中國科學院武漢植物研究所提供、鏈脲佐菌素 (STZ)購自美國Sigma、抗BDNF抗體購于上海碧云天生物公司；血糖儀(JPST-5)購于北京怡成生物電子技術(shù)有限公司、Y迷宮設備購自成都泰盟軟件有限公司、通用自發(fā)活動箱 購自上海吉量軟件科技公司、WMT-200水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)購于成都泰盟軟件有限公司。

1.3 2型糖尿病模型建立及實驗分組

四周齡雄性C57BL/6J小鼠40只，分籠適應性喂養(yǎng)1周，隨機選出8只作為正常對照組普通飼料喂養(yǎng)，其余小鼠為2型糖尿病模型(T2DM組,共32只)：高糖高脂飼料喂養(yǎng)。1月后，所有小鼠過夜禁食14 h，正常對照組小鼠給予檸檬酸緩沖液(pH 4.4) 100 mg/kg 腹腔注射，模型組小鼠給予1%STZ按 100 mg/kg 腹腔注射(每日 1 次，連續(xù) 3 日，死亡8只)，3 d后尾靜脈取血，用儀成血糖儀測定空腹血糖，如空腹血糖≥11.1 mmol/L，認為2型糖尿病小鼠模型建立成功。隨后，T2DM模型小鼠隨機分成3組(每組8只)： T2DM組、T2DM+L-DHM組和T2DM+H-DHM組。3組小鼠高糖高脂喂養(yǎng)，同時分別用等體積生理鹽水、125 mg/(kg·d) 的二氫楊梅素和250 mg/(kg·d) 的二氫楊梅素(1次/天，灌胃)處理16周。16周末稱重、測空腹血糖，隨后每組隨機選3只小鼠進行糖耐量實驗，剩余小鼠進行Y迷宮實驗。17周末進行新物體識別實驗，18周末進行水迷宮實驗。行為學實驗結(jié)束后，取海馬組織。

1.4 糖耐量實驗

小鼠過夜禁食12 h后，按照1 g/kg劑量腹腔注射10%葡萄糖溶液，在0，30，60，90，120 min時分別進行剪尾采血，測血糖。

1.5 行為學實驗

Y迷宮實驗: 在Y迷宮三臂外側(cè)分別標記A, B, C臂，將小鼠頭部朝臂末端放入，開始錄像(時長8 min，前3 min為適應階段，后5 min為測試階段)，讓小鼠在迷宮的三臂間自由活動，記錄從第3分鐘開始到實驗結(jié)束之間小鼠入臂的次序，如進入到A臂則記錄為A。自發(fā)交替指的是小鼠在連續(xù)的3次不同探索入臂，最大交替次數(shù)即為總?cè)氡鄞螖?shù)減去2，Y迷宮的統(tǒng)計值用交替正確率表示，即自發(fā)交替率(SA%)， SA%=(自發(fā)交替次數(shù)÷最大交替次數(shù))×100%。如小鼠入臂次序為ACBACABACBC，入臂總次數(shù)為11，自發(fā)交替次數(shù)為6，SA% = 6/(11-2) ×100 %= 66.7 %。

新物體識別實驗: 將小鼠放入自發(fā)活動箱并按順序做好記錄，適應5 min后放回鼠籠，24 h后進入訓練期。訓練階段—將兩個相同的物體(白色玻璃蘋果)安置在內(nèi)箱中使相距10 cm，且兩物體位置保持不變，將小鼠面對箱壁、身體與側(cè)壁相平行放入離人最遠的箱壁中間位置，關(guān)閉箱門，開始錄像，小鼠熟悉初始樣本物體(約10 min)后，放回鼠籠。經(jīng)24 h的間隔期后進入測試階段—將自發(fā)活動箱內(nèi)其中一個原物體用酒精擦拭后放回原位置，另一個替換成新物體(綠色塑料圓柱)。將小鼠按順序放入活動箱內(nèi)并錄像5 min后放回鼠籠，然后打開錄入的視頻，用秒表分別計算測試期小鼠探索舊物體 (TF) 和探索新物體 (TN) 的時間，可分為直接或間接接觸物體的時間，直接接觸包括小鼠嘴，鼻子或者爪子直接碰觸物體，不包括小鼠背對著物體，經(jīng)過物體，站在，坐在或依靠在物體上[11]，間接接觸指的是小鼠在鼻子離物體的距離小于或等于2 cm處進行試探行為。最后通過辨別指數(shù)(discrimination index, DI)來判斷小鼠認知功能，DI = 100*(TN-TF)/(TN+TF)。辨別指數(shù)越高，說明小鼠的記憶力越強，認知功能越好。

水迷宮實驗：使用水迷宮實驗檢測小鼠空間記憶能力，本實驗在一個單獨房間完成，使用一個圓形水池等分為4個扇形象限，在第三象限下放一逃逸平臺且位置不變，其頂部距離水面1cm,水溫控制在22℃左右。實驗連續(xù)進行6 d，可視平臺訓練(第1天)：每只小鼠被放在平臺上停留20 s，然后讓其自由游泳30 s后再放回平臺上休息20 s。隱藏平臺訓練(第2～5天)：在圓池中注水至高于平臺1 cm，并撒入無毒的二氧化鈦粉末，攪勻至白色懸濁狀隱藏平臺，將小鼠面朝池壁從第一象限輕放入水中，60 s內(nèi)小鼠能發(fā)現(xiàn)平臺就讓其在平臺上休息20 s，并記錄小鼠找到平臺的時間(潛伏期)，若60 s內(nèi)未找到平臺，將小鼠趕到平臺上停留20 s后放回鼠籠，潛伏期按60 s 計算。再將小鼠分別從第二、第三、第四象限放入，并確保每只小鼠兩輪實驗之間相隔時間為15～20 min。連續(xù)訓練4 d，小鼠找到逃逸平臺的潛伏期及游泳距離越小，說明小鼠的空間記憶能力越強?？臻g探索實驗(第6天)：撤除平臺，讓每只小鼠放入后自由游泳60 s。攝像跟蹤記錄小鼠經(jīng)過目標象限(原放平臺的象限)的總時間以及游泳軌跡。小鼠穿越平臺次數(shù)越多，在目標象限所占時間百分比越大，說明小鼠的空間記憶能力越強[12]。

1.6 Western blot檢測海馬BDNF蛋白表達

取0.25g海馬組織，用PBS清洗3遍，加入300 μl RIPA裂解液于勻漿器中反復研磨，低溫高速離心機離心 15 min后取上清液裝于離心管中備用。然后用BCA蛋白試劑盒測定樣品蛋白的濃度。調(diào)整各組蛋白濃度相等后，各取等體積樣品蛋白進行SDS-PAGE電泳、 轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉2 h、加入抗BDNF抗體孵育過夜，TBST洗滌3次，加入辣根過氧化酶標記的二抗孵育2 h，充分洗滌后與ECL化學發(fā)光試劑反應，曝光后掃描，用圖像分析軟件進行光密度分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1二氫楊梅素使2型糖尿病小鼠體重增加，血糖降低

如圖1所示：與正常對照組相比，T2DM組小鼠體重顯著下降，血糖明顯升高，提示高糖高脂聯(lián)合STZ可成功復制出2型糖尿病小鼠模型。與T2DM組相比，T2DM+L-DHM和T2DM+H-DHM組小鼠體重顯著增加，血糖顯著下降，但T2DM+L-DHM組和T2DM+H-DHM組之間無顯著性差異，表明DHM可增加2型糖尿病小鼠體重、降低血糖。

2.2 二氫楊梅素改善2型糖尿病小鼠糖耐量異常

糖耐量實驗結(jié)果顯示：T2DM組小鼠血糖在0、15、30、60、90、120 min均顯著高于正常對照組，提示T2DM小鼠糖耐量異常；與T2DM組相比，T2DM+H-DHM組血糖在30、60、90、120 min均顯著降低，但仍然高于正常對照組。而T2DM+L-DHM組與T2DM組相比無顯著性差異(圖2)。提示250 mg/(kg·d)二氫楊梅素可改善T2DM小鼠糖耐量異常。

2.3二氫楊梅素改善2型糖尿病小鼠認知功能障礙

2.3.1 Y迷宮實驗 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，T2DM組自發(fā)轉(zhuǎn)換率(SA%)顯著降低(P<0.01)；與T2DM組相比，T2DM+L-DHM組SA%升高 (P<0.05)，T2DM+H-DHM組SA%進一步升高 (P<0.01) ，提示2型糖尿病小鼠的認知功能發(fā)生障礙，而二氫楊梅素可改善2型糖尿病小鼠的認知障礙(圖3A)。與對照組相比T2DM組，T2DM+L-DHM組和T2DM+H-DHM組小鼠在5 min內(nèi)入臂總次數(shù)無顯著性差異，表明2型糖尿病小鼠運動量無變化，二氫楊梅素對2型糖尿病小鼠的自發(fā)運動能力無影響(圖3B)。

2.3.2 新物體識別實驗 如圖4結(jié)果顯示：四組小鼠總物體探索時間無顯著性差異，說明4組小鼠對新舊物體的喜好程度無差異。與對照組相比，T2DM組小鼠新物體辨識指數(shù)顯著降低；與T2DM組相比，T2DM+L-DHM組和T2DM+H-DHM組小鼠的新物體辨識指數(shù)顯著升高。表明T2DM小鼠新穎物體識別記憶能力受損，二氫楊梅素可在一定程度上改T2DM小鼠新物體識別記憶能力。

2.3.3 水迷宮實驗 如圖5A和5B所示：在第1天的可視平臺實驗中，4組小鼠的逃逸潛伏期及游泳距離沒有顯著性差異，說明各組小鼠之間視力水平一致。從第2天到第5天的隱藏平臺定位航行實驗中，T2DM小鼠找到平臺的潛伏期及游泳距離均顯著高于對照組(P<0.01)； L-DHM和H-DHM可顯著縮短T2DM小鼠的潛伏期及游泳距離。在第6天的空間探索實驗(圖2.5 C和2.5 D)中，T2DM組小鼠穿越平臺次數(shù)，目標象限停留時間比均顯著低于對照組(P<0.01)；T2DM+L-DHM組及T2DM+H-DHM組小鼠穿越平臺次數(shù)，目標象限停留時間比顯著高于T2DM 組(P<0.05，P<0.01)。表明2型糖尿病小鼠空間工作記憶能力下降，不能在短時間內(nèi)找到逃逸平臺，提示二氫楊梅素可改善2型糖尿病小鼠的空間記憶能力，逃避有害刺激。

2.4DHM對2型糖尿病小鼠海馬BDNF蛋白表達的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，T2DM組小鼠海馬中BDNF蛋白表達量顯著降低(P<0.01)；與T2DM組相比，T2DM+L-DHM組和T2DM+H-DHM組的BDNF蛋白表達量顯著性升高。提示低、高劑量二氫楊梅素均可促進T2DM小鼠海馬中BDNF蛋白的表達 (圖6)。

3 討論

隨著全球經(jīng)濟的迅速增長，人們生活水平的提高及人口老年化日趨嚴重，糖尿病患病率持續(xù)增長，糖尿病引起的認知功能障礙也逐漸被重視。流行病學研究及臨床數(shù)據(jù)表明糖尿病是引發(fā)認知功能障礙的獨立危險因素，且研究表明糖尿病人患認知功能障礙的風險相對正常人增加20%～60%[13]，同時糖尿病人患阿爾茨海默癥[14-15]及抑郁癥[16]的風險分別是常人的2～3倍，極大地加速患者認知功能障礙。二氫楊梅素(DHM)為葡萄科藤茶的提取物，活性成分以雙氫黃酮類化合物為主，具有降糖、降脂、抗腫瘤等多種藥理作用[17]，而高血糖又是導致糖尿病認知功能障礙的主要病因之一。BDNF作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，不僅對神經(jīng)元的發(fā)生、發(fā)育和存活具有重要調(diào)節(jié)作用[18]，而且對神經(jīng)元功能的維持以及神經(jīng)退行性疾病中的損傷具有保護作用[19-20]。因此，本實驗探究DHM對糖尿病認知功能障礙的改善作用，及其與BDNF相關(guān)的作用機制。

本實驗以4周齡的C57BL/6J雄性小鼠為對象，首先利用STZ聯(lián)合高糖高脂復制2型糖尿病(T2DM)小鼠模型，每周定期檢測小鼠的體重和血糖，16周后小鼠表現(xiàn)有明顯的多飲、多食、多尿、消瘦等糖尿病癥狀，且與正常飼養(yǎng)組小鼠相比活動量明顯減少，表明T2DM模型制備成功，并出現(xiàn)認知表現(xiàn)上的差異。于是對小鼠體重、血糖、糖耐量進行測定，結(jié)果顯示：T2DM模型組與正常組小鼠相比體重下降、血糖顯著性升高、糖耐量異常；與T2DM模型組相比，而DHM+T2DM組小鼠的體重有所增加、血糖明顯降低、H-DHM組小鼠的糖耐量異常也明顯得到改善，表明DHM可改善T2DM小鼠的部分癥狀。

糖尿病引起的認知缺陷主要表現(xiàn)在情景記憶，語言語義記憶，空間記憶能力等受損。進一步我們對所有實驗小鼠進行Y迷宮、新物體識別、水迷宮等行為學檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常組比，T2DM模型組小鼠的辨別性學習記憶、新物體識別記憶、空間工作學習能力均下降，而DHM+T2DM組小鼠的這些行為學習能力強于T2DM模型組，且H-DHM組更為明顯。結(jié)果表明2型糖尿病小鼠出現(xiàn)認知功能障礙(DCI)，且DHM對此T2DM的認知功能障礙具有改善作用。

DCI是一種以學習記憶障礙為主的神經(jīng)退行性病變， BDNF的減少與DCI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我們采用Western blot方法檢測小鼠海馬中BDNF蛋白的表達，結(jié)果顯示：與對照組相比，T2DM組小鼠海馬BDNF蛋白表達顯著下降， DHM組小鼠海馬內(nèi)BDNF蛋白表達明顯高于T2DM模型組，提示DHM可能通過提高T2DM小鼠海馬BDNF蛋白的表達改善DCI。

綜上所述，我們首次報道DHM可能通過降低T2DM小鼠血糖，提高海馬BDNF蛋白的表達來發(fā)揮改善2型糖尿病認知功能障礙的作用。然而，DHM是通過何種分子途徑激活BDNF蛋白的表達，尚須進一步實驗證明。

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Theeffectsofdihydromyricetinoncognitivedysfunctionintype2diabetesmice

ZHU Ze-mei1,2, YANG Ji-hua1+, YANG Si-si1, HE Jian-qin1, ZHANG Kai-fang1, FENG Shui-dong2Δ, LING Hong-yan1Δ

(1. Department of Medicine, Changde Vocational Technical College， Changde 415003; 2. Department of Physiology, University of South China, 3. Department of Social Medicine and Health Service Management , University of South China， Hengyang 421001, China)

Objective: To observe the effects of dihydromyricetin(DHM) on cognitive dysfunction and expression of brain derived neurotrophic factor(BDNF) protein in hippocampus of type 2 diabetic mice(T2DM).MethodsForty C57BL/6J mice were randomly divided into two groups, normal control group (n=8): normal diet feeding; T2DM model group (n=32): high-glucose and high-fat combined with 100 mg/kg streptozocin(STZ) treatment (five mice died during modeling and three failed). Twenty-four diabetic mice were modeled successfully and divided into three groups (T2DM group, T2DM+L-DHM group and T2DM+H-DHM group). Three groups mice were fed with high-glucose and high-fat diet, and treated with equal volume of normal saline, 125 mg/(kg·d) DHM or 250 mg/(kg·d) DHM for 16 weeks respectively. The control mice were fed with normal diet and treated with equal volume of saline (once a day, gavage) for 16 weeks. After 16 weeks, the body weight and fasting blood glucose were measured, intraperitoneal glucose tolerance test and related behavioral experiment were performed. Finally, the expression of BDNF protein in hippocampus of mice was detected by Western blot.ResultsThe model of type 2 diabetes mellitus was established successfully with high-glucose and high-fat combined with 100 mg/kg STZ. After 16 weeks, the body weight of T2DM group was significantly decreased, the fasting blood glucose was significantly increased and the glucose tolerance was significantly abnormal compared with the normal control group. Compared with T2DM group, the body weight of T2DM+DHM groups mice was increased, while the levels of fasting blood glucose were decreased. And H-DHM could significantly improve the abnormal glucose tolerance of T2DM mice. Behavior test results showed that the ability of learning and memory of T2DM mice was significant decreased compared with control group, but these phenomena were improved in T2DM+DHM groups mice, and T2DM+H-DHM group was more obvious. Western blot analysis showed that the expression of BDNF protein in hippocampus of T2DM group was significantly lower than that of control group, while T2DM+DHM group was significant increased compared with T2DM mice.ConclusionDihydromyricetin can improve the cognitive dysfunction in type 2 diabetic mice. The mechanism may be through hypoglycemic effect and activation of BDNF protein expression in hippocampus.

dihydromyricetin; type 2 diabetes; mouse; cognitive impairment; BDNF

R587.2；R 742

A

1000-6834(2017)04-323-06

10.12047/j.cjap.5478.2017.079

教育部留學歸國基金(教外司留[2014]1685號)；湖南省科技廳(2015JC3085)；湖南省教育廳課題(16C1411)

2016-07-25

2017-06-16

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Tel: 86-0734-8281389, Tel: 86-0734-8281621； E-mail: linghongyan0203@126.com， E-mail: shuidong_f@hotmail.com;+：為共同第一作者