林琴琴， 耿元文， 高 婧， 田振軍

(1. 燕山大學 體育學院， 河北 秦皇島 066004； 2. 陜西師范大學 體育學院， 陜西 西安 710062)

間歇有氧運動對MI大鼠腎臟CD40表達的影響及可能機制*

林琴琴1△， 耿元文1， 高 婧1， 田振軍2

(1. 燕山大學 體育學院， 河北 秦皇島 066004； 2. 陜西師范大學 體育學院， 陜西 西安 710062)

目的探討間歇有氧運動對心肌梗死(MI)大鼠腎臟CD40表達的影響，揭示運動改善MI腎臟功能的可能機制。方法36只雄性SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組 (Sham)、心肌梗死組 (MI)、心梗+間歇運動組(ME)，每組12只。MI組采用心臟左冠狀動脈前降支 (LAD) 結(jié)扎法，建立MI模型。Sham組大鼠實施假手術(shù)，ME 組大鼠在MI 手術(shù)后1周進行8周跑臺運動。運動開始速度為10 m/min運動10 min 后，速度逐漸增至25 m/min×7 min，再以15 m/min×3 min 運動，之后依次交替進行。每天60 min×1次，每周5 d，共8周。訓練結(jié)束后次日，各組大鼠評定心功能，腹主動脈取血及獲取腎臟組織后，測定腎臟膠原容積百分比(CVF)、CD40、hs-CRP、TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65、BUN和 sCr等指標變化。結(jié)果與Sham組比較，MI組大鼠LVEDP升高，LVSP和±dp/dt max顯著降低, 腎臟CVF升高; MI后可見腎臟腎小管細胞胞漿中CD40陽性染色，CD40蛋白和mRNA表達增多，血清及腎臟hs-CRP、TNF-α和IL-6表達升高， 同時腎臟p-NF-κBp65蛋白表達增多， 血清BUN和 sCr表達增高。與MI組比較，ME組大鼠LVEDP降低，LVSP和±dp/dt max升高，腎臟CVF降低；腎臟CD40蛋白和mRNA表達減少，血清及腎臟hs-CRP、TNF-α和IL-6表達降低；同時腎臟p-NF-κBp65蛋白表達降低，血清BUN和 sCr表達減少。結(jié)論間歇有氧運動可顯著降低心梗大鼠腎臟CD40表達，抑制NF-κB通路，減少血清及腎臟炎癥因子表達，改善心梗大鼠腎臟功能。

心肌梗死；間歇有氧運動；CD40；腎臟；炎癥因子；大鼠

臨床上，心肌梗死 (myocardial infarction, MI) 患者常見并發(fā)癥為腎小球濾過功能受損和水重吸收異常引起腎功能不全而導致的下肢浮腫，與MI誘發(fā)腎臟炎癥反應導致腎臟功能紊亂密切相關(guān)[1]。促炎因子分化抗原40 (cluster of differentiation 40，CD40) 與其配體(CD40L)結(jié)合激活后，可導致腎臟炎癥因子表達增加，參與腎臟損傷[2]，誘發(fā)腎功能紊亂。目前常用的靶向抑制CD40L抗體在增強腎功能的同時，也增加血栓栓塞并發(fā)癥的發(fā)生[3]。新近研究證實，靶向抑制CD40可顯著減輕腎臟近端小管上皮細胞和腎小球系膜細胞的促炎癥應答反應[4]，減少海曼腎炎大鼠腎臟損傷和炎癥反應[5]。除了靶向抑制CD40之外，運動訓練作為一種安全有效的干預手段，已經(jīng)成為預治MI 疾病的重要干預措施。 適宜運動訓練在改善心功能的同時，可抑制MI后腎臟氧化應激水平[6]，改善缺氧引起的腎血流減少[7]，減輕腎臟纖維化與液體潴留，減緩腎臟功能紊亂[8]。研究表明，間歇運動較持續(xù)有氧運動對心功能的改善效應更顯著，有氧運動可降低高脂膳食小鼠血清CD40水平[9]。但間歇運動是否可通過降低心梗腎臟CD40水平，改善腎臟功能，缺少文獻報道。本研究擬探討間歇有氧運動抑制CD40表達對心梗大鼠腎臟的保護效應及機制，為心梗及其并發(fā)癥的運動療法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

采用3月齡雄性SD大鼠36只，初始體重180～220 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供(合格號為SCXK2012-098)。隨機分為假手術(shù)組 (Sham組)、心肌梗死組 (MI組)、心梗+間歇運動組(ME組)。每組12只。動物室內(nèi)溫度為20℃～23℃，濕度為50%～60%，標準嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食，光照與非光照各12 h。Sham組大鼠籠內(nèi)常規(guī)安靜飼養(yǎng)，MI 組結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)建立MI 模型。ME 組進行為期8周的動物跑臺訓練。

1.2 MI模型制備及間歇運動方案

大鼠腹腔麻醉(5%戊巴比妥鈉)，采用自制大鼠呼吸面罩進行呼吸機輔助呼吸(60 counts/min, 潮氣量16 ml, 呼吸比2∶1)，PowerLab生理信號采集處理系統(tǒng)記錄大鼠肢導心電圖 (electrocardiogram, ECG)。開胸暴露心臟，體視顯微鏡下，在左心耳根部和肺動脈圓錐左緣交界下1～2 mm 處結(jié)扎左冠狀動脈前降支(left anterior descending (coronary artery), LAD)。結(jié)扎后可見左室靠近心尖部位的顏色逐漸變淺或變白，心電圖出現(xiàn)S-T段抬高或T波倒置現(xiàn)象。以此判定MI造模成功，之后逐層縫合關(guān)胸。為了排除手術(shù)因素干擾，Sham組大鼠進行同樣手術(shù)過程，但僅穿線而不結(jié)扎LAD。ME組大鼠在MI模型成功后1 周開始訓練。運動方案參考Wisloff訓練模型略加改動[10]。第一周為適應性訓練 (10～15 m/min，30 min/d，共5 d)。正式訓練采用遞增式跑臺訓練，起始速度10 m/min，時間為10 min。之后進行間歇有氧運動，速度為25 m/min，運動時間7 min；后間歇3 min，速度為15 m/min，依次交替進行。每天運動總時間為60 min，每周訓練5 d，連續(xù)訓練8 周。

1.3 血流動力學指標測定、取材與樣品處理

8周運動結(jié)束后次日， PowerLab生理信號采集系統(tǒng)檢測血流動力學指標。右頸總動脈逆行插管至左心室測試左室收縮壓(left ventricular systolic pressure, LVSP)、左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)和左室壓力最大上升、下降速率(± dp/dt max)。數(shù)據(jù)采集完畢后，腹主動脈取血，后迅速摘取腎臟，置于10%中性甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、制片(5 μm)，用于天狼猩紅染色和免疫組化實驗。另取腎臟，液氮驟冷后移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組織化學染色

石蠟切片脫蠟至水，PBS清洗，3% H2O2處理10 min，微波抗原修復，PBS清洗，正常山羊血清封閉 (37℃, 30 min)，孵育一抗 (CD40，1∶100)， 4℃過夜， PBS清洗，孵育二抗 (37℃, 30 min)，PBS清洗，孵育SABC復合物 (37℃, 30 min)，PBS清洗，DAB顯色，蘇木精復染、封片。PBS取代一抗設(shè)置為陰性對照。

將本市中醫(yī)肝膽醫(yī)院2014年5月~2017年6月收治的心血管疾病患者87例分為觀察組和對照組,其中觀察組44例,男女比例為25:19,年齡46~75歲,平均年齡(58.4±3.3)歲,病程3個月~18年,平均病程(9.7±1.5)年;對照組43例男女比例為23:20,年齡48~72歲,平均年齡(57.2±3.1)歲,病程5個月~17年,平均病程(8.7±1.9)年,對比兩組患者年齡、性別等一般資料(P>0.05)。

1.5 生化指標的測試

血液標本離心后取上清液， 嚴格按照試劑盒說明書(南京建成生物科技有限公司提供)對血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)和血肌酐(serum creatinine, sCr)含量進行測定；嚴格按照ELISA試劑盒說明書(R&D公司)操作步驟對血清及腎臟高敏C反應蛋白(high-sensitivity C reactive protein, hs-CRP)、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α)和白介素(interleukin, IL)-6的含量進行測定。

1.6 Western blot實驗

采用RIPA提取腎臟總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，10%～12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，麗春紅染色，3% BSA室溫封閉30 min后，分別加入兔抗多克隆抗體CD40 (1∶400)、p-NF-κBp65 (1∶400)和NF-κBp65 (1∶400)，4℃過夜，室溫復溫30 min后，加入HRP標記的羊抗兔IgG抗體 (1∶10 000) 孵育30 min，TBST清洗，ECL發(fā)光。內(nèi)參為GAPDH (1∶10 000)。

1.7 RT-qPCR

用Trizol試劑提取腎臟總RNA，嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA, 后進行RT-qPCR反應，內(nèi)參為GAPDH。引物序列如下：CD40 上游引物：5'-TAGCCAC TGCACAGCTCTTG-3'，下游引物：5'-GAAGCCCTTGATTGAGTTCG-3'，擴增產(chǎn)物長度為125 bp；hs-CRP上游引物：5'-CACAACAGTCAGTCAAGG-3'，下游引物：5'-GTGCTATCTCCAGAACA G-3'，擴增產(chǎn)物長度為140 bp；TNF-α上游引物：5'-CCAACAAGGAGGAG AAGT-3'，下游引物：5'-GTATGAAGTGGCAAATCG-3'，擴增產(chǎn)物為323 bp；IL-6上游引物： 5'-CCACTGCCTTCCCT ACTT-3'，下游引物：5'-GCATCATCGCTGTTCATA C-3'，擴增產(chǎn)物為181 bp；GAPDH 上游引物：5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGA C-3'，下游引物：5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'，擴增產(chǎn)物為252 bp。反應條件如下：95℃ 10 min，1 循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 循環(huán); 72℃ 10 min。每個樣品重復檢測3次。利用2-△△Ct法計算相對基因表達量。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 心電圖及心功能的檢測結(jié)果

心電圖顯示，大鼠LAD結(jié)扎后即刻，心電圖出現(xiàn)S-T段抬高或T波倒置現(xiàn)象，由此斷定MI模型制備成功 (圖1A，C)。與Sham組比較，MI組大鼠LVEDP明顯升高(P<0.01)，LVSP和±dp/dt max明顯降低 (分別為P<0.05，P<0.01)。與MI組比較，ME組大鼠LVEDP顯著降低 (P<0.01)， LVSP和±dp/dt max 顯著增加(分別為P<0.01，P<0.05, 圖1D-G)。

2.2 腎臟間質(zhì)膠原的組織形態(tài)學檢測結(jié)果

天狼猩紅染色結(jié)果顯示，MI組大鼠腎臟間質(zhì)膠原較Sham組明顯增多增粗。8周間歇運動后，ME組大鼠腎臟間質(zhì)膠原減少。膠原容積百分比 (CVF)反映腎臟間質(zhì)纖維化程度。與Sham組相比，MI大鼠腎臟CVF顯著升高 (P<0.01)。8周間歇運動后，ME組大鼠腎臟間質(zhì)組織結(jié)構(gòu)較MI組有一定程度改善，腎臟CVF顯著降低 (P<0.01, 圖2)。

2.3 腎臟CD40表達的檢測結(jié)果

Fig.1Effects of aerobic interval training on haemodynamic parameters in rats with myocardial infarction (n=3) LVSP: Left ventricular systolic pressure; LVEDP: Left ventricular end-diastolic pressure; ±dp/dtmax: Maximal rise/fall velocity of left ventricular pressure; MI: Myocardial infarction; ME: Myocardial infarction with aerobic interval training*P<0.05，**P<0.01vssham group；#P<0.05，##P<0.01vsMI group

Fig.2Effects of aerobic interval training on changes of renal collagen in renal tissues of rats with myocardial infarction(bar =100 μm, ×400,n=5) CVF: Collagen volume fraction; MI: Myocardial infarction; ME: Myocardial infarction with aerobic interval training**P<0.01vssham group；##P<0.01vsMI group

光鏡下可見，腎臟腎小管細胞胞漿陽性顆粒呈棕色或棕黃色，陰性對照組無棕色或棕黃色顆粒。免疫組化結(jié)果顯示，Sham組大鼠腎小管細胞胞漿中略有棕黃色陽性顆粒， MI組大鼠腎臟陽性顆粒明顯增多，而ME組大鼠腎臟棕黃色陽性顆粒顯著減少。所有組別大鼠腎小球中無陽性顆粒表達 (箭頭所示)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，與Sham組比較，MI組大鼠腎臟CD40表達顯著增多 (P<0.01)。與MI組比較，ME組大鼠腎臟CD40表達明顯減少 (P<0.01, 圖3A，B)；利用Western blot和RT-qPCR方法進一步探討間歇有氧運動對MI大鼠腎臟CD40表達的影響。結(jié)果顯示，與Sham組比較，MI組大鼠腎臟CD40蛋白和mRNA表達均顯著升高 (P<0.01)。與MI組比較，ME組大鼠腎臟CD40蛋白和mRNA的表達均顯著降低(P<0.01, 圖3C，D)。

2.4血清及腎臟hs-CRP、TNF-α和IL-6表達的檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，與Sham組比較，MI組大鼠血清及腎臟hs-CRP、TNF-α和IL-6水平和mRNA表達均顯著升高 (P<0.01)。與MI組比較，ME組大鼠血清及腎臟hs-CRP、TNF-α和IL-6水平和mRNA表達均明顯下降(P<0.01，圖4)。

2.5 腎臟磷酸化NF-κBp65表達的檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，與Sham組比較，MI組大鼠腎臟磷酸化NF-κB p65蛋白表達顯著增多 (P<0.01)。與MI組比較，ME組大鼠腎臟磷酸化NF-κB p65蛋白表達顯著減少 (P<0.01，圖5)。

Fig.3Effects of aerobic interval training on CD40 expression in rats with myocardial infarction (n=3) CD40: Cluster of differentiation 40; MI: Myocardial infarction; ME: Myocardial infarction with aerobic interval training**P<0.01vssham group；##P<0.01vsMI group

Fig.4Effects of aerobic interval training on expressions of hs-CRP, TNF-α and IL-6 in rats with myocardial infarction (n=3) hs-CRP: High-sensitive C-reactive protein; TNF-α: Tumor necrosis factor-alpha; IL-6: Interleukin-6; MI: Myocardial infarction; ME: Myocardial infarction with aerobic interval training**P<0.01vssham group；##P<0.01vsMI group

2.6 腎功能的檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，與Sham組比較，MI組血清BUN和sCr表達增多 (P均<0.01)。與MI組比較，ME組血清BUN和sCr表達減少 (P均<0.01)。表明心梗受損導致腎功能紊亂，間歇運動干預可有效改善腎臟功能紊亂(圖6)。

Fig.5Effects of aerobic interval training on expression of p-NF-κBp65 in rats with myocardial infarction (n=3) p-NF-κBp65: Phospho-nuclear factor-kappaBp65; MI: Myocardial infarction; ME: Myocardial infarction with aerobic interval training**P<0.01vssham group；##P<0.01vsMI group

Fig.6Effects of aerobic interval training on the levels of BUN and sCr in rats with myocardial infarction (n=3) BUN: Blood urea nitrogen; sCr: Serum creatinine; MI: Myocardial infarction; ME: Myocardial infarction with aerobic interval training**P<0.01vssham group；##P<0.01vsMI group

3 討論

近年來，通過運動改善心功能的研究報道越來越多。研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動可顯著降低心肌細胞凋亡[11]，調(diào)控心血管調(diào)節(jié)因子表達[12]，提升心功能。本實驗組前期研究結(jié)果表明，有氧運動可顯著降低心梗后心衰大鼠LVEDP，增加LVSP，改善心梗后心衰大鼠心臟病理性重構(gòu)和心功能[8]。最近研究表明，間歇運動明顯降低心梗致心衰大鼠LVEDP和心臟膠原容積分數(shù)，提高LVSP和±dp/dt max，顯著改善病理性心臟重塑，提高最大運動能力[13]。本研究結(jié)果顯示，心梗大鼠8周間歇運動干預后，LVSP和±dp/dt max顯著升高，LVEDP顯著降低，與上述研究結(jié)果相一致，進一步證實間歇有氧運動對心臟的保護效應。已知心梗常伴隨著腎臟功能紊亂，而有氧運動可抑制心梗后腎臟氧化應激和交感神經(jīng)活性[6]，增加缺氧引起的腎血流減少[7]，減輕腎臟纖維化和液體潴留[8]，降低腎臟病理性重構(gòu)和腎臟功能紊亂。本研究結(jié)果顯示，MI大鼠血清BUN和sCr水平升高，腎臟間質(zhì)膠原明顯增多增粗，CVF顯著升高。間歇運動可顯著降低MI大鼠血清BUN和sCr水平，減少腎臟間質(zhì)膠原沉積，降低CVF。推測，間歇運動在改善心功能同時，減緩MI導致的腎臟功能紊亂和病理性重構(gòu)。本研究的重點從腎臟炎癥反應和促炎因子CD40表達異常角度探討間歇運動對心梗后腎臟的保護作用。

在腎臟中，CD40廣泛表達在腎小管細胞，并且高表達在腎炎或其他炎性腎臟疾病中。研究發(fā)現(xiàn)，低劑量阿霉素誘導腎病小鼠腎小管上皮細胞和間質(zhì)細胞中CD40表達增多，腎小球中無表達[14]。本實驗研究與上述研究結(jié)果相一致，發(fā)現(xiàn)Sham組大鼠腎小管中CD40微弱表達，MI大鼠腎小管中CD40分布及表達密度增多增強，但兩組大鼠腎小球中均無CD40表達。與之相反的是，長期高劑量阿霉素誘導腎病小鼠模型中，CD40廣泛表達在腎小球、腎小管和間質(zhì)細胞中[15]。結(jié)果提示: 刺激因素、時間及疾病類型不同，腎臟CD40表達定位不同，其功能作用可能不同。研究證實，MI誘發(fā)腎臟炎癥反應，導致腎臟功能紊亂[1], 而CD40活化可促進炎癥因子表達，參與炎癥反應[16]。臨床研究結(jié)果證實，狼瘡性腎炎患者腎臟CD40表達增多，炎癥因子TNF-α、 IL-1β和IL-6表達增多[17]。本研究結(jié)果顯示，MI大鼠腎臟CD40蛋白和mRNA表達增加，腎臟及血清炎癥標志性因子hs-CRP、TNF-α及IL-6水平升高。結(jié)果說明，MI導致腎臟CD40活化，增加炎癥因子表達，促進炎癥反應級聯(lián)放大。提示，CD40信號系統(tǒng)可能是MI后腎臟損傷的重要參與者，抑制或減少CD40能有效緩解MI誘導的腎臟炎癥損傷。CD40配體拮抗劑MR1可顯著減少阿霉素腎病小鼠腎臟中CD40表達，緩解腎臟損傷[14,15]。除藥物外，運動訓練對緩解腎臟損傷有顯著作用。運動訓練可減少腎臟細胞凋亡，抑制間質(zhì)膠原沉積，減少腎臟氧化應激，進而減緩腎臟損傷[18]。本研究證實，間歇有氧運動可顯著減少MI大鼠腎臟腎小管中CD40表達，減少腎臟CD40蛋白和mRNA表達，降低腎臟及血清hs-CRP、TNF-α及IL-6水平。結(jié)果提示：間歇運動可通過減少腎臟促炎因子CD40表達，降低腎臟炎癥水平，緩解腎臟損傷。據(jù)文獻報道，CD40促炎機制與NF-κB信號通路有關(guān)，CD40可激活NF-κB信號通路，參與炎癥因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[19]。de Ramon等利用靶向基因沉默技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，腎臟缺血再灌注大鼠特異性基因沉默CD40，可顯著降低腎臟NF-κB表達，減少TNF-α分泌，減緩缺血導致的腎臟炎癥細胞浸潤[20]。 本實驗研究發(fā)現(xiàn)，8周間歇有氧運動可顯著減少MI大鼠腎臟CD40表達，降低腎臟NF-κB磷酸化水平，減少腎臟及血清炎癥因子表達。表明，間歇運動改善心梗大鼠腎臟炎癥狀態(tài)，發(fā)揮腎臟保護效應，可能與CD40-NF-κB的抑制有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，間歇有氧可通過降低心梗大鼠腎臟CD40表達，抑制NF-κB通路，減少血清及腎臟炎癥因子表達，改善心梗大鼠腎臟功能。

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EffectofaerobicintervaltrainingontheexpressionofrenalCD40inaratmodelwithmyocardialinfarctionanditsmechanism

LIN Qin-qin1△， GENG Yuan-wen1， GAO Jing1， TIAN Zhen-jun2

(1. Yanshan University, Qinhuangdao 066004; 2. Shanxi Normal University， Xi’an 710062, China)

Objective: To study the effects of aerobic interval training (AIT) on renal cluster of differentiation 40 (CD40) expression in rats with myocardial infarction (MI) and its possible mechanism.MethodsThirty-six rats were randomly divided into three groups (n=12): Sham, MI and MI with AIT (ME) groups. The MI model was established by ligation of the left anterior descending coronary artery. Treadmill training was performed five times a week for 8 weeks (AIT: 60 min/day with 10 min of warm-up at 10 m/min and 50 min of exercise at 25 m/min 7 min interspersed with 3 min at 15 m/min). After training, cardiaorenal function and renal tissue remodeling were evaluated. The changes of CD40, high-sensitivity C reactive protein(hs-CRP), TNF-α, IL-6, p-NF-κBp65, blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (sCr) were determined.ResultsCompared with the sham group, MI significantly increased left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) and decreased left ventricular systolic pressure (LVSP) and left indoor pressure change rate peak (dp/dtmax) in the MI group, concomitant with the increase in renal collagen volume fraction (CVF), which was reversed by AIT in the ME group. Moreover, compared with the sham group, CD40 was largely dispersed within the cytoplasm of renal tubule cells in the MI group. Meanwhile, the expressions of renal CD40 mRNA and protein, the levels of serum and renal hs-CRP, TNF-α and IL-6, the phosphorylation of NF-κBp65 (p-NF-κBp65) and the levels of sCr and BUN were obviously increased in the MI group. Compared with the MI group, AIT decreased the expressions of renal CD40 mRNA and protein, the levels of serum and renal hs-CRP, TNF-α and IL-6 and the expression of p-NF-κBp65, as well as decreased the levels of sCr and BUN in the ME group.ConclusionAIT reduces the expressions of renal CD40 protein and mRNA, inhibits NF-κB signaling pathway, and then decreases the levels of inflammatory factors thereby improve the renal dysfunction after MI.

myocardial infarction; aerobic interval training; CD40; kidney; inflammatory factor; rats

G804.7

A

1000-6834(2017)04-351-06

國家自然科學基金青年科學基金項目(31300978)；河北省科技支撐計劃項目(12277652)；河北省高等學?？茖W技術(shù)研究項目(YQ2014004)

2016-12-09

2017-05-12

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Tel: 0335-8057020; E-mail: linqinqin@ysu.edu.cn

10.12047/j.cjap.5537.2017.085