張 爽，胡 宏，鄭麗娟，王 燕，崔建強(qiáng)

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 712046)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的微波輔助提取工藝

張 爽，胡 宏，鄭麗娟，王 燕，崔建強(qiáng)

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 712046)

以陜西眉縣的瞿麥為研究對(duì)象，以乙醇為提取劑，采用微波輔助提取工藝提取瞿麥中總黃酮。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法確定最佳工藝為：料液比1∶20(g∶mL)、提取時(shí)間2 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在此條件下，重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn)，總黃酮得率為1.113%，與模型預(yù)測(cè)值基本吻合，說明模型能較好預(yù)測(cè)陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮得率，優(yōu)化工藝條件較可靠。

陜產(chǎn)瞿麥；總黃酮；響應(yīng)曲面法；微波輔助提取

Abstract：UsingDianthussuperbusfrom Mei county in Shaanxi as a research object，ethanol as an extractant,we extracted total flavonoids fromDianthussuperbusby microwave-assisted extraction process.On the basis of the single-factor experiment，using the yield of total flavonoids as an index,we optimized the extraction conditions by a response surface methodology as follows:solid-liquid ratio was 1∶20(g∶mL),extraction time was 2 min，and volume fraction of ethanol was 60%.Under above conditions，the yield of total flavonoids for three parallel experiments was 1.113%,which approximately agreed with the model prediction value.Overall，the model can better predict the yield of total flavonoids from ShaanxiDianthussuperbus,and the optimized extraction process is more reliable.

Keywords：ShaanxiDianthussuperbus;total flavonoids;response surface methodology;microwave-assisted extraction

瞿麥又名野麥、石柱花、十樣景花等，為石竹科石竹屬植物瞿麥DianthussuperbusL.的干燥地上部分，在我國(guó)東北、華北、西北(如陜西的太白山)地區(qū)分布廣泛。瞿麥?zhǔn)俏覈?guó)常用的傳統(tǒng)中藥，在歷版中國(guó)藥典中均有記載，其性味苦、寒，具有清熱利水、破血通經(jīng)之功效，主治小便不通、熱淋、血淋、砂石淋、目赤腫痛、經(jīng)閉等癥[1]，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[2-4]。瞿麥中主要活性成分有皂苷類、環(huán)肽類、黃酮類、多糖等[5-6]。其中，黃酮類化合物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，同時(shí)對(duì)心腦血管疾病有較好的療效。目前關(guān)于瞿麥中總黃酮的提取研究較少。基于此，作者以陜西眉縣的瞿麥為研究對(duì)象，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化瞿麥中總黃酮的提取條件，擬為進(jìn)一步開發(fā)利用陜產(chǎn)瞿麥資源以及新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

瞿麥，購自陜西省眉縣藥材總公司，經(jīng)陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院生藥教研室雷國(guó)蓮教授鑒定為石竹科植物瞿麥的帶花全草。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)食品藥品檢定研究院；無水乙醇，分析純，天津河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；亞硝酸鈉，分析純，鄭州天之昊化工產(chǎn)品有限公司；氫氧化鈉，分析純，上海永葉生物科技有限公司。

XH100B型微波萃取儀，北京詳鋯發(fā)展有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；FA1104型電子分析天平，天津鑫博得儀器有限公司；UV2400型紫外分光光度計(jì)，天津精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0109 g，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解，定容至刻度，搖勻后備用。

供試品溶液的配制：將瞿麥置于高速萬能粉碎機(jī)中粉碎，過40目篩。精密稱取瞿麥粉末7 g，置于錐形瓶中，按一定料液比加入乙醇，稱重，于一定功率下微波處理一定時(shí)間，再稱重，用乙醇補(bǔ)足。抽濾，棄藥渣，置于50 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻。

1.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和供試品在420～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度，發(fā)現(xiàn)在506 nm處有最大吸收，故以506 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL，分別置于25 mL 容量瓶中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置5 min；加入1 mL 10%硝酸鋁溶液,搖勻，放置6 min；加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，用80%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15 min。測(cè)定506 nm處吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 總黃酮得率的測(cè)定

精密量取供試品溶液，按1.2.3方法測(cè)定其吸光度，根據(jù)擬合的線性回歸方程計(jì)算陜產(chǎn)瞿麥中總黃銅含量，按下式計(jì)算總黃銅得率：

提取液中總黃酮含量(以蘆丁計(jì)，mg)=

1.3 提取工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

選擇料液比、提取時(shí)間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)為考察因素,研究各因素對(duì)瞿麥中總黃酮得率的影響。

1.3.2 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用 Design-Expert 8.0.6軟件,以料液比、提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，以總黃酮得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)，研究各影響因素之間的交互作用，擬合出多元二次回歸模型并進(jìn)行方差分析，最終確定瞿麥中總黃酮的最佳提取工藝。因素與水平見表1。

表1Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=11.592x-0.0426，相關(guān)系數(shù)R2=0.9966，蘆丁在0.02～0.06 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)總黃酮得率的影響

稱取瞿麥粉末7 g，在微波功率為600 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、提取溫度為50 ℃、提取時(shí)間為2 min的條件下，考察料液比對(duì)總黃銅得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids yield

由圖1可知，總黃酮得率隨溶劑用量的增加先升高后降低，在液料比為1∶20時(shí)總黃酮得率最高。這是因?yàn)?，在相同的微波加熱時(shí)間內(nèi)，體系的溶劑量大，溫度就比較低，溶質(zhì)在溶劑中的擴(kuò)散受到影響，提取率相應(yīng)較低。所以選擇料液比為1∶20較為適宜。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

在其它條件同2.2.1、料液比為1∶20的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on total flavonoids yield

由圖2可知，總黃酮得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，在提取時(shí)間為2 min時(shí)總黃酮得率最高。這可能是由于，微波產(chǎn)生的熱量長(zhǎng)時(shí)間作用于瞿麥，破壞了某些熱敏性黃酮類成分，導(dǎo)致總黃酮得率降低。所以選擇提取時(shí)間為2 min較為適宜。

2.2.3 微波功率對(duì)總黃酮得率的影響

在其它條件同2.2.1、料液比為1∶20的條件下，考察微波功率對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 微波功率對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on total flavonoids yield

由圖3可知，微波功率對(duì)總黃酮得率的影響較為平緩，總黃酮得率隨著微波功率的增大先升高后降低，在微波功率為600 W時(shí)總黃酮得率最高。這可能是由于，微波功率較大使瞿麥中某些黃酮類成分遭到破壞，導(dǎo)致總黃酮得率有所下降。所以選擇微波功率為600 W較為適宜。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響

在其它條件同2.2.1、料液比為1∶20的條件下,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of volume fraction of ethanol on total flavonoids yield

由圖4可知，總黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)總黃酮得率最高。所以選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%較為適宜。

2.3 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)

表2Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of Box-Behnken experiment

2.3.2 模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)(表3)

表3模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)

Tab.3 Variance analysis and significance test of model

注：**表示P<0.01，極顯著。

對(duì)模型中所有影響因素分析可知，A、B、AB、BC、A2、B2、C2對(duì)總黃酮得率影響極其顯著。一次項(xiàng)中各因素對(duì)總黃酮得率的影響顯著性大小依次為：料液比(A)>提取時(shí)間(B)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)。擬合后得到關(guān)于液料比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率(Y)的二次多項(xiàng)式回歸方程為：Y=1.12+0.051A+0.050B+8.000×10-3C+0.062AB+0.018AC+0.046BC-0.20A2-0.18B2-0.18C2。2.3.3 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖(圖5)

a.料液比和提取時(shí)間的交互作用 b.料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用 c.提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮得率與對(duì)應(yīng)的料液比(A)、提取時(shí)間(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)構(gòu)成一個(gè)三維空間的曲面圖，曲線越陡峭，等高線形狀越趨向橢圓且橢圓軸線與坐標(biāo)軸的曲線越大，則交互作用越顯著。

圖5各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖
Fig.5Responsesurfaceandcontouroftheinteractionbetweenthreefactors

從圖5a可以看出，曲線有較大的變化曲度，說明總黃酮得率受料液比和提取時(shí)間的影響均較大，隨著料液比的增大和提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮得率呈先上升后下降的趨勢(shì)。從等高線可以看出，等高線為橢圓形，因此，料液比和提取時(shí)間的交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。當(dāng)料液比為1∶20、提取時(shí)間為2 min時(shí)，總黃酮得率較高。

從圖5b可以看出，料液比對(duì)總黃酮得率影響的曲線較乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響的曲線更陡峭，因此，料液比對(duì)總黃酮得率的影響相對(duì)于乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)其影響更顯著，并隨著料液比的增大總黃酮得率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，總黃酮得率較高。

從圖5c可以看出，提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率影響的曲線較乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率影響的曲線更陡峭，因此，提取時(shí)間對(duì)陜產(chǎn)總黃酮得率的影響相對(duì)于乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)其影響更顯著，并隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)總黃酮得率呈先上升后下降的趨勢(shì)。從等高線可以看出，等高線為橢圓形，因此，可判斷料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。當(dāng)提取時(shí)間為2 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，總黃酮得率較高。

2.3.4 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，得到瞿麥中總黃酮的最佳提取工藝為：料液比1∶20.79、提取時(shí)間2.18 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60.53%，此時(shí)總黃酮得率最高，達(dá)到1.126%。為驗(yàn)證模型的有效性，考慮到實(shí)際情況,將最佳工藝條件修正為：料液比1∶20、提取時(shí)間2 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在此工藝條件下，重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn)，總黃酮得率為1.113%，與模型預(yù)測(cè)值基本吻合，說明模型能較好預(yù)測(cè)陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮得率，優(yōu)化工藝條件較可靠。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)曲面法對(duì)陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的微波輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳提取工藝為：料液比1∶20(g∶mL)、提取時(shí)間2 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在此條件下，總黃酮得率為1.113%，為進(jìn)一步開發(fā)和利用陜產(chǎn)瞿麥資源以及新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 王悅,肖旭萍,李秉超.桔皮中提取黃酮類化合物方法的比較研究[J].食品研究與開發(fā),2007,28(4):73-76.

[2] 肖衛(wèi)華,韓魯佳,楊增玲,等.響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪黃酮提取工藝的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,12(5):52-56.

[3] 許明淑,邢新會(huì),羅明芳,等.銀杏葉黃酮的酶法強(qiáng)化提取工藝條件研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2006,12(4):2-4.

[4] 郭建平,孫其榮.葛根總黃酮不同提取工藝的探討[J].中草藥,1995,26(10):523-552.

[5] 呂麗爽,潘道東，周慶，等.微波對(duì)提取蘆蒿葉片中黃酮類化合物的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000,29(2):97-98.

[6] 楊文鴿,謝果凰,顏偉華,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化海鰻的濕腌工藝[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2010,10(1):133-139.

OptimizationinMicrowave-AssistedExtractionProcessofTotalFlavonoidsfromShaanxiDianthussuperbusbyResponseSurfaceMethodology

ZHANG Shuang,HU Hong,ZHENG Li-juan,WANG Yan,CUI Jian-qiang

(SchoolofMedicine,ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xi′an712046,China)

TQ461 R284.2

A

1672-5425(2017)09-0041-05

陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院校級(jí)科研課題(SMXY201629)，2016年陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2955)，陜西省中醫(yī)管理局中醫(yī)藥科研課題(15ZY034)

2017-05-05

張爽(1979-)，女，河北唐山人，講師，研究方向：天然產(chǎn)物中活性成分的提取及活性，E-mail：574277317@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.09.008

張爽，胡宏，鄭麗娟,等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的微波輔助提取工藝[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(9)：41-45.