王佳佳，劉冬梅，王革嬌，李明順

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢430070)

睪丸酮叢毛單胞菌JL40中甲酸脫氫酶-O的銻抗性及銻氧化作用

王佳佳，劉冬梅，王革嬌，李明順*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢430070)

利用轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)從睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni) JL40中篩選出編碼具有銻抗性及銻氧化作用的甲酸脫氫酶-O的fdhO基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證fdhO基因的功能，在JL40中構(gòu)建了fdhO基因突變株JL40-△fdhO和互補(bǔ)株JL40-△fdhO-C，并進(jìn)行了銻抗性、生長及銻氧化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，fdhO基因突變株的銻抗性及銻氧化速率有所下降，互補(bǔ)株的銻抗性及銻氧化能力得到了一定的恢復(fù)。在大腸桿菌中異源表達(dá)fdhO基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，與空載對照菌相比，表達(dá)fdhO基因的大腸桿菌提高了銻氧化速率。報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)表明，fdhO基因的啟動(dòng)子受銻(Ⅲ)的誘導(dǎo)。綜上表明，fdhO基因在睪丸酮叢毛單胞菌JL40中具有明顯的銻氧化作用，但可能不是唯一的氧化酶；fdhO基因在細(xì)菌中的銻氧化功能將會(huì)為細(xì)菌銻抗性機(jī)制的進(jìn)一步探究提供參考。

睪丸酮叢毛單胞菌JL40；轉(zhuǎn)座子插入突變；銻抗性；銻氧化作用；甲酸脫氫酶-O

Abstract：We screened genefdhOcoding formate dehydrogenase-O related to antimony resistance and antimony oxidation by transposon insertion mutagenesis fromComamonastestosteroniJL40.In order to verify the function of genefdhO,we constructed mutant strain JL40-△fdhOand complementary strain JL40-△fdhO-C,and experimentally investigated the antimony resistance,growth，and antimony oxidation.The results showed that the antimony resistance and antimony oxidation rate of mutant strain decreased,and those of complementary strain recovered in a certain degree.Heterologous expression assay inEscherichiacolishowed that,Escherichiacoliexpressing genefdhOcould increase antimony oxidation rate compared with the non-loaded control strain.Moreover,the results of the reporter gene fusion experiment indicated that the promoter of genefdhOwas induced by Sb(Ⅲ).Comprehensive analysis showed that genefdhOactually had the function of antimony oxidation,but it was not the only oxidase inComamonastestosteroniJL40.The antimony oxidation function of genefdhOin bacteria will provide reference for further explore of bacterial antimony resistant mechanism.

Keywords：ComamonastestosteroniJL40;transposon insertion mutagenesis;antimony resistance;antimony oxidation;formate dehydrogenase-O

銻與砷同屬第五周期第五主族，銻位于砷的下方。銻在自然界中廣泛分布于土壤、湖泊和海洋等地球環(huán)境中，很多金屬礦床中都存在含銻礦物。當(dāng)從礦物形式釋放時(shí)，銻主要以亞銻酸鹽[Sb(Ⅲ)]和銻酸鹽[Sb(Ⅴ)]形式存在，且Sb(Ⅲ)毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Sb(Ⅴ)[1]。目前，我國的銻礦儲(chǔ)量位居世界第一，銻產(chǎn)量占世界總量的79.6%[2]。由于銻礦開采，我國很多地區(qū)受到嚴(yán)重銻污染，特別是銻礦相對集中的湖南、貴州、廣西等省[3]。銻及其化合物進(jìn)入人體后，會(huì)引起心臟、肝臟、腎臟和呼吸道等組織的損傷，最終致突變、畸形以及癌變[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，湖南錫礦和銻礦區(qū)人口中，0.03%的工人患上塵肺病[5]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將Sb(Ⅲ)列為致癌物質(zhì)。

一些微生物可以在較高銻濃度下生長，有些細(xì)菌甚至可以把Sb(Ⅲ)氧化成Sb(Ⅴ)，有利于銻污染的修復(fù)[6]。目前，國內(nèi)外已報(bào)道了很多Sb(Ⅲ)氧化菌，主要包括Agrobacterium、Acinetobacter、Comamonas、Halomonas、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Variovorax、Brevundimonas和Ensifer[1]。在Agrobacteriumtumefaciens5A中發(fā)現(xiàn)的As(Ⅲ)氧化酶AioA可以氧化Sb(Ⅲ)[7]，A.tumefaciensGW4中發(fā)現(xiàn)了新型Sb(Ⅲ)氧化酶AnoA[8]，但是敲除以上2種酶并不能完全喪失Sb(Ⅲ)氧化活性，因此，推測細(xì)菌中可能還有其它的Sb(Ⅲ)氧化酶。

甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase，F(xiàn)DH)廣泛存在于真核生物和原核生物的甲基營養(yǎng)細(xì)胞中。它在細(xì)胞中可以催化甲酸氧化生成CO2和H+，在生物體內(nèi)的氧化還原、電子傳遞及能量利用中擔(dān)任著重要角色，在大腸桿菌中有著較為詳盡的研究[9]。根據(jù)供氧狀態(tài)下的蛋白表達(dá)，細(xì)菌中FDH可分為3類：第一類是在無氧、有硝酸鹽條件下大腸桿菌中大量表達(dá)的甲酸脫氫酶-N(FdhN)，具有甲酸氧化和硝酸鹽還原的功能；第二類是在有氧或硝酸鹽呼吸條件下大量表達(dá)的甲酸脫氫酶-O(FdhO)；第三類是在無氧、無硝酸鹽的發(fā)酵條件下表達(dá)的甲酸脫氫酶-H(FdhH)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行甲酸氧化。第一類和第二類是同工酶，具有很高的相似性，屬于含鉬嘌呤-氧化還原酶家族，具有各自的活性位點(diǎn)[10-12]。分別在有硝酸鹽和氧氣的條件下誘導(dǎo)表達(dá)，具有能量儲(chǔ)存的功能。目前，相對于FdhN，F(xiàn)dhO的相關(guān)信息較少。FdhO是大部分細(xì)菌中普遍存在的脫氫酶，在細(xì)菌的有氧呼吸中擔(dān)任甲酸氧化和電子傳遞功能。

睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)JL40是一株銻抗性及氧化菌株，能夠?qū)⒍拘愿叩腟b(Ⅲ)氧化成毒性較低的Sb(Ⅴ)[13]。為了闡明JL40的氧化機(jī)制，首先利用轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)初步篩選出潛在的銻抗性及氧化相關(guān)基因fdhO，再通過敲除株和互補(bǔ)株進(jìn)行Sb(Ⅲ)的氧化功能驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

睪丸酮叢毛單胞菌JL40，從湖南省冷水江市錫礦山銻礦中分離得到；自殺性質(zhì)粒pCM184-Cm、轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒pRL27-Cm、互補(bǔ)質(zhì)粒pCPP30、感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α、E.coliS17-1，自行保藏。

分子克隆所用的酶類(聚合酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶)、dNTPs、DNA marker，TaKaRa公司；DNase Ⅰ、RNAase，F(xiàn)ermentas公司；大腸桿菌質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，Axygen公司；胰蛋白胨、酵母抽提物，英國OXOID公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；DNA測序由武漢擎科生物技術(shù)公司完成。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母抽提物5 g，氯化鈉10 g，pH值7.0，用雙蒸水定容至1 000 mL，分裝，121 °C高壓蒸汽滅菌20 min。

CDM培養(yǎng)基：溶液A：MgSO4·7H2O 20 g、NH4Cl 10 g、Na2SO410 g、K2HPO4·3H2O 0.16 g、CaCl2·2H2O 0.67 g、C3H5NaO350 g、雙蒸水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。上述試劑需依次完全溶解加入，切記不能同時(shí)加入，否則易出現(xiàn)絮狀沉淀。溶液B：FeSO4·7H2O 1.33 g、雙蒸水1 000 mL，0.22 μm濾膜過濾滅菌，避光保存。溶液C：NaHCO379.8 g、雙蒸水1 000 mL，0.22 μm濾膜過濾滅菌。配制CDM培養(yǎng)基時(shí)，向89 mL高溫滅菌的雙蒸水中依次加入10 mL溶液A、25 μL溶液B和1 mL溶液C，調(diào)節(jié)pH值約為7.2。

1.2 引物與序列

本實(shí)驗(yàn)所用引物及其主要特征見表1。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體庫

以Sb(Ⅲ)抗性菌株JL40為受體菌，以攜帶Tn5轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒pRL27-Cm的E.coliS17-1為供體菌，通過雙親本雜交的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體菌細(xì)胞內(nèi)，使得轉(zhuǎn)座子片段隨機(jī)插入到受體菌的DNA上。

1.3.2 基因的敲除與互補(bǔ)

敲除載體的構(gòu)建：用自殺性質(zhì)粒pCM184-Cm為載體進(jìn)行敲除載體的構(gòu)建，該載體有2個(gè)多克隆位點(diǎn)，分別在氯霉素抗性基因的上游和下游。利用基因上游序列的引物和下游序列的引物合成上下游基因的片段，連接到pCM184-Cm載體的2個(gè)多克隆位點(diǎn)上，得到等位基因交換載體；將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliS17-1中于37 ℃培養(yǎng)過夜至長出單菌落；對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR、酶切及測序，確保載體構(gòu)建正確。

表1本研究引物及其主要特征

Tab.1 Major characteristics of primers in this study

互補(bǔ)載體的構(gòu)建：用互補(bǔ)質(zhì)粒pCPP30作為載體進(jìn)行互補(bǔ)載體的構(gòu)建，該載體含有四環(huán)素抗性基因和lacZ篩選標(biāo)記。首先，通過PCR擴(kuò)增完整的基因編碼區(qū)及其上游的啟動(dòng)子區(qū)，連接到pCPP30載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞；再將構(gòu)建好的互補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliS17-1感受態(tài)細(xì)胞中，與菌株JL40-△fdhO進(jìn)行雙親本雜交，用含有四環(huán)素的抗性平板進(jìn)行初篩；最后通過PCR及酶切驗(yàn)證互補(bǔ)載體構(gòu)建正確。

1.3.3 銻抗性實(shí)驗(yàn)

細(xì)菌在CDM培養(yǎng)基中傳代2次，待種子液的OD600約為0.4時(shí)將菌液用生理鹽水稀釋至10-1、10-3、10-5；取3 μL不同濃度稀釋菌液接種于Sb(Ⅲ)終濃度(mmol·L-1)分別為0、1、2、4、6、8、10、12的CDM固體平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，定期觀察生長狀況。

1.3.4 生長和氧化實(shí)驗(yàn)

細(xì)菌在CDM培養(yǎng)基中傳代2次，待種子液的OD600約為0.4時(shí)，按1%的接種量接種于100 mL含有1 mmol·L-1Sb(Ⅲ)的CDM培養(yǎng)基中，定時(shí)取樣用分光光度計(jì)測定OD600，用高效液相色譜與原子熒光光度聯(lián)用儀定量檢測Sb(Ⅲ)氧化情況。

1.3.5fdhO在E.coliS17-1中的Sb(Ⅲ)氧化實(shí)驗(yàn)

將構(gòu)建好的互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)到E.coliS17-1中，以轉(zhuǎn)入空載pCPP30的E.coliS17-1作為對照，將E.coliS17-1在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期后收集菌株，生理鹽水洗3遍后將菌體加到含有0.01%酵母粉的CDM培養(yǎng)基中，調(diào)OD600約為0.4，添加10 μmol·L-1Sb(Ⅲ)，定期取樣測定OD600，檢測生長情況，采用靜息細(xì)胞法測Sb(Ⅲ)的氧化速率。

1.3.6 報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)

為檢測fdhO的啟動(dòng)子是否受Sb(Ⅲ)誘導(dǎo)，利用pLSP載體構(gòu)建lacZ融合表達(dá)重組菌株JL40(fdhO::lacZ)，檢測1 mmol·L-1Sb(Ⅲ)誘導(dǎo)時(shí)的β-半乳糖苷酶的活性[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)座子插入突變相關(guān)基因分析

在睪丸酮叢毛單胞菌JL40中成功構(gòu)建了突變體庫，共篩選了8 000株轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過多次篩選最后得到4株在1 mmol·L-1Sb(Ⅲ)條件下生長明顯受到抑制的突變株。其中，一株突變株在不加Sb(Ⅲ)的條件下生長受到嚴(yán)重抑制，兩株突變株所插入的基因在JL40中均為多拷貝的，給敲除實(shí)驗(yàn)造成一定困難；另外一株突變株X42插入到fdhO的γ亞基，不僅測定了它和其野生株的生長曲線和氧化曲線，還進(jìn)一步完成了該突變菌株的互補(bǔ)株。1 mmol·L-1Sb(Ⅲ)中，突變株X42的銻抗性及氧化能力均下降，互補(bǔ)株得到部分恢復(fù)。表明fdhO基因可能介導(dǎo)了菌株JL40的Sb(Ⅲ)抗性表型，而且還可能是Sb(Ⅲ)氧化表型的相關(guān)功能基因。

2.2 fdhO基因的敲除與互補(bǔ)

以JL40為實(shí)驗(yàn)菌株，采用Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變方法建立突變體庫，篩選銻抗性降低的突變株，再通過反向PCR獲得可能與Sb(Ⅲ)抗性及氧化作用相關(guān)的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)dhOγ亞基基因內(nèi)部插入突變株在添加Sb(Ⅲ)時(shí)，生長受到抑制，氧化速率降低。為了進(jìn)一步確認(rèn)fdhO基因的功能，通過雙交換的方法構(gòu)建了fdhO基因突變株JL40-△fdhO和互補(bǔ)株JL40-△fdhO-C，并分別以野生株JL40、突變株JL40-△fdhO及互補(bǔ)株JL40-△fdhO-C基因組DNA為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證。以fdhO基因內(nèi)部引物為引物的驗(yàn)證結(jié)果如圖1a所示，構(gòu)建敲除載體時(shí)以上游臂的上游引物與下游臂的下游引物為引物的驗(yàn)證結(jié)果如圖1b所示。

2.3 野生株、突變株、互補(bǔ)株的銻抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)

a.以fdhO基因內(nèi)部引物為引物 b.以上游臂的上游引物與下游臂的下游引物為引物 M.DNA marker 1，4.野生株 2，5.突變株 3，6.互補(bǔ)株

圖2 野生株、突變株和互補(bǔ)株對Sb(Ⅲ)的抗性比較

從圖2可以看出，突變株對Sb(Ⅲ)的MIC為6 mmol·L-1，而野生株和互補(bǔ)株對Sb(Ⅲ)的MIC均為10 mmol·L-1(圖略)；在菌液稀釋度為10-5、Sb(Ⅲ)終濃度為4 mmol·L-1時(shí)，突變株的銻抗性受到一定影響，較野生株弱，而互補(bǔ)株的銻抗性得到了恢復(fù)。因此，可以推斷JL40中的fdhO基因可能與銻抗性相關(guān)。

2.4 野生株、突變株和互補(bǔ)株的生長和氧化實(shí)驗(yàn)(圖3)

圖3 野生株、突變株和互補(bǔ)株的生長曲線(a)及氧化曲線(b)

從圖3a可以看出，在Sb(Ⅲ)濃度為1 mmol·L-1時(shí)，突變株的最大OD600略低于野生株和互補(bǔ)株，但是48 h后與野生株和互補(bǔ)株的生長趨勢一致。從圖3b可以看出，突變株的氧化速率較野生株低，互補(bǔ)株的氧化速率與野生株基本一致；112 h時(shí)，野生株、突變株和互補(bǔ)株的Sb(Ⅴ)濃度分別為378 μmol·L-1、324 μmol·L-1、400 μmol·L-1。突變株氧化速率的下降表明fdhO基因可能是與Sb(Ⅲ)氧化相關(guān)的基因。

2.5 fdhO基因在E.coli S17-1中的Sb(Ⅲ)氧化(圖4)

圖4 S17-1(pCPP30)和S17-1(pCPP30-fdhO)的生長曲線(a)及氧化曲線(b)Fig.4 The growth curves(a) and oxidation curves(b) of strains S17-1(pCPP30) and S17-1(pCPP30-fdhO)

從圖4可以看出，在含10 μmol·L-1Sb(Ⅲ)的培養(yǎng)基中，S17-1(pCPP30)和S17-1(pCPP30-fdhO)的OD600大約在0.4～0.5之間，S17-1 (pCPP30-fdhO)氧化Sb(Ⅲ)的速率高于S17-1(pCPP30)。

2.6 Sb(Ⅲ)對fdhO基因的誘導(dǎo)表達(dá)

為了檢測fdhO基因在JL40中是否受Sb(Ⅲ)的誘導(dǎo)表達(dá)，將fdhO基因的啟動(dòng)子連到pLSP載體上，轉(zhuǎn)到野生株JL40中構(gòu)建lacZ融合表達(dá)菌株JL40 (fdhO::lacZ)，測定1 mmol·L-1Sb(Ⅲ)誘導(dǎo)2 h時(shí)的β-半乳糖苷酶的活性，結(jié)果如圖5所示。

圖5 fdhO基因啟動(dòng)子受1 mmol·L-1 Sb(Ⅲ)誘導(dǎo)結(jié)果

從圖5可以看出，lacZ融合表達(dá)菌株JL40 (fdhO::lacZ )在1 mmol·L-1Sb(Ⅲ)誘導(dǎo)2 h的β-半乳糖苷酶酶活明顯高于不加Sb(Ⅲ)時(shí)的活性，表明fdhO基因啟動(dòng)子在2 h時(shí)受Sb(Ⅲ)誘導(dǎo)，且差異非常顯著。

3 結(jié)論

為了研究銻氧化細(xì)菌的氧化機(jī)制和氧化酶，利用睪丸酮叢毛單胞菌JL40構(gòu)建了突變體庫，篩選到了Sb(Ⅲ)抗性和氧化性相關(guān)的基因fdhO，并在該菌株中對fdhO基因進(jìn)行了雙交換敲除。突變株JL40-△fdhO的Sb(Ⅲ)抗性MIC與野生株相比有所下降，在無銻或低銻濃度環(huán)境下，生長狀況一致但是氧化速率有所下降，互補(bǔ)株的Sb(Ⅲ)抗性及氧化表型基本得到恢復(fù)，表明fdhO與Sb(Ⅲ)代謝機(jī)制密切相關(guān)。fdhO基因啟動(dòng)子在2 h時(shí)受1 mmol·L-1Sb(Ⅲ)誘導(dǎo)，且差異顯著。在細(xì)胞濃度一致的前提下，導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌菌株對Sb(Ⅲ)的氧化速率高于對照菌株。表明fdhO基因在睪丸酮叢毛單胞菌JL40中Sb(Ⅲ)的抗性和氧化方面具有重要的功能，其相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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AntimonyResistanceandAntimonyOxidationofFormateDehydrogenase-OinComamonastestosteroniJL40

WANG Jia-jia,LIU Dong-mei,WANG Ge-jiao,LI Ming-shun*

(CollegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

Q78

A

1672-5425(2017)09-0046-05

2017-04-20

王佳佳(1988-)，女，河南許昌人，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物學(xué)，E-mail：1534835559@qq.com；通訊作者：李明順，副教授，E-mail：mshli7125@mail.hzau.edu.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.09.009

王佳佳，劉冬梅，王革嬌，等.睪丸酮叢毛單胞菌JL40中甲酸脫氫酶-O的銻抗性及銻氧化作用[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(9)：46-50，60.