, , ,,

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

鏈格孢侵染對甜瓜病程相關(guān)蛋白活性及基因表達(dá)的影響

張培嶺,黃偉,馬玲,馮作山,白羽嘉*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊830052)

以抗病能力強(qiáng)的伽師瓜和抗病能力較弱的86-1甜瓜作為實(shí)驗(yàn)材料,研究甜瓜果實(shí)應(yīng)答鏈格孢侵染過程中對幾丁質(zhì)酶(CHT)、β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活力變化的影響及基因表達(dá)規(guī)律。伽師瓜和86-1甜瓜接種濃度為1×106個/mLA.alternata孢子懸浮液20 μL,置于6～8 ℃冷庫貯藏,測定病斑大小,幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活力及基因相對表達(dá)量。結(jié)果表明:損傷接種A.alternata后,伽師瓜和86-1甜瓜均在15 d發(fā)病,貯藏過程中伽師瓜果實(shí)的發(fā)病率及病斑大小均低于86-1甜瓜;甜瓜應(yīng)答侵染過程中,幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活力呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,分別于21 d,18 d達(dá)到酶活高峰,且接種伽師瓜酶活力顯著高于86-1甜瓜(p<0.05),伽師瓜通過增強(qiáng)病程相關(guān)酶活力來抵御鏈格孢的侵染;伽師瓜CHT1、CHT2、GLU基因表達(dá)量顯著高于86-1甜瓜,分別在貯藏18、18、15 d表達(dá)量最大;貯藏0～21 d病程相關(guān)蛋白活力及基因相對表達(dá)量與病斑直徑呈正相關(guān),說明病程相關(guān)蛋白在植物抵御病原微生物侵染早期與中期中起到了關(guān)鍵作用,并且在侵染中期作用顯著。

甜瓜,鏈格孢,病程相關(guān)蛋白,基因表達(dá)

Abstract:Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon species with the characteristics of disease resistance were used as experiment material. This study was aimed to the activities of CHT,GLU and the gene expression rules for CHT and GLU in muskmelon fruits inoculated withA.alternatawere analyzed. Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon were inoculated with 20 μLA.alternataspore suspension,inoculation with 20 μL of sterile water as a blank control,the materials were transferred to cold storage at 6～8 ℃,determination of lesion size,the activities of CHT,GLU and the gene expression ofCHTandGLU. The results showed that the incidence and the lesion size of Jiashi muskmelon were lower than that of 86-1 muskmelon during the inoculated withA.alternataafter 15 days. During the infection period,the activities of CHT,GLU was significantly increased with a trend from rise to decline. The peak of activities for CHT,GLU revealed of 21 d,18 d. The activities of CHT,GLU in Jiashi melon significantly higher than 86-1 muskmelon Jiashi muskmelon to resist the infection ofA.alternariaby enhancing the activity of protease and maintaining the enzyme activity at a higher level. The relative expressions forCHT1,CHT2,GLUwere higher in Jiashi muskmelon than 86-1 muskmelon during the whole infection period. The expression levels ofCHT1,CHT2 andGLUwere significantly higher than 86-1 melon,and the expression level ofCHT1,CHT2 andGLUwas the highest in storage at 18,18 and 15 days. The relative expression of protein-related protein and gene expression were positively correlated with lesion diameter for 0～21 d. These results suggest that the pathogenesis related proteins play a key role in the early and middle stage of plant pathogen resistance.

Keywords:muskmelon;Alternariaalternata;pathogenesis-related proteins;gene expression

甜瓜在田間種植、采后運(yùn)輸過程中始終遭受到病原微生物的持續(xù)侵染,因此甜瓜內(nèi)源性抵御病原菌侵染的能力是關(guān)鍵。果實(shí)采后病程相關(guān)蛋白的研究可從抗病防衛(wèi)基因調(diào)控及其所編碼的蛋白生物活性等方面揭示果實(shí)采后抗病性的機(jī)制[1]。病程相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)主要通過病原侵染、生理因素、化學(xué)誘導(dǎo)劑、物理因素產(chǎn)生[2],病程相關(guān)蛋白可以直接對病原菌起到抵御的作用。研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)產(chǎn)生SAR的植物體中沒有受到侵染的部位幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶活性也顯著升高[3-4]。目前,果實(shí)采后病程相關(guān)蛋白的研究主要集中于蘋果、芒果、番茄、葡萄[5-8]等,對伽師瓜病程相關(guān)蛋白的研究報道較少。

本實(shí)驗(yàn)將接種鏈格孢后的伽師瓜和86-1甜瓜置于低溫條件貯藏(6～8 ℃),研究鏈格孢侵染對甜瓜果實(shí)幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶活力及其基因相對表達(dá)的影響。了解甜瓜采后抗病害的內(nèi)在機(jī)制,為甜瓜采后貯運(yùn)保鮮提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

伽師瓜、86-1甜瓜 采自新疆喀什地區(qū)伽師縣,選取果實(shí)大小均勻、成熟度一致,無病蟲害,無機(jī)械損傷的果實(shí);鏈格孢(Alternariaalternata) 分離自‘卡拉克塞’伽師瓜和86-1甜瓜自然發(fā)病的果實(shí),PDA保存待用;焦碳酸二乙酯(DEPC) BBilfe Sciences公司;瓊脂糖、50×TAE 生工生物工程(上海);Marke.r DL2000 北京天根生化科技有限公司;上樣緩沖液、植物cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;MM-2型微量振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠;Nefuqe 15R高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司;XH-C型漩渦混合器 金壇市良友儀器有限公司;K5500核酸蛋白定量儀 北京凱奧科技發(fā)展有限公司;DYY-6C型電泳儀、DYCZ-21電泳槽 北京市六一儀器廠;Tanon2500凝膠成像系統(tǒng) 上海天能。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液的配制 收集25 ℃培養(yǎng)7 d鏈格孢孢子,用含有0.05% Tween-20的無菌水配制孢子懸浮液,使懸浮液中A.alternata孢子的濃度為1×106個/mL[9]。

1.2.2 損傷接種鏈格孢孢子懸浮液 伽師瓜、86-1甜瓜表面用30%雙氧水清洗消毒晾干。接種部位用75%酒精擦洗進(jìn)行消毒,在甜瓜果實(shí)赤道等距離刺孔6個,深度3 mm,接種20 μL的孢子懸浮液。接種完成后,于6～8 ℃、相對濕度85%～90%的冷庫貯藏。對照組甜瓜接種等量無菌水。

1.2.3 取樣方法 分別于處理后0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 d 取病斑周圍3～10 mm處果肉組織,液氮速凍,-80 ℃保存。

1.2.4 甜瓜果實(shí)病斑直徑的測量 利用十字交叉法測定果實(shí)病斑直徑[10]。

1.2.5 甜瓜幾丁質(zhì)酶(CHT)活力的測定 參照曹建康《果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》方法[11]。

1.2.6 甜瓜β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活力的測定 參照曹建康《果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》方法[11]。

1.2.7 甜瓜RNA提取和檢測 采用TRIZOL法提取不同時間點(diǎn)甜瓜總RNA,利用RNase-free DNase試劑盒去除DNA后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的RNA完整性,并利用核酸蛋白定量儀對所提取的RNA的OD260/280、OD260/230和濃度進(jìn)行測定,然后將提取的RNA分裝后存放于-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.2.8 RNA反轉(zhuǎn)錄 采用TransScript One-Step gDNA Removal And cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明方法將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.9 目的基因和內(nèi)參基因的克隆 以兩個不同品種甜瓜的總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,根據(jù)已報道伽師瓜及86-1甜瓜的CDS區(qū)序列,利用分子生物學(xué)軟件Oligo 6.0進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)(表 1),并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物片段,連接到pMD18-T載體,連接反應(yīng)體系10.0 μL,包括 Solution I 4 μL,PCR 產(chǎn)物 5 μL,pMD18-T 0.2 μL,H2O 0.8 μL,16 ℃連接過夜。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,倒置培養(yǎng)過夜。挑取陽性菌落,回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

表1 GLU、CHT和內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增特異性引物Table 1 PCR amplification primers of GLU，CHT and reference gene

1.2.10 RT-PCR的測定 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行CHT1、CHT2、GLU和內(nèi)參基因GAPDH的實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為(20 μL體系)SYBR Select Master Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,40個循環(huán),60 ℃ 1 min。每個樣品重復(fù)三次。反應(yīng)結(jié)束后以溶解曲線來判定RT-qPCR的特異性;將得到的每個樣品的CT值使用2-ΔΔCT[12]法計(jì)算甜瓜不同時間內(nèi)CHT1、CHT2和GLU的相對表達(dá)量。

1.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;采用Origin8.0進(jìn)行圖表繪制;采用SPSS 20. 0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 伽師瓜和86-1甜瓜接種鏈格孢后病斑直徑的變化

如圖1所示,伽師瓜和86-1甜瓜接種A.alternata后,貯藏15 d開始病斑直徑呈不斷擴(kuò)大的趨勢,貯藏第21 d起,伽師瓜與86-1甜瓜相比,病斑擴(kuò)展相對較慢,差異顯著(p<0.05)。接種鏈格孢的伽師瓜和86-1甜瓜均在貯藏第15 d出現(xiàn)病斑,貯藏第21 d開始,86-1甜瓜病斑擴(kuò)散速度加快,貯藏第21 d,86-1甜瓜病斑直徑較伽師瓜果實(shí)高出46.15%(p<0.05);在貯藏第27 d和30 d時伽師瓜病斑直徑分別低于86-1甜瓜0.61 cm和0.37 cm。

圖1 鏈格孢侵染對甜瓜果實(shí)病斑直徑的影響Fig.1 Effects of A.alternata infection on lesion diameter of muskmelon fruit

2.2 伽師瓜和86-1甜瓜接種鏈格孢后幾丁質(zhì)酶活性的變化

如圖2所示,鏈格孢侵染后甜瓜果實(shí)中幾丁質(zhì)酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,接種后伽師瓜果實(shí)幾丁質(zhì)酶活性在6～12 d迅速升高，而86-1甜瓜果實(shí)在9～12 d酶活性上升快速,較伽師瓜果實(shí)有所推遲,說明伽師瓜在抵御病原微生物侵染的過程中能更早啟動抗病酶,酶活性高于86-1甜瓜。在接種第21 d酶活性達(dá)到高峰,接種后伽師瓜酶活較86-1甜瓜高出6.50%(p<0.05),之后酶活性迅速下降并趨于穩(wěn)定,貯藏結(jié)束時(30 d)伽師瓜酶活性為101.06 U，比86-1甜瓜高11.83%(p<0.05)。

圖2 鏈格孢侵染對伽師瓜和86-1甜瓜幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.2 Effects of A.alternata infection on CHT activity of Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon

2.3 伽師瓜和86-1甜瓜接種鏈格孢后β-1,3-葡聚糖酶活性的變化

如圖3所示,低溫貯藏過程甜瓜果實(shí)GLU活性變化趨勢一致,呈先上升后下降的趨勢。貯藏第18 d達(dá)到酶活高峰,接種鏈格孢伽師瓜果實(shí)GLU活性為1334.96 U,較接種無菌水組GLU活性高12.23%(p<0.05),鏈格孢侵染可顯著增強(qiáng)伽師瓜果實(shí)抗病酶活性;86-1甜瓜果實(shí)在酶活高峰GLU活性為1275.64 U,之后酶活力迅速下降。貯藏末期,接種鏈格孢伽師瓜果實(shí)GLU活性為720.72 U,較86-1甜瓜高出19.55%(p<0.05),整個貯藏過程中伽師瓜GLU活性顯著高于86-1甜瓜。

圖3 鏈格孢侵染對伽師瓜和86-1甜瓜β-1,3-葡聚糖酶活性的影響Fig.3 Effects of A.alternata infection on GLU activity of Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon

2.4 RNA完整性和質(zhì)量檢測

RNA提取凝膠電泳圖如圖4所示。結(jié)果表明,兩個品種的接種組和對照組總RNA凝膠圖條帶清晰,完整,且28S條帶的亮度約為18S的2倍。同時,對所提取的總RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)OD260/280均在2.0以上,OD260/280值均大于2.0,說明所提取RNA質(zhì)量較好,可用于下一步反轉(zhuǎn)錄。

圖4 伽師瓜和86-1甜瓜的RNA提取結(jié)果Fig.4 Results of RNA extraction of Jiashi melon and 86-1 melon

2.5 目的基因和內(nèi)參基因檢測及溶解曲線分析

由圖5可知,PCR產(chǎn)物長度均為100 bp左右,符合引物設(shè)計(jì)長度。將PCR產(chǎn)物送至上海生工(工程)有限公司進(jìn)行測序。

圖5 目的基因和內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)凝膠電泳結(jié)果Fig.5 Results of PCR amplification reaction gel electrophoresis of CHT，GLU and GAPDH

2.6 接種鏈格孢后伽師瓜和86-1甜瓜幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶基因表達(dá)量的變化

2.6.1 接種鏈格孢后伽師瓜和86-1甜瓜的CHT1基因表達(dá)量的變化 與對照組相比,接種鏈格孢后伽師瓜CHT1基因相對表達(dá)量在整個貯藏期內(nèi)顯著增加,而86-1甜瓜在接種后12 d開始與對照組存在顯著差異(圖6)。在接菌3 d后,伽師瓜CHT1基因相對表達(dá)量開始升高,且在整個貯藏期內(nèi)一直處于相對較高的水平,伽師瓜、86-1甜瓜CHT1基因相對表達(dá)量均在貯藏第18 d達(dá)到最大值,之后表達(dá)逐漸下調(diào)。貯藏第9～21 d伽師瓜CHT1基因相對表達(dá)量約為86-1甜瓜CHT1基因相對表達(dá)量的兩倍。

圖6 接種鏈格孢后伽師瓜和86-1甜瓜CHT1基因相對表達(dá)量的變化Fig.6 Changes of CHT1 gene relative expression after inoculation of Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon with Alternaria alternata

2.6.2 接種鏈格孢后伽師瓜和86-1甜瓜的CHT2基因表達(dá)量的變化 與對照相比,接種鏈格孢后伽師瓜和86-1甜瓜的CHT2基因相對表達(dá)量顯著增加,且伽師瓜顯著高于86-1甜瓜(圖7)。接種后,伽師瓜的CHT2基因的相對表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢。伽師瓜CHT2基因相對表達(dá)量在整個貯藏期內(nèi)一直保持較高水平,接種后第6 d,基因相對表達(dá)量出現(xiàn)大幅上升,在接種后第18 d達(dá)到峰值,后出現(xiàn)緩慢下降;而86-1甜瓜的CHT2基因相對表達(dá)量呈先上升后下降再上升的波動上升趨勢,在接種第18 d,CHT2基因相對表達(dá)量達(dá)到最大值。在整個貯藏過程中伽師瓜CHT2相對表達(dá)量增幅均顯著高于86-1甜瓜。在接種第18 d,伽師瓜CHT2相對表達(dá)量是86-1甜瓜的2.28倍(p<0.01)。

表2 甜瓜病斑直徑與病程相關(guān)蛋白酶活性和基因相對表達(dá)量的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of disease resistance index of melon with PRs activity and relative gene expression

注:*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01)。

圖7 接種鏈格孢后伽師瓜和86-1甜瓜CHT2基因相對表達(dá)量的變化Fig.7 Changes of CHT2 gene relative expression after inoculation of Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon Alternaria alternata

2.6.3 接種鏈格孢后伽師瓜和86-1甜瓜的GLU基因表達(dá)量的變化GLU基因相對表達(dá)量在整個貯藏過程中呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(圖8),與對照組相比接種鏈格孢的甜瓜GLU基因相對表達(dá)量變化顯著,從貯藏第6 d開始接種組顯著高于對照組。貯藏過程中伽師瓜GLU相對表達(dá)量從第9 d開始始終高于86-1甜瓜;貯藏第6 d時86-1甜瓜GLU基因相對表達(dá)量增加顯著，是同時期伽師瓜的1.44倍(p<0.01),第9 d伽師瓜GLU基因相對表達(dá)量顯著升高,到貯藏第15 d達(dá)到最大值，是86-1甜瓜2.74倍(p<0.01)。

圖8 接種鏈格孢后伽師瓜和86-1甜瓜GLU基因相對表達(dá)量的變化Fig.8 Changes of GLU gene relative expression after inoculation of Jiashi muskmelon and 86-1 muskmelon Alternaria alternata

2.7 甜瓜病斑直徑與病程相關(guān)蛋白活力及其基因相對表達(dá)量的相關(guān)性分析

采用SPSS 對伽師瓜病斑直徑與病程相關(guān)蛋白及其基因相對表達(dá)量的相關(guān)性分析(表2)。

由表2可知,伽師瓜果實(shí)在接種貯藏0～21 d幾丁質(zhì)酶活力與病斑直徑呈顯著正相關(guān),與β-1,3-葡聚糖酶、CHT1、CHT2、GLU基因相對表達(dá)量呈正相關(guān),在貯藏24～30 d,幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶,CHT1、CHT2基因相對表達(dá)量與伽師瓜病斑直徑呈負(fù)相關(guān)。86-1甜瓜貯藏0～21 d幾丁質(zhì)酶活力、β-1,3-葡聚糖酶活性與病斑直徑呈顯著正相關(guān),CHT1、CHT2、GLU基因相對表達(dá)量呈正相關(guān),貯藏24～30 d幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶,CHT1、CHT2、GLU基因相對表達(dá)量病斑呈負(fù)相關(guān)。說明在鏈格孢侵染甜瓜果實(shí)與果實(shí)互作過程中病程相關(guān)蛋白在早期及中期發(fā)揮了積極的作用,一旦病斑開始擴(kuò)展,病程相關(guān)蛋白抗病作用將顯著降低,貯藏后期,酶活性及基因相對表達(dá)量下降,原因可能是受甜瓜果實(shí)作為病原微生物的營養(yǎng)物質(zhì)及宿主,無法抵抗病原菌的侵染,抗病能力下降,果實(shí)腐爛嚴(yán)重。

3 討論

植物受到病原微生物侵染時體內(nèi)乙烯大量合成,被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上His激酶類受體家族I型和II型識別,激活植物防御基因和病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá),使植物建立抗病性反應(yīng)[13]。有報道顯示β-1,3-葡聚糖酶抗病作用不僅表現(xiàn)在破壞病原微生物的細(xì)胞壁阻止其生長,同時其水解產(chǎn)物還可以激發(fā)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性,使植物有效低于外界侵染[14]。幾丁質(zhì)酶作為植物抗病研究最廣泛的酶之一,在正常環(huán)境中幾丁質(zhì)酶活性及其表達(dá)量較低,當(dāng)外界環(huán)境脅迫作用,幾丁質(zhì)酶含量迅速升高,來誘導(dǎo)植物啟動防御體系[15]。如香蕉受尖孢鐮刀菌侵染,幾丁質(zhì)酶活性和幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)水平顯著提高[16]。SA、BTH、UV等誘導(dǎo)也可誘導(dǎo)植物幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶活性增強(qiáng)[17-19]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),鏈格孢侵染脅迫使甜瓜果實(shí)幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶活性迅速升高,且維持在較高水平來抵御微生物侵染同時利用克隆得到的CHT1、CHT2、GLU基因研究甜瓜受鏈格孢侵染后病程相關(guān)蛋白表達(dá)量變化發(fā)現(xiàn),鏈格孢能夠顯著誘導(dǎo)伽師瓜和86-1甜瓜的幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶基因相對表達(dá)量升高,在鏈格孢侵染初期,基因表達(dá)顯著上調(diào),抗病能力增強(qiáng),貯藏后期,甜瓜果實(shí)病程相關(guān)蛋白基因相對表達(dá)量下降,原因可能受甜瓜果實(shí)作為病原微生物的營養(yǎng)物質(zhì)及宿主,無法抵抗病原菌的侵染,抗病能力下降,果實(shí)腐爛嚴(yán)重。在整個貯藏過程中伽師瓜始終保持較高表達(dá)量水平,且增幅顯著高于86-1甜瓜,這可能是伽師瓜比86-1甜瓜抗鏈格孢病害的原因之一。

相關(guān)性分析表明伽師瓜和86-1甜瓜病斑直徑與酶活性及相基因表達(dá)量在貯藏初期(0～21 d)呈正相關(guān)性,在貯藏末期(24～30 d)伽師瓜果實(shí)幾丁質(zhì)酶活力、β-1,3-葡聚糖酶活性,CHT1、CHT2基因相對表達(dá)量與病斑直徑呈負(fù)相關(guān);86-1甜瓜幾丁質(zhì)酶活力、β-1,3-葡聚糖酶活性,CHT1、CHT2、GLU基因相對表達(dá)量與病斑直徑呈負(fù)相關(guān)。貯藏0～21 d 86-1甜瓜病斑直徑與幾丁質(zhì)酶活性呈顯著正相關(guān)。且伽師瓜接菌后幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶活性和其基因相對表達(dá)量顯著高于86-1甜瓜,導(dǎo)致伽師瓜的病斑直徑低于86-1甜瓜。推測幾丁質(zhì)酶,β-1,3-葡聚糖酶可能在伽師瓜抗鏈格孢過程中起關(guān)鍵作用。

4 結(jié)論

接種鏈格孢后,伽師瓜的病斑直徑顯著低于86-1甜瓜。伽師瓜通過增強(qiáng)病程相關(guān)蛋白酶活性并維持酶活性在較高水平來抵御鏈格孢的侵染,幾丁質(zhì)酶及β-1,3-葡聚糖酶活力在接種后升高,伽師瓜酶活力高于86-1甜瓜,且伽師瓜CHT1基因表達(dá)量從貯藏第12 d起顯著高于86-1甜瓜,CHT2基因表達(dá)量在貯藏9～27 d顯著高于86-1甜瓜,GLU基因表達(dá)量從第6 d開始迅速升高,并到貯藏結(jié)束時始終高于86-1甜瓜,且在貯藏前期(0～21 d)與病斑直徑呈正相關(guān),說明病程相關(guān)蛋白在植物抵御病原微生物侵染的過程中起到了關(guān)鍵作用,并且在侵染中期作用顯著。

[1]薛耀碧,周雅涵,鄧麗莉,等. 采后果實(shí)病程相關(guān)蛋白研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(6):391-393,399.

[2]Durrant W E,Dong X. Systemic aquired resistance[J]. Annual Review of Phytopathology,2004,42(1):185-209.

[3]范旭東. 柑橘衰退病毒侵染對寄主植物同工酶影響和誘導(dǎo)表達(dá)病程相關(guān)蛋白的分析[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[4]劉紀(jì)元,佟少明,侯和勝. 植物病程相關(guān)蛋白研究進(jìn)展[J].黑龍江科技信息,2012(5):65.

[5]葛永紅,李燦嬰,朱丹實(shí),等. 采后BTH處理對蘋果果實(shí)苯丙烷代謝和病程相關(guān)蛋白積累的增強(qiáng)作用[J]. 食品工業(yè)科技,2015(5):306-310.

[6]郭紅蓮,路玉蓉,王剛志,等. 水楊酸對采后番茄抗逆性及病程相關(guān)蛋白的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技,2012(2):131-134.

[7]劉新華. BTH防治芒果采后炭疽病及其系統(tǒng)獲得抗性機(jī)理[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué),2010.

[8]范三紅,李靜,施俊鳳. 拮抗菌Burkholderiacontaminans對玫瑰香葡萄采后灰霉病的抗性誘導(dǎo)[J]. 食品科學(xué),2016(2):266-270.

[9]張培嶺,白羽嘉,黃偉,等. 不同濃度外源水楊酸對甜瓜果實(shí)抗病相關(guān)酶活性的影響[J]. 食品科技,2016(7):38-43.

[10]白羽嘉,張培嶺,黃偉,等. 鏈格孢侵染采后甜瓜果實(shí)組織幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶基因表達(dá)分析[J]. 食品科學(xué)(待刊).

[11]曹建康,姜微波,趙玉梅.果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2007.

[12]Livak K J,Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and 2-ΔΔCtmethod[J]. Methods,2001,25(4):402-408.

[13]趙利輝,邱德文,劉崢.植物SAR和ISR中的乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)[J].生物技術(shù)通報,2006(3):28-32.

[14]王廷璞,馬靜靜,趙菲佚.β-l,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酸在農(nóng)作物病蟲害防治中的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(26):14417-14419.

[15]羅晶晶,張仁英,齊曉花,等. 黃瓜幾丁質(zhì)酶基因克隆及與白粉病抗性關(guān)系的初步研究[J]. 分子植物育種,2015,13(7):1584-1591.

[16]侯曉婉,徐碧玉,胡偉,等. 幾丁質(zhì)酶及基因參與水楊酸誘導(dǎo)香蕉枯萎病抗性[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(7):64-70，2.

[17]高麗娟. 水楊酸誘導(dǎo)梨抗輪紋病作用機(jī)制研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[18]孫溶溶,彭真,程琳,等. BTH誘導(dǎo)花椰菜對菌核病的抗性研究[J]. 植物病理學(xué)報,2012(3):281-289.

[19]吳芳芳,鄭有飛,萬長健,等. UV-B輻射增強(qiáng)對蘋果采后炭疽病發(fā)病情況和抗病相關(guān)酶活性的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境,2008(3):962-965.

Effectsofactivitiesandgeneexpressionofpathogenesis-relatedproteinsinmuskmelonfruitinoculatedwithAlternariaalternata

ZHANGPei-ling,HUANGWei,MALing,FENGZuo-shan,BAIYu-jia*

(College of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

TS255.1

A

1002-0306(2017)18-0290-06

2017-03-13

張培嶺(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工，E-mail：zpl911102@126.com。

*通訊作者:白羽嘉(1984-)，男，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工、食品生物技術(shù)，E-mail:saintbyj@126.com。

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(青年科學(xué)基金，2016D01B020)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.055