樊雪梅 王書民 李哲建 賈雪艷 鄭行望

摘要利用AuNPs/Nafion復(fù)合膜技術(shù)固定Ru（bpy）2+3，采用羧基化碳納米管固定氨基化腺苷適配體，制備腺甘電化學(xué)發(fā)光生物傳感器。采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)發(fā)光法對(duì)傳感器進(jìn)行表征。結(jié)果表明，此傳感器具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。腺苷與傳感器作用后，腺苷與其適配體形成G四面體結(jié)構(gòu)，Ru（bpy）2+3的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低量與腺苷濃度的負(fù)對(duì)數(shù)在1.0×10

Symbolm@@ 11～1.0×10

Symbolm@@ 7 mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔIECL=

Symbolm@@ 890lgC-5050，檢出限（S/N=3）為5.0 × 10

Symbolm@@ 12 mol/L。對(duì)1.0 × 10

Symbolm@@ 10 mol/L腺苷平行測(cè)定11次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%。用于尿液中腺苷的測(cè)定，加標(biāo)回收率在 97.1%～110.0%之間。

關(guān)鍵詞電化學(xué)發(fā)光； 腺苷適配體； 腺苷

1引 言

腺苷是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性核苷，是合成三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中間體， 可直接進(jìn)入心肌， 經(jīng)磷酸化生成腺苷酸，參與心肌能量代謝，同時(shí)還可擴(kuò)張冠脈血管，增加血流量[1]。另外，大量研究表明， 尿腺苷可作為腫瘤的潛在生物標(biāo)志物，在廣譜性癌癥診斷、手術(shù)療效評(píng)價(jià)中具有重要臨床實(shí)用價(jià)值[2]。因此對(duì)腺苷的分析檢測(cè)具有重要的理論和實(shí)用意義。目前，測(cè)定腺苷的方法有色譜法[3]、化學(xué)發(fā)光法[4]、熒光法[5，6]、電化學(xué)法[7～9]等。

適配體是利用體外篩選技術(shù)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，從核酸分子文庫(kù)中得到的寡核苷酸片段，能與多種目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性的結(jié)合[10]。 Sun等[11]利用外切酶Ⅲ輔助的DNA循環(huán)和雜交鏈反應(yīng)的雙重放大作用，構(gòu)建了一種免標(biāo)記熒光適配體傳感器用于檢測(cè)腺苷。Sun等[12]利用適配體探針與捕獲探針發(fā)生雜交，腺苷與適配體之間的特異性結(jié)合將適配體探針從雙鏈中置換下來，導(dǎo)致傳感界面上雙鏈數(shù)量減少，從而使吸附的亞甲基蘭數(shù)量相應(yīng)減少，建立了一種電化學(xué)適配體傳感器檢測(cè)腺苷的方法。Wang等[13]構(gòu)建了以腺苷適配體、二硫蘇糖醇和巰基己醇為組成的三元模式電化學(xué)阻抗腺苷適配體傳感器，并用于腺苷的檢測(cè)。電化學(xué)發(fā)光（ECL）是指一些中間體，主要是自由基離子在電的激發(fā)下產(chǎn)生于電極表面，繼而進(jìn)行高能電子遷移反應(yīng)，形成激發(fā)態(tài)而產(chǎn)生的一種發(fā)光現(xiàn)象[14]。電化學(xué)發(fā)光生物傳感器是將生物分子固定在電極上，并將生物識(shí)別分子和目標(biāo)分析物結(jié)合的生物信號(hào)轉(zhuǎn)換為可檢測(cè)的ECL信號(hào)的一種分析器件。三聯(lián)吡啶釕是目前研究最為廣泛的電化學(xué)發(fā)光活性物質(zhì)，然而，它本身沒有可用于標(biāo)記的活潑基團(tuán)，常常通過衍生物或以納米粒子為載體而實(shí)現(xiàn)標(biāo)記[15]。目前，利用ECL適配體傳感器檢測(cè)腺苷已有報(bào)道，如孫波等[16]將捕獲探針通過與酰胺氯交聯(lián)共價(jià)鍵合到修飾了對(duì)氨基苯磺酸的石墨電極表面，設(shè)計(jì)了一種基于夾心式檢測(cè)腺苷的ECL適配體傳感器。Lin等[17]建立了基于硅納米粒子對(duì)聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光信號(hào)放大作用的腺苷適配體ECL傳感器。Li等[18]利用Rusilica 納米材料的 ECL 信號(hào)高以及 Ru（bpy）2+3二茂鐵體系的猝滅效率高的優(yōu)點(diǎn)，建立了一種信號(hào)閉合型ECL 腺苷適配體傳感器。Chen等[19]利用含有RuSi NPs和腺苷適配體片段的ss DNA1與二茂鐵標(biāo)記的 ss DNA2 互補(bǔ)雜化，腺苷與腺苷適配體特異性結(jié)合，使得標(biāo)記有猝滅劑的腺苷適配體從電極上脫落，使得 ECL 信號(hào)得到恢復(fù)，建立了檢測(cè)腺苷的新方法。但上述幾種方法各有缺點(diǎn)， 如操作復(fù)雜、線性范圍較窄或檢出限較高等。

本研究制備了AuNPs/SWCNTs/Nafion復(fù)合膜，Ru（bpy）2+3通過靜電吸附固定于復(fù)合膜上，腺苷適配體與SWCNTs通過?；磻?yīng)固定于AuNPs/SWCNTs/Nafion/Ru（bpy）2+3上，制備得到ECL適配體生物傳感器， 此傳感器具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。 腺苷與傳感器作用后，腺苷與腺苷適配體形成G四面體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Ru（bpy）2+3遠(yuǎn)離電極表面，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低，從而實(shí)現(xiàn)腺苷的定量檢測(cè)。本方法與文獻(xiàn)報(bào)道的ECL方法比較，具有操作簡(jiǎn)單、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器和試劑

MPIE型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（西安瑞邁電子科技有限公司）；Zennium電化學(xué)工作站（德國(guó)Zahner公司）； UV1600PC 紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；JEM2100型透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；RT5 POWER電磁攪拌機(jī)（德國(guó)IKA公司）；WF300D超聲波清洗機(jī)（寧波海曙五方超聲設(shè)備有限公司）；TDL802B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；PTRO 10L實(shí)驗(yàn)室超純水設(shè)備（上海品拓環(huán)保工程設(shè)備有限公司）。采用三電極系統(tǒng)：工作電極為裸玻碳電極或修飾電極，Pt絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極（飽和KCl 溶液）為參比電極。

腺苷適配體序列（5′ AGA GAA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG GT （CH2）7NH23′），根據(jù)文獻(xiàn)[20]設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。羧基化單壁碳納米管（SWCNTs，中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司，COOH含量2.73%，長(zhǎng)度5～30 μm，純度>90%）。三聯(lián)吡啶釕、Nafion、N羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1（3二甲氨基丙基）3乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和氯金酸（Sigma公司）。腺苷（上海生工公司）。其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.0 × 10

Symbolm@@ 4 mol/L腺苷適配體溶液的配制： 腺苷適配體于12000 r/min離心8 min后，以29 μL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液（pH 7.4）溶解。1.0 × 10endprint

Symbolm@@ 4 mol/L腺苷溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.0010 g腺苷溶于10 mL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液。 5 mmol/L [Fe（CN）6]3

Symbolm@@ /4

Symbolm@@ 0.10 mol/L KCl（0.10 mol/L PBS，pH=7.4）溶液；50 mmol/L TPA（0.1 mol/L PBS，pH=7.4）溶液；5 mg/mL NHS和2 mg/mL EDC溶液（0.10 mol/L PBS，pH=7.4）；0.01 mol/L Ru（bpy）2+3溶液；氯金酸：0.01%；檸檬酸三鈉：1%。沖洗液為0.01 mol/L PBS緩沖溶液（pH 7.4）。

2.2納米金的制備

采用檸檬酸鈉還原法制備納米金[21]。于250 mL錐形瓶中加入100 mL 0.01% 氯金酸溶液，加熱至沸， 加入2.75 mL 1%檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)煮沸12 min，顏色由紫紅色變?yōu)榫萍t色，停止加熱，自然冷卻至室溫。將此溶液裝入棕色瓶置于4℃保存。

2.3電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備

將玻碳電極（直徑2 mm）在0.05 μm三氧化二鋁拋光粉上打磨光亮，分別在硝酸（1∶1， V/V）、 乙醇（1∶1， V/V）、 超純水中超聲3 min，干燥。AuNPs/SWCNTs/Nafion溶液的制備：準(zhǔn)確稱取5 mg SWCNTs溶于5.0 mL 0.5% Nafion溶液中，超聲分散30 min，得到 1 mg/mL SWCNTs/Nafion分散液，將 SWCNTs/Nafion分散液和AuNPs溶液按體積比1∶1混合，超聲分散30 min，即得到AuNPs/SWCNTs/Nafion溶液。取10 μL AuNPs/SWCNTs/Nafion混合液涂滴于預(yù)處理好的玻碳電極表面，自然晾干，再滴加10 μL 1.0 mmol/L Ru（bpy）2+3于修飾好的電極上，自然晾干后得到Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/Nafion 修飾電極，將此電極浸泡于2 mg/mL EDC和5 mg/mL NHS的混合溶液30 min，以活化SWCNTs中的羧基，然后滴加10 μL 1.0 × 10

Symbolm@@ 5 mol/L 腺苷適配體，自然晾干后用PBS沖洗電極，得到Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/Nafion/腺苷適配體ECL生物傳感器，于4℃避光保存。

2.4實(shí)驗(yàn)方法

將ECL生物傳感器浸入到100 μL含不同濃度的腺苷溶液中反應(yīng)30 min，隨后用PBS沖洗液沖洗電極表面，以0.1 V/s的掃速在50 mmol/L TPA（0.1 mol/L PBS，pH = 7.4）溶液中使用循環(huán)伏安法檢測(cè)。根據(jù)ECL強(qiáng)度的減少值（ΔI = I0-IS）對(duì)腺苷進(jìn)行測(cè)定（IS是ECL生物傳感器檢測(cè)腺苷的發(fā)光強(qiáng)度值，I0是ECL生物傳感器的空白值）。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

3結(jié)果與討論

3.1納米金粒子的表征對(duì)制備的納米金進(jìn)行了吸收光譜和透射電鏡表征。由圖1可知，納米金最大吸收波長(zhǎng)為521 nm，這是球形納米金粒子表面等離子吸收的特征峰。如圖1B所示，納米金粒子的平均粒徑約為20 nm，且分散效果良好。

3.2傳感器檢測(cè)腺苷原理

Ru（bpy）2+3和AuNPs/SWCNTs/Nafion通過靜電吸附固定于玻碳電極表面，腺苷適配體與SWCNTs通過?；磻?yīng)固定于AuNPs/SWCNTs/Nafion/Ru（bpy）2+3上，從而制備得到ECL適配體生物傳感器。 當(dāng)加入目標(biāo)物腺苷時(shí)，適配體與腺苷結(jié)合， 形成G四鏈體，導(dǎo)致Ru（bpy）2+3遠(yuǎn)離電極表面，從而引起ECL信號(hào)的降低。傳感器檢測(cè)腺苷原理見圖2。

出現(xiàn)了明顯的ECL現(xiàn)象，這表明Ru（bpy）2+3已固定在AuNPs/SWCNTs/Nafion/GCE表面，并表現(xiàn)出良好的ECL行為。將腺苷適配體修飾在Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/Nafion/GCE上后，ECL信號(hào)明顯降低， 表明腺苷適配體已固定在Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/ Nafion/GCE表面。 圖3C為Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/Nafion/腺苷適配體/GCE連續(xù)掃描10圈得到的ECL圖，連續(xù)掃描10圈過程中，ECL變化很小，表明修飾電極具有良好的穩(wěn)定性。

3.4電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的可行性

對(duì)ECL適配體傳感器與腺苷相互作用前后的發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行了考察（圖4）。由圖4可知，傳感器與腺苷作用前電化學(xué)發(fā)光峰強(qiáng)度為6012（曲線a），當(dāng)與1.0 × 10

3.5實(shí)驗(yàn)條件的選擇

考察了體系的pH值及腺苷與傳感器作用時(shí)間對(duì)ECL強(qiáng)度的影響。由圖5A可知，隨反應(yīng)時(shí)間的增加，ECL強(qiáng)度的降低值ΔI逐漸增大，到30 min時(shí)ΔI趨于平穩(wěn)，再繼續(xù)增加結(jié)合時(shí)間，ΔI幾乎不變，因此選擇30 min作為反應(yīng)結(jié)合時(shí)間。pH對(duì)ECL強(qiáng)度有一定的影響[24]。由圖5B可知，隨著pH值增大，腺苷對(duì)傳感器上釕的ECL信號(hào)抑制程序逐漸增大，當(dāng)pH=7.4時(shí)，抑制程度達(dá)到最大。因此選擇pH 7.4的緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.6干擾實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，考察實(shí)際樣品中可能存在的物質(zhì)對(duì)腺苷測(cè)定的影響。當(dāng)腺苷濃度為1.0 × 10

7.4）. （a）blank， （b）1.0 × 10

3.8傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性分析

用同一支傳感器對(duì) 1.0 × 10

Symbolm@@ 10 mol/L腺苷連續(xù)測(cè)定11 次，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%， 用同一批次的5 支傳感器對(duì)1.0 × 10endprint

Symbolm@@ 10 mol/L腺苷進(jìn)行測(cè)定，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%，說明此傳感器有較好的重現(xiàn)性。為考察傳感器的穩(wěn)定性，使傳感器吸附一定濃度的腺苷后， 于4℃下保存，定期測(cè)定電化學(xué)發(fā)光信號(hào)值，發(fā)現(xiàn)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度相比于原始發(fā)光強(qiáng)度，降低了2.6%，說明傳感器的穩(wěn)定性較好。

3.9尿液樣品分析

取6份新鮮尿液（陜西省商洛市中心醫(yī)院提供），用0.01 mol/L pH 7.4的PBS溶液稀釋100倍作為分析試樣，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見表2。加標(biāo)回收率為97.1%～110.0%， RSD為2.5%～3.5%，表明本方法可用于臨床實(shí)際樣本的檢測(cè)。

4結(jié) 論

制備了一種檢測(cè)腺苷的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器。首先，Ru（bpy）2+3與AuNPs/SWCNTs/ Nafion 通過靜電作用固定于玻碳電極表面，然后采用羧基化碳納米管固定氨基化腺苷適配體，制備得到ECL生物傳感器。當(dāng)腺苷與傳感器作用后，腺苷與腺苷適配體形成G四面體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致發(fā)光強(qiáng)度降低。本傳感器制備方法簡(jiǎn)單、用樣量少， 用于腺苷的檢測(cè)，結(jié)果令人滿意。與文獻(xiàn)報(bào)道的ECL方法相比，本方法線性范圍較寬。本研究為生物小分子的檢測(cè)提供了一種新思路。

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Determination of Adenosine Based on Ru（bpy）2+3/AuNPs/

SWCNTs/Adenosine Aptamer Electrochemiluminescence Sensor

FAN XueMei*1， WANG ShuMin1， LI ZheJian1， JIA XueYan2， ZHENG XingWang3

1（College of Chemical Engineering and Modern Materials， Shangluo University， Shangluo 726000， China）

2（School of Chemistry and Chemical Engineering， Northwest Normal University， Lanzhou 730070， China）

3（School of Chemistry and Chemical Engineering， Shaanxi Normal University， Xi'an 710062， China）

AbstractBased on the AuNPs/Nafion composite membrane technology and immobilization of amino adenosine aptamer using carboxyl carbon nanotubes on the surface of a glassy carbon electrode， a electrochemiluminescence sensor was preparated. The sensor was characterized by cyclic voltammetry and electrochemical luminescence. The result showed that the sensor had a good stability and reproducibility. Adenosine and adenosine aptamer could form Gtetrahedral structure， leading a decrease of ECL intensity. Under the optimum experimental conditions， the relative ECL intensity showed a good linear relationship to the negative logarithm of adenosine concentration in the range of 1.0×10

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 30970696）.

第45卷2017年9月 分析化學(xué) （FENXI HUAXUE）研究報(bào)告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第9期1360～1366

[BW（B（S*3/4，0，）][CD44][BW）]

DOI： 10.11895/j.issn.02533820.170256endprint