趙成軍+馬雄輝+李建平

摘要采用抗原決定基法制備了胰島素電化學(xué)分子印跡傳感器。以胰島素C端多肽作為模板分子，定向自組裝在Au電極上，以鄰苯二胺為功能單體，電化學(xué)聚合制備分子印跡聚合膜。以NaOH為洗脫液，洗脫模板分子，形成的與胰島素C端多肽三維結(jié)構(gòu)相匹配的分子印跡孔穴能特異性識別胰島素。重吸附胰島素分子后，以K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]為探針，通過測量探針在電極表面產(chǎn)生的電流大小實現(xiàn)胰島素的間接測定。在1.0 × 10

Symbolm@@ 14～5.0 × 10

Symbolm@@ 13 mol/L濃度范圍內(nèi)，傳感器的電流響應(yīng)值與胰島素濃度呈良好的線性關(guān)系，檢出限為7.24 × 10

Symbolm@@ 15 mol/L（3σ）。此傳感器具有較好的選擇性和穩(wěn)定性，并成功用于血清樣品中胰島素的測定。

關(guān)鍵詞胰島素； 分子印跡； 電化學(xué)傳感器； 抗原決定基法

1引 言

胰島素是一種對體內(nèi)碳水化合物和脂肪代謝調(diào)節(jié)至關(guān)重要的激素[1]，對促進(jìn)人體合成糖原、脂肪和蛋白質(zhì)，以及人體細(xì)胞的生長發(fā)育和人體健康具有重要的意義。目前， 檢測胰島素的方法主要有酶聯(lián)免疫分析法[2]、發(fā)光免疫分析法[3]、放射免疫分析法[4]和高效液相色譜法[5，6]等。這些方法存在易受干擾、測試條件苛刻、儀器昂貴等缺點。因此，建立特異性識別胰島素的簡便、快速的分析方法具有重要意義。

分子印跡傳感器因其具有良好的特異性識別能力和操作簡單等優(yōu)點而迅速發(fā)展[7]，并在蛋白質(zhì)等大分子檢測領(lǐng)域中得到廣泛的運用[8～10]。Prasad等[11]以胰島素為模板分子，以磷脂酰膽堿脂作為功能單體通過自由基聚合在多壁碳納米管表面制備分子印跡聚合物（MIP）修飾電極，利用胰島素含有的酪氨酸殘基在0.8V產(chǎn)生不可逆氧化峰對胰島素進(jìn)行測定。由于胰島素的構(gòu)象多樣性，空間位阻效應(yīng)大，導(dǎo)致該法模板分子不易洗脫；胰島素電活性差，直接測量氧化電流靈敏度較低，且氧化電位過高，樣品中共存還原性物質(zhì)易產(chǎn)生干擾。

抗原決定基法[12～14]是近年發(fā)展起來的一種蛋白質(zhì)印跡新方法，該法以蛋白質(zhì)表面的特征多肽作為模板分子制備分子印跡聚合物，以形成的三維孔穴特異地識別多肽，進(jìn)而對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行識別[15，16]，避免了整體印跡法模板分子不易洗脫等缺點。但用抗原決定基法構(gòu)建胰島素分子印跡傳感器尚未見報導(dǎo)。本研究將半胱氨酸修飾的胰島素C端多肽定向自組裝在Au電極表面，作為模板分子，以鄰苯二胺（oPD）作為功能單體，采用電化學(xué)聚合的方法制得胰島素C端多肽分子印跡膜；洗脫后的分子印跡膜上形成能特異性識別該段多肽的孔穴，進(jìn)而識別整個胰島素分子。通過測量K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]探針在電極上產(chǎn)生的氧化還原電流，實現(xiàn)胰島素含量的間接測定。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；AL204型電子分析天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； PHS3D數(shù)顯酸度計（上海雷磁儀器廠）；采用三電極系統(tǒng)：工作電極為Au電極（d=2.0 mm），Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。

鄰苯二胺、甲醇（中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等試劑（西隴化工股份有限公司）；半胱氨酸修飾的胰島素C端多肽（CysAlaLysProThrTyrPheGly，上海杰肽生物科技有限公司）；胰島素（大連美侖生物技術(shù)有限公司）。若無特殊說明，實驗所用試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

胰島素C端多肽溶液的配制：以0.02 mol/L PBS緩沖溶液（pH 7.4）配制1.0 × 10

Symbolm@@ 4 mol/L胰島素C端多肽溶液，4℃保存，待用。鄰苯二胺溶液的配制： 以0.02 mol/L PBS溶液（pH 7.4）配制5 mmol/L鄰苯二胺溶液。

2.2實驗方法

2.2.1自組裝胰島素C端多肽移取適量胰島素C端

多肽溶液于0.5 mL離心管中，將拋光后的Au電極浸入胰島素C端多肽溶液中1 h，利用AuS鍵進(jìn)行自組裝，以K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]溶液為探針，通過差分脈沖伏安法（DPV）、循環(huán)伏安法（CV）和交流阻抗法（EIS）對自組裝后的修飾電極進(jìn)行表征。

2.2.2傳感器的制備將配制好的鄰苯二胺溶液轉(zhuǎn)移至15 mL燒杯中，

以自組裝胰島素C端多肽后的Au電極為工作電極， 通過循環(huán)伏安法（CV）進(jìn)行電聚合，電位為0～0.8 V，掃描速度為50 mV/s，掃描圈數(shù)為10 圈，形成分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymer， MIP）。以2 mol/L NaOH溶液為洗脫液，將聚膜后的修飾電極在磁力攪拌下進(jìn)行洗脫，洗脫時間為35 min，將模板分子洗脫后，得到分子印跡傳感器。非分子印跡聚合膜（Nonmolecularly imprinted polymer， NMIP）的制備不需要在Au電極上自組裝胰島素C端多肽，其它步驟與分子印跡膜制備相同。制備過程如圖1所示。

3結(jié)果與討論

3.1分子印跡膜的制備

以0.02 mol/L PBS （pH = 7.4）緩沖溶液為溶劑，配制5 mmol/L鄰苯二胺溶液，以循環(huán)伏安法進(jìn)行電聚合，聚合電位為0～+0.8 V，掃描速度為50 mV/s。結(jié)果如圖2所示，隨著掃描圈數(shù)的增加，電流逐漸減小并趨于穩(wěn)定，說明鄰苯二胺已成功聚合在Au電極上[17]。此外，胰島素C端多肽在該電位范圍內(nèi)僅有極弱的特征峰，因此，可忽略在分子印跡膜電聚合過程中胰島素C端多肽的電極反應(yīng)。endprint

3.2印跡過程的表征

3.2.1循環(huán)伏安表征按照2.2.2節(jié)的方法，分別制備分子印跡傳感器和非分子印跡傳感器，并對2.5 × 10

3.2.2交流阻抗法表征EIS通過測量電極表面阻抗的變化，間接對分子印跡傳感器進(jìn)行表征。如圖4所示，裸電極時，電極表面與溶液中電活性物質(zhì)直接接觸，因此阻抗很?。▓D4a）。隨著印跡膜在Au電極上聚合，膜的致密性導(dǎo)致電極表面的阻抗變得很大（圖4b）；而當(dāng)洗脫分子印跡膜中模板分子后，形成的印跡孔穴作為電子傳遞的通道，因此電極表面阻抗變小（圖4c）；重吸附后，胰島素C端多肽和胰島素填充于印跡孔穴中，阻礙了探針離子穿過孔穴到達(dá)電極表面，交流阻抗又重新變大（圖4d， 4e）。 而NMIP中沒有形成印跡膜，洗脫后（圖4f）無法形成印跡孔穴，探針分子無法到達(dá)電極表面，因此交流阻抗基本不發(fā)生變化（圖4g）。

3.3自組裝時間及胰島素C端多肽用量優(yōu)化

用不同濃度胰島素C端多肽進(jìn)行自組裝1 h，制備MIP電極，洗脫后對3.0 × 10

3.4洗脫液的選擇和洗脫時間的優(yōu)化

分別以硫酸、甲醇、甲醇乙酸、氫氧化鈉等作為洗脫液在攪拌下對胰島素C端多肽進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明，用硫酸、甲醇、甲醇乙酸（8∶1， V/V）分別進(jìn)行洗脫后電流基本沒有變化，說明上述溶液不能將胰島素C端多肽洗脫掉；以2 mol/L NaOH作為洗脫液進(jìn)行洗脫，隨著洗脫時間延長，探針電流逐漸增大，將洗脫后的修飾電極對不同濃度的胰島素溶液進(jìn)行重吸附，取得良好結(jié)果，說明NaOH可將模板分子洗脫，因此選擇2 mol/L NaOH作為本實驗洗脫液。對洗脫時間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)洗脫時間達(dá)到35 min后，探針電流趨于平穩(wěn)，說明洗脫已達(dá)到平衡。后續(xù)實驗中洗脫時間為35 min。

3.5重吸附介質(zhì)pH和重吸附時間的優(yōu)化

重吸附時間是MIP電極對目標(biāo)分子進(jìn)行特異性識別所需的時間。將洗脫后的MIP電極在胰島素C端多肽（圖6A，曲線a）和胰島素溶液（圖6A，曲線b）中分別進(jìn)行重吸附，記錄不同時間后的DPV峰電流。如圖6A所示，隨著重吸附時間延長，胰島素逐漸特異性地結(jié)合在印跡孔穴中，阻礙了探針在電極上的擴(kuò)散，導(dǎo)致峰電流逐漸減少，當(dāng)重吸附時間達(dá)到9 min后兩種電極的電流基本不再變化，說明印跡膜對胰島素C端多肽和胰島素的重吸附過程已達(dá)到平衡，因此在后續(xù)實驗中選擇重吸附時間為9 min。

以0.02 mol/L PBS緩沖溶液作為重吸附介質(zhì)，配制了不同pH值的胰島素溶液，將經(jīng)洗脫后的MIP電極分別在上述溶液中攪拌重吸附9 min，測量探針分子DPV峰電流。如圖6B所示，當(dāng)胰島素溶液pH=7.4時電流最小，說明傳感器在pH=7.4時對胰島素的識別效果最佳。

3.8重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

利用同一支傳感器對2.5 × 10

Symbolm@@ 13 mol/L的胰島素進(jìn)行6次重復(fù)測定，其測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.13%；利用同一方法制備6支分子印跡傳感器，在同樣的實驗條件下，對2.5 × 10

Symbolm@@ 13 mol/L的胰島素進(jìn)行測定，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%。實驗結(jié)果表明傳感器具有良好的重現(xiàn)性。此外對傳感器的穩(wěn)定性也進(jìn)行了考察，將制備好的傳感器于4℃下保存在PBS（pH=7.4）中。3天后3組傳感器電流響應(yīng)值平均下降了2.87%，2周后電流平均下降小于5.0%，說明傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

3.9實際樣品分析

利用加標(biāo)回収法對桂林理工大學(xué)校醫(yī)院血清樣（稀釋100倍）進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示，回收率為94.5%～104.1%， 表明此傳感器可用于實際血清樣中胰島素的檢測。

4結(jié) 論

首次利用抗原決定基法制作了胰島素分子印跡傳感器，以[Fe（CN）6]3

Symbolm@@ /4

Symbolm@@ 作為探針， 間接地對胰島素進(jìn)行測量。以胰島素C端多肽作為模板分子，有效地降低了識別過程中空間位阻效應(yīng)，簡化了洗脫步驟；通過測量探針在印跡電極上產(chǎn)生的氧化還原電流進(jìn)行定量分析，使檢測靈敏度顯著提高。此傳感器具有選擇性好、檢出限低、重現(xiàn)性好和操作簡單等特點，可對痕量胰島素進(jìn)行檢測。

References

1Pu Y， Zhu Z， Han D， Liu H， Liu J， Liao J， Zhang K， Tan W. Analyst， 2011， 136（20）： 4138-4140

2Andersen L， Dinesen B， Jorgensen P N， Poulsen F， Roder M E. Clin. Chem.， 1993， 39： 578-582

3Forest J C， Masse J， Lane A. Clin. Biochem.， 1998， 31（2）： 81-88

4Zhang X， Zhu S， Deng C， Zhang X. Chem. Commun.， 2012， 48： 2689-2691

5Moein M M， Javanbakh M， Akbariadergani B. Talanta， 2014， 121： 30-36

6Ho E N M， Wan T S M， Wong A S Y， Lam K K H，Stewart B D. J. Chromatogr. A， 2008， 1201（2）： 183-190

7Li J P， Jiang F Y， Wei X P. Anal. Chem.， 2010， 82（14）： 6074-6078

8Zhou J， Gan N， Hu F， Li T， Zhou H， Li X， Zheng L. Sens. Actuators B， 2013， 186： 300-307endprint

9CHEN ZhiQiang， LI JianPing， ZHANG XueHong， JIANG FuYang. Journal of Instrumental Analysis， 2010， 29（1）： 97-104

陳志強(qiáng)， 李建平， 張學(xué)洪， 蔣復(fù)陽. 分析測試學(xué)報， 2010， 29（1）： 97-104

10WANG Ying， HUANG ChunFang， LIANG RuPing， QIU JianDing. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（5）： 787-794

王 瑩， 黃春芳， 梁汝萍， 邱建丁. 分析化學(xué)， 2013， 41（5）： 787-794

11Prasad B， Madhuri R， Tiwari M， Sharma P. Electrochim. Acta， 2010， 55： 9146-9156

12Li S， Cao S， Whitcombe M， Piletsky S. Prog. Polym. Sci.， 2014， 39： 145-163

13Yang K， Li S， Liu J， Liu L， Zhang L， Zhang Y. Anal. Chem.， 2016， 88（11）： 5621-5625

14Qin Y， Li D， He X， Li W， Zhang Y. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2016， 8： 10155-10163

15MA XiongHui， LI JianPing， WANG Chao， XU GuoBao. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（1）： 152-159

馬雄輝， 李建平， 王 超， 徐國寶. 分析化學(xué)， 2016， 44（1）： 152-159

16Uzun L， Turner A. Biosens. Bioelectron.， 2016， 76： 131-144

17Yang B， Li J， Zhang L， Xu G. Analyst， 2016， 141： 5822-5828

18Li J P， Zhao J， Wei X P. Sens. Actuators B， 2009， 140： 663-669

19Yilmaz B， Kadioglu Y， Capoglu I. J. Chromatogr. Sci.， 2012， 50： 586-590

20Frasconi M， Tortolini C， Botre F， Mazzei F. Anal. Chem.， 2010， 82（17）： 7335-7342

21Liang K， Wu H， Li Y. Clin. Proteomics， 2017， 14： 5-13

22Poulsen F， Jensen K. J. Biomol. Screen， 2007， 12： 240-247

23Even M， Sandusky C， Barnard N， Mistry J， Sinha M. Clin. Biochem.， 2007， 40： 98-103

An Insulin Molecularly Imprinted Electrochemical

Sensor Based on Epitope Imprinting

ZHAO ChengJun， MA XiongHui， Li JianPing*

（Guangxi Key Laboratory of Electrochemical and Magnetochemical Function Materials，

Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Detection，

College of Chemistry and Bioengineering， Guilin University of Technology， Guilin 541004， China）

AbstractA novel molecularly imprinted electrochemical sensor for direct detection of insulin was prepared based on epitope imprinting. CTerminal polypeptide in insulin as template molecule was firstly selfassembled on the Au electrode. Then the molecularly imprinted polymer （MIP） was fabricated by electropolymerization with ophenylenediamine （oPD） as functional monomer on this Au electrode. After elution of template molecules by NaOH solution， the imprinting cavities were formed with the threedimensional structure matched with the polypeptide in insulin molecules. The imprinting cavities could specifically recognize and rebind with insulin molecules. With K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6] as a probe， the insulin was indirectly detected. There was a linear relationship between the response current and the insulin concentrations in the range of 1.0 × 10

Symbolm@@ 14-5.0 × 10

Symbolm@@ 13 mol/L， and the detection limit was 7.24×10

Symbolm@@ 15 mol/L. The developed sensor exhibited good selectivity and stability， and could be applied to the determination of serum samples.

KeywordsInsulin； Molecular imprinting； Electrochemical sensor； Epitope imprinting

（Received 23 April 2017； accepted 6 July 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21375031， 21765006） and the Natural Science Foundation of Guangxi Province， China （No. 2015GXNSFFA139005）.endprint