李健鵬，顏春魯，安方玉，劉永琦，宋 敏，陳 麗，王 鵬，馬正民，牛彥強(qiáng)

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，甘肅 蘭州 730030； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030； 3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，甘肅 蘭州 730030； 5.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床學(xué)院， 甘肅 蘭州 730030)

·實(shí)驗(yàn)研究·

右歸丸對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠鈣磷代謝和骨代謝的影響*

李健鵬1，顏春魯1，安方玉1，劉永琦2，宋 敏3，陳 麗4，王 鵬3，馬正民3，牛彥強(qiáng)5

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，甘肅 蘭州 730030； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030； 3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，甘肅 蘭州 730030； 5.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床學(xué)院， 甘肅 蘭州 730030)

目的：觀察右歸丸對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠鈣磷代謝和骨代謝的影響，探討其干預(yù)機(jī)制。方法：將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型對(duì)照組，右歸丸低、中、高劑量組，戊酸雌二醇組6組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余各組采用去卵巢法制備大鼠骨質(zhì)疏松癥模型，假手術(shù)組大鼠僅切除卵巢周?chē)?。造模成功?2周，戊酸雌二醇組給予雌激素戊酸雌二醇片(0.09μg/g)灌胃，假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃，右歸丸干預(yù)組按高、中、低劑量依次給予右歸丸5，10，20g/kg灌胃，1 d 1次，連續(xù)4周。末次給藥結(jié)束，檢測(cè)股骨組織中的骨密度(bone mineral density，BMD)；股動(dòng)脈采血檢測(cè)血清的鈣(calcium，Ca)、磷(phosphorus，P )含量，骨鈣素(osteocalcin，BGP)含量和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)含量；處死大鼠，取材計(jì)算胸腺、脾臟及腎臟指數(shù)，檢測(cè)生物力學(xué)指標(biāo)斷裂載荷和定伸長(zhǎng)-位移。結(jié)果：與模型對(duì)照組對(duì)比，假手術(shù)組大鼠股骨BMD水平、血清BGP、Ca和P含量升高，胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎指數(shù)升高，股骨斷裂載荷、定伸長(zhǎng)-位移也升高，而血清trACP含量降低，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，右歸丸3個(gè)劑量組大鼠股骨BMD水平，血清Ca、P和BGP含量、股骨定伸長(zhǎng)-位移升高，中、高劑量組胸、脾指數(shù)和斷裂載荷升高，高劑量組腎指數(shù)亦升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而高劑量組大鼠血清trACP的含量則較模型對(duì)照組降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：右歸丸通過(guò)提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度和改善骨代謝達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的目的。

右歸丸/藥效學(xué)；去勢(shì)大鼠；BMD；Ca;P;BGP;trACP;臟器指數(shù)；斷裂載荷；定伸長(zhǎng)-位移；動(dòng)物；大鼠

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由于卵巢功能低下、雌激素缺乏導(dǎo)致骨吸收超過(guò)骨形成的一類(lèi)全身性骨骼障礙性疾病，以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征，臨床表現(xiàn)主要以各類(lèi)疼痛、骨折為主[1-2]。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物主要有調(diào)節(jié)雌激素藥物、骨形成促進(jìn)藥物、骨礦化促進(jìn)藥物等西藥，長(zhǎng)期服用會(huì)引發(fā)一系列毒副作用，如陰道出血、血栓形成、冠心病、子宮內(nèi)膜癌及乳腺癌等，因此，尋找安全、低毒、有效的藥物成為防治骨質(zhì)疏松的重中之重。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主骨生髓，通過(guò)補(bǔ)腎方藥可以防治PMOP。右歸丸為中醫(yī)“溫補(bǔ)腎陽(yáng)，填精益髓”的代表方劑，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察右歸丸對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨骨密度(bone mineral density，BMD)，骨代謝標(biāo)志物血清鈣(Ca)、磷(P)、骨鈣素(osteocalcin，BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)，臟器指數(shù)，以及股骨生物力學(xué)指標(biāo)斷裂載荷、定伸長(zhǎng)-位移的影響，以期為右歸丸在治療PMOP方面的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)SD雌性大鼠，60只，體質(zhì)量(180±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

右歸丸由熟地黃24 g、山藥12 g、山茱萸9 g、枸杞子9 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g、杜仲12g、當(dāng)歸9 g、肉桂6 g、制附子6 g等組成。換算成大鼠用量為：111g×0.018×5≈10 g/kg。常規(guī)水煎，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 g生藥/mL的藥液。戊酸雌二醇片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司產(chǎn)品，批號(hào)156A；青霉素，華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)F6042103。水合氯醛，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品，批號(hào)20150105； Rat trACP ELISA Kit檢測(cè)試劑盒(批號(hào)E20151102B)、Rat BGP ELISA Kit檢測(cè)試劑盒(批號(hào)E20151201A)，均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；Ca試劑盒(批號(hào)20151127)、P試劑盒(批號(hào)20151204)，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。iMark型自動(dòng)酶標(biāo)分析儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；FA2004N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；ZY12306型微量加樣器，ScienTiFic產(chǎn)品；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司產(chǎn)品；雙能X骨密度儀，美國(guó)GE公司產(chǎn)品；AG-IX生物力學(xué)萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)，日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組、模型的建立與給藥

將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、戊酸雌二醇組、右歸丸高劑量組、中劑量組、低劑量組6組，每組10只。按照文獻(xiàn)[3-5]方法，以40 g/L水合氯醛(3μg/g)腹腔注射麻醉大鼠；俯臥位固定，備皮，消毒手術(shù)區(qū)皮膚；沿背部后正中線做1個(gè)1.0～1.5 cm的縱形切口；在乳白色發(fā)亮的脂肪團(tuán)中找到棕黃色的卵巢，沿子宮角處結(jié)扎并切除卵巢；逐層縫合傷口。假手術(shù)組大鼠，僅切除卵巢周?chē)?。術(shù)后給予青霉素抗感染，大鼠術(shù)后注意保溫。造模成功后12 w，給予藥物干預(yù)：戊酸雌二醇組給予雌激素戊酸雌二醇片(0.09 μg/g)灌胃，假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃，右歸丸干預(yù)組按高、中、低劑量依次給予右歸丸5，10，20g/kg灌胃，1 d 1次，連續(xù)4周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 骨密度

末次給藥結(jié)束后，采用腹腔注射100 g/L 水合氯醛將各組大鼠麻醉，置于雙能X 線吸收測(cè)量?jī)x平臺(tái)上，測(cè)定右股骨BMD。

1.4.2 血清 BGP、trACP、Ca和P含量

腹主動(dòng)脈采血，靜置2～3 h，1 500 r/min，離心10 min，分離血清。檢測(cè)各組大鼠血清鈣Ca、P、BGP、trACP，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3 胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)

稱量大鼠體質(zhì)量，摘取胸腺、脾臟和腎臟并稱量質(zhì)量，計(jì)算各器官指數(shù)。胸腺(脾臟、腎臟)指數(shù)=胸腺(脾臟、腎臟)質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.4.4 斷裂載荷和定伸長(zhǎng)-位移

取出完整股骨，將其右側(cè)股骨送至陸軍總院，用AG-IX生物力學(xué)萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)檢測(cè)斷裂載荷和定伸長(zhǎng)-位移等相應(yīng)指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠BMD對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠BMD降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，右歸丸各劑量組和戊酸雌二醇組股骨BMD水平均升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠BMD對(duì)比

組 別動(dòng)物數(shù)BMD假手術(shù)組100.145±0.004*模型對(duì)照組100.116±0.007戊酸雌二醇組100.146±0.006*右歸丸高劑量組100.146±0.004*右歸丸中劑量組100.134±0.005*右歸丸低劑量組100.124±0.004*

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05

2.2 各組大鼠BGP、trACP、Ca和P含量對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠血清BGP、Ca和P含量均降低，trACP含量升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，右歸丸各劑量組和戊酸雌二醇組血清BGP、Ca和P含量均升高，右歸丸高劑量組trACP含量降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。見(jiàn)表 2。

組 別動(dòng)物數(shù)BGP/(μg·L-1)trACP/(μg·L-1)Ca/(mmol·L-1)P/(mmol·L-1)假手術(shù)組102.00±0.20*0.46±0.14*2.07±0.07*0.30±0.02*模型對(duì)照組101.04±0.541.38±0.050.92±0.080.10±0.03戊酸雌二醇組101.65±0.17*0.99±0.181.89±0.11*0.22±0.03*右歸丸高劑量組102.04±0.15*0.84±0.09*1.72±0.07*0.24±0.10*右歸丸中劑量組101.55±0.17*0.91±0.081.63±0.12*0.19±0.05*右歸丸低劑量組101.54±0.19*1.21±0.021.13±0.090.18±0.02*

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05

2.3 各組大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)均明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，右歸丸中、高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著升高，高劑量組腎指數(shù)升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)對(duì)比

組 別動(dòng)物數(shù)胸腺指數(shù)脾臟指數(shù)腎臟指數(shù)假手術(shù)組100.329±0.094*0.514±0.061*0.0062±0.0003*模型對(duì)照組100.122±0.0280.268±0.0220.0031±0.003戊酸雌二醇組100.297±0.096*0.457±0.110*0.0028±0.002右歸丸高劑量組100.354±0.099*0.535±0.081*0.0052±0.0001*右歸丸中劑量組100.288±0.069*0.480±0.055*0.0035±0.002右歸丸低劑量組100.234±0.0470.409±0.0410.0031±0.001

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05

2.4 各組大鼠斷裂載荷、定伸長(zhǎng)-位移參數(shù)對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠股骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)斷裂載荷、定伸長(zhǎng)-位移等均下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，右歸丸中、高劑量組和戊酸雌二醇組可明顯改善去卵巢大鼠斷裂載荷參數(shù)，右歸丸各干預(yù)組和戊酸雌二醇組可明顯改善去卵巢大鼠定伸長(zhǎng)-位移參數(shù)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

組 別動(dòng)物數(shù)斷裂載荷/mPa定伸長(zhǎng)-位移/KPa假手術(shù)組10142.17±0.15*1.45±0.021*模型對(duì)照組1086.22±0.090.17±0.012戊酸雌二醇組10122.17±0.14*0.54±0.014*右歸丸高劑量組10115.36±2.84*0.43±0.021*右歸丸中劑量組10110.61±0.52*0.33±0.020*右歸丸低劑量組1095.57±3.210.26±0.025*

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05

3 討 論

將骨質(zhì)疏松屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨痹”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為，腎主骨，腎精充實(shí)則骨得其養(yǎng)，骨髓生化有源、堅(jiān)固；腎精虧虛則骨失其養(yǎng)，骨髓化生乏源、骨骼脆弱；因此，腎虛精虧是骨質(zhì)疏松的主要病機(jī)，治則以補(bǔ)腎為主[6]。右歸丸方中以附子、肉桂、鹿角膠為君藥，溫補(bǔ)腎陽(yáng)，填精補(bǔ)髓；以熟地黃、枸杞子、山茱萸和山藥為臣藥，發(fā)揮滋陰益腎、養(yǎng)肝補(bǔ)脾之功效；佐以菟絲子補(bǔ)陽(yáng)益陰，固精縮尿；杜仲補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋壯骨；當(dāng)歸養(yǎng)血活血，助鹿角膠以補(bǔ)養(yǎng)精血。諸藥合用,共奏溫補(bǔ)腎陽(yáng)、填精止遺之效。

在骨代謝中，血液和尿液的生化指標(biāo)是判定指標(biāo)之一[7]。摘除卵巢后的大鼠腎臟尿鈣排出增加，促進(jìn)了血鈣和骨鈣的急劇減少，使骨形成和骨鈣化能力進(jìn)一步降低，導(dǎo)致骨骼中沉積的礦物質(zhì)逐步減少，BMD和骨量降低，骨骼脆性增加，引發(fā)骨質(zhì)疏松甚至骨折[7-8]。另外，機(jī)體摘除卵巢后，骨吸收大于骨形成，導(dǎo)致骨量增加受阻和骨生物力學(xué)發(fā)生改變。也有文獻(xiàn)[9-11]證明，一些補(bǔ)腎壯骨中藥能夠抑制骨質(zhì)疏松中骨密度的減少，明顯改善骨生物力學(xué)參數(shù)的變化，升高骨質(zhì)疏松大鼠BGP含量，降低trACP含量。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：右歸丸能明顯升高去卵巢模型大鼠血清中鈣、磷含量，顯著改善鈣、磷代謝，促進(jìn)骨組織鈣化。同時(shí)，右歸丸能夠明顯抑制去卵巢大鼠所致的骨密度丟失，升高卵巢大鼠的胸脾指數(shù)和BGP含量，降低trACP的含量，這些結(jié)果均與以往研究相一致，說(shuō)明右歸丸在骨質(zhì)疏松防治方面具有一定效果。

綜上所述，右歸丸能明顯提高去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度和骨強(qiáng)度，可能是通過(guò)對(duì)鈣、磷代謝，BGP和trACP代謝的調(diào)節(jié)而發(fā)揮預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的作用。

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1001-6910(2017)10-0064-04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.10.27

顏春魯，副教授，碩士，yanchl1979@126.com

甘肅省高等學(xué)校科研項(xiàng)目(2015A-097)；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)研究與教學(xué)改革項(xiàng)目(ZH-201606)；甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究重大實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(FZYK15-16-7)

2017-07-05；

2017-08-25

(編輯 陶 珠)