陳興隆 董明

48例肺磨玻璃結節(jié)患者血漿中miR-10b的表達及意義

陳興隆1董明2

目的探討肺磨玻璃結節(jié)患者血漿中miR-10b作為診斷標記物的可能性。方法收集48例肺磨玻璃結節(jié)患者血漿，經(jīng)術后病理證實良性病變16例，癌前病變(AAH，AIS)16例，微浸潤性腺癌(MIA)8例，浸潤性腺癌(IA)8例，采用實時熒光定量PCR檢測各組血漿miRNA-10b水平，分析miRNA-10b與肺磨玻璃結節(jié)不同病理類型之間的關系。繪制ROC曲線，評估其診斷意義。結果肺癌相關組血漿miR-10b水平(RQ=0.828(0.485,1.700))較良性病變組(RQ=0.458(0.271,0.698))上調1.808倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.007)；血漿miR-10b RQ值為0.731時，診斷微浸潤腺癌(MIA)的AUC為0.827，敏感性為100%，特異性為67.5%；RQ 值為 1.137時，診斷浸潤性腺癌(IA)的AUC為0.853，敏感性為75%，特異性為87.5%。結論GGO結節(jié)患者肺癌相關病變血漿miR-10b顯著上調，特別是對微浸潤腺癌和浸潤性腺癌有一定診斷意義，有望成為GGO結節(jié)診斷標記物。

microRNA-10b; 肺磨玻璃結節(jié); 診斷標記物

肺癌是世界范圍內死亡率最高的惡性腫瘤[1]，我國肺癌的發(fā)病率和死亡率也居高不下[2]。而隨著計算機斷層掃描(Computed tomography, CT)技術的不斷發(fā)展，使早期篩查肺癌高危人群從而早診早治，改善預后成為可能。基于美國國家肺癌篩查實驗(National Lung Screening Trial, NLST)的結果[3]，2015年起，我國和美國開始在全國范圍內普及推廣低劑量CT(Low-Dose CT, LDCT)肺癌早期篩查項目[4-5]。隨著篩查工作的展開，越來越多的肺磨玻璃結節(jié)(ground-glass opacity nodules, GGO-nodules)被檢出。GGO結節(jié)CT表現(xiàn)為模糊的混濁致密影，局部呈云霧狀表現(xiàn)，密度輕度增加，但仍可見血管及支氣管結構，這類影像學改變是由細胞及肺泡壁組織液增多造成的，代表著肺泡及肺間質的變化[6]。根據(jù)近期世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)的分類[7]，GGO結節(jié)相關惡性病理表現(xiàn)包括：癌前病變(非典型腺瘤樣增生Atypical adenomatous hyperplasia, AAH和原位腺癌Adenocarcinoma in situ, AIS)，微浸潤腺癌(Minimally invasive adenocarcinoma, MIA)和浸潤性腺癌(Invasive adenocarcinoma，IA)。目前認為腺癌遵循一種循序漸進的惡變方式，由AAH轉變?yōu)锳IS，最終轉化為浸潤性腺癌。除此之外，GGO結節(jié)還與肺感染，肺水腫，肺間質性疾病有關[8]。而正確判斷GGO結節(jié)的良惡性并及時臨床干預對于我國剛起步的LDCT篩查項目至關重。本文結合我國LDCT篩查項目的時代技術背景，研究分析48例GGO結節(jié)患者血漿miR-10b與其病理類型之間的聯(lián)系，初步探討miR-10b作為GGO結節(jié)診斷標記物的可能。

資料與方法

一、一般資料

2014年7月-2015年12月天津醫(yī)科大學總醫(yī)院收治肺磨玻璃結節(jié)患者48名，年齡37-69歲，平均58歲，男性15例，女性23例，術前未行任何針對腫瘤前期輔助治療，包括放療，化療等，術后組織病理確診為良性結節(jié)16例，癌前病變(非典型腺瘤樣增生，原位腺癌)16例，微浸潤腺癌8例和浸潤性腺癌8例，受試者知情理解并簽署知青同意。

二、標本采集及miRNA提取

用EDTA抗凝管完成外周血采集，采集量10mL，分別以1000×g離心15min，12000×g離心10min,分離提取上層血漿300 μL。按miRNA提取分離試劑盒操作提取miRNA，保存于-80℃冰箱。

三、實時熒光定量RT-PCR

按miRNA逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，莖環(huán)狀結構特異性逆轉錄引物序列(表1)，以miR-16為內參基因，合成cDNA保存于-30℃冰箱。按熒光定量試劑盒說明檢測miR-10b的表達。2-ΔΔCt法分析結果。RQ=2-ΔΔCt。ΔCt=目標基因Ct-內參基因Ct，ΔΔCt=待測標本的ΔCt-對照本的ΔCt。

表1 miR-10b及內參miR-16引物序列

四、統(tǒng)計學處理

結 果

一、良性病變組與肺癌相關組(AAH, AIS, MIA, IA)水平比較

肺癌相關組血漿miR-10b水平(RQ=0.828(0.485,1.700))較良性病變組(RQ=0.458(0.271,0.698))上調1.808倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.007)(見圖1)。

二、血漿miR-10b與GGO結節(jié)病理特征的關系

血漿MiR-10b水平肺良性病變與癌前病變相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，癌前病變與微浸潤腺癌及浸潤性腺癌表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，微浸潤腺癌與浸潤性腺癌表達的差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05，(見表1)。

三、血漿miR-10b對肺磨玻璃結節(jié)的診斷效能

血漿miR-10b做為癌前病變(AHH，AIS)的診斷標記物，AUC為0.315，缺乏敏感性和特異性；血漿miR-10b RQ值為0.731時，診斷微浸潤腺癌(MIA)的AUC為0.827，(95%CI：0.711-0.943)，敏感性為100%，特異性為67.5%；血漿miR-10b RQ 值為 1.137時，診斷浸潤性腺癌(IA)的AUC為0.853，(95%CI：0.721-0.986)，敏感性為75%，特異性為87.5%(見圖2)。

表1 血漿miR-10b與肺腺癌及癌前病變表達關系

圖1 2組血漿miR-10b RQ 比較

圖2(A)miR-10b作為癌前病變(AAH，AIS)診斷標記物ROC曲線, (B)miR-10b作為微浸潤腺癌(MIA)診斷標記物ROC曲線, (C)miR-10b作為浸潤性腺癌(IA)診斷標記物ROC曲線

討 論

microRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[9]，而血漿中microRNA不易發(fā)生變性降解，性質穩(wěn)定，易于檢測，是作為診斷標記物的理想選擇[10]。

miR-10b定位于homeobox protein(HOX)基因簇，其表達促進多種腫瘤的侵襲和轉移[11-12]。本研究結果顯示，對于篩查發(fā)現(xiàn)的GGO結節(jié)，肺癌相關組(癌前病變，微浸潤腺癌，浸潤性腺癌)血漿miR-10b水平明顯高于良性病變組，特別是在微浸潤腺癌，及浸潤性腺癌組，表達水平明顯增高。盡管miR-10b用于診斷癌前病變(AAH，MIA)缺乏敏感性和特異性，但其表達為0.731時，診斷微浸潤腺癌(MIA)的AUC為0.832，(95%CI：0.723-0.941)，敏感性為100%，特異性為66.7%；表達為 1.137時，診斷浸潤性腺癌(IA)的AUC為0.855，(95%CI：0.726-0.985)，敏感性為75%，特異性為87.5%。表明其對微浸潤腺癌(MIA)和浸潤性腺癌(IA)有著較為準確的診斷價值，較有創(chuàng)檢查安全，依從性高。有望成為LDCT篩查項目中，GGO結節(jié)輔助診斷的指標。本研究作為前期探索性試驗，選用的樣本量及病歷數(shù)較少，全部都是我國華北地區(qū)人群，單中心研究，缺乏地域差異，沒有人種差別，但本研究為探討miR-10b作為輔檢GGO結節(jié)標記物的可能性打下了一定基礎。在未來的研究中，我們將進一步加大樣本量和病例數(shù)量，聯(lián)合其他多種microRNA及腫瘤標志物，提高診斷特異性及敏感性。結合目前我國LDCT篩查項目的啟動與發(fā)展，有望建立更加完善的GGO結節(jié)診斷處理原則，進一步加強LDCT篩查項目的效果，降低肺癌的死亡率，改善預后。

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ExpressionandsignificanceofplasmamiR-10bin48patientswithground-glassopacitynodules

CHENXing-long,DONGMing

TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

ObjectiveTo investigate the possibility of the expression of miR-10b as the diagnostic marker in patients with ground-glass opacity nodules.MethodsThe expression of miR-10b was detected by real-time quantitative PCR in 48 patients with ground-glass opacity nodules. The relationship between miR-10b expression and clinical characteristics was analyzed. ROC was drawn to evaluate the diagnostic value of miR-10b to the diagnosis of lung adenocarcinoma.ResultsThe expression of plasma miR-10b of the lung relation group [RQ=0.828 (0.485, 1.700)] was 1.808 times the control group [RQ=0.458 (0.271, 0.698)] (P=0.007). while the expression of miR-10b was 0.731, the diagnosis MIA sensitivity was 100%, the specificity was 82.4% and AUC was 0.827. While the expression was 1.137, the diagnosis IA sensitivity was 75%, the specificity was 82.4% and AUC was 0.853.ConclusionThe plasma miR-10b level is up-regulated in patients with lung cancer related patients, which suggests miR-10b might be used as a potential tumor marker for the diagnosis of ground-glass opacity nodules.

microRNA-10b; lung ground-glass opacity nodules; diagnosis biomarker

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.032

國家自然科學基金(No 81600073);天津市衛(wèi)生局科技基金(No 2014KZ127)

1. 300070 天津，天津醫(yī)科大學 2. 300052 天津，天津醫(yī)科大學總醫(yī)院肺部腫瘤外科

董明，E-mail:tjydming@yeah.net

2017-01-25]