葉偉南 莫榮新 李少芳

·檢驗·

三種方法檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的比較分析

葉偉南1莫榮新2李少芳3

目的初步研究恒溫擴(kuò)增法(Isothermal amplification) 、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法在診斷結(jié)核分枝桿菌(Mtuberculosis，Mtb)復(fù)合群的臨床驗證和應(yīng)用，評估這三種方法檢測Mtb復(fù)合群的效能。方法選取肇慶市8縣區(qū)的結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)2015年1月-2016年8月1496份痰標(biāo)本，取587例痰培養(yǎng)陽性的培養(yǎng)物，同時進(jìn)行恒溫擴(kuò)增法、LAMP、改良羅氏培養(yǎng)法檢測Mtb復(fù)合群。結(jié)果羅氏培養(yǎng)法Mtb復(fù)合群陽性587例，陽性率39.2%(95%CI: 36.7%-41.7%)，以此作金標(biāo)準(zhǔn)。恒溫擴(kuò)增法檢測Mtb復(fù)合群陽性570例，陽性率38.1%(95%CI: 35.6%-40.6%)，其靈敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%)，特異度97.4%(95%CI: 96.2%-98.4%)，陽性預(yù)期值95.9%(95%CI: 94.0%-97.4%)，陰性預(yù)期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%)；LAMP檢測Mtb復(fù)合群陽性578例，陽性率38.6%(95%CI: 36.1%-41.2%)，靈敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%)，特異度96.5%(95%CI: 95.2%-97.7%)，陽性預(yù)期值94.6%(95%CI: 92.5%-96.3%)，陰性預(yù)期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%)。結(jié)論改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法診斷Mtb復(fù)合群具有高度的準(zhǔn)確度和特異性，恒溫擴(kuò)增法和LAMP具有等同效能，而LAMP實操比更優(yōu)，更適合基層結(jié)核病實驗室應(yīng)用。

資料與方法

一、資料

1 液體培養(yǎng)菌株：收集2015年1月-2016年8月在結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)就診的肺結(jié)核或疑似肺結(jié)核患者1496份痰標(biāo)本， 取BBL MGIT 960培養(yǎng)陽性的587例菌株，其中肇慶市結(jié)核病防治所237例、各縣區(qū)慢病站：高新區(qū)4例、高要105例、四會41例、廣寧117例、懷集46例、德慶25例、封開12例。

2 儀器與試劑：羅氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)和鑒定管)廣東省結(jié)核病防治研究所提供，BBL MGIT 7mL Tubes由美國Becton Dickinson and Company提供，Mtb復(fù)合群核酸檢測試劑盒(恒溫擴(kuò)增法)，PCR熒光檢測儀由廣州迪澳生物科技有限公司提供。Mtb復(fù)合群核酸檢測試劑盒(LAMP)，由廣州華鋒生物科技有限公司提供。

二、方法

1 羅氏培養(yǎng)法：在磨菌瓶加入 1-2 滴10% 吐溫 -80 ，無菌吸管尖端刮取新鮮菌落置于瓶中。旋緊瓶蓋振蕩器混旋 0.5-1分鐘。加入少許滅菌的PBS。將懸濁液轉(zhuǎn)移至比濁管中，加PBS 使其濁度與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁? MacFarland No.1 )一致。無菌操作逐步稀釋至10-2mg/mL。22 SWG 標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別沾1環(huán)菌液，均勻接種至接種到硝基苯甲酸 ( PNB )及噻吩-2-羧酸肼( TCH )鑒定培養(yǎng)基，于36 ±1℃培養(yǎng)至四周觀察記錄結(jié)果，將TCH培養(yǎng)基上生長判定是NTM；PNB培養(yǎng)基上不生長判定是Mtb復(fù)合群。

2 恒溫擴(kuò)增法：Mtb核酸檢測 (恒溫擴(kuò)增法)按照試劑盒說明書操作，將培養(yǎng)陽性的培養(yǎng)物1mL加入100μ離心去上清液，加1mL 生理鹽水離心去上清液，加100μDNA提取液，100℃下加熱10min，離心后提取2μL上清液到PCR管中混勻擴(kuò)增，PCR熒光檢測儀擴(kuò)增檢測。利用擴(kuò)增曲線來判斷結(jié)果，呈S型為陽性(含結(jié)核分枝桿菌)，無S型則為陰性。每輪設(shè)陰陽性對照管。

3 LAMP：Mtb復(fù)合群核酸檢測 (環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法)按照試劑盒說明書操作，將培養(yǎng)陽性的培養(yǎng)物1mL離心去上清液，加入100μDNA裂解液，100℃下裂解10min，離心后提取2.5μL到HF反應(yīng)管中，65℃反應(yīng)60min，顛倒混勻數(shù)次后肉眼觀察顏色變化判斷結(jié)果，陽性綠色，陰性橙色。每輪設(shè)陰陽性對照管。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用Microsoft Excel2007軟件統(tǒng)計，SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，三種方法比較采用四格表卡方檢驗，計數(shù)資料采用百分率及其95%CI表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、羅氏培養(yǎng)法與恒溫擴(kuò)增法對比

羅氏培養(yǎng)法Mtb復(fù)合群陽性587例，陽性率39.2%(95%CI: 36.7%-41.7%)，以羅氏培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，恒溫擴(kuò)增法陽性570例，陽性率38.1%(95%CI: 35.6%-40.6%)，靈敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%)，特異度97.4%(95%CI: 96.2%-98.4%)，陽性預(yù)期值95.9%(95%CI: 94.0%-97.4%)，陰性預(yù)期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%)。兩種方法結(jié)果比較，Kappa=0.91高于0.8，代表檢測效果完全一致，(見表1)。

表1 羅氏培養(yǎng)法與恒溫擴(kuò)增法的一致性對比

注： Kappa=0.91 ，P=0.011 ，Z=35.26

二、羅氏培養(yǎng)法與LAMP對比

以羅氏培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，LAMP法陽性578例，陽性率38.6%(95%CI: 36.1%-41.2%)，靈敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%)，特異度96.5%(95%CI: 95.2%-97.7%)，陽性預(yù)期值94.6%(95%CI: 92.5%-96.3%)，陰性預(yù)期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%)，兩種方法結(jié)果比較， Kappa=0.90 高于0.8，說明兩種方法具有同等效能，(見表2) 。

表2 羅氏培養(yǎng)法與LAMP的一致性對比

注： Kappa=0.90，P=0.012 ，Z=34.82

三、恒溫擴(kuò)增法與LAMP

兩種方法一致性比較， Kappa=0.97 高于0.8，代表兩種方法檢測結(jié)果完全一致，(見表3 ) 。

表3 恒溫擴(kuò)增法與LAMP的一致性對比

注： Kappa=0.97 ，P=0.006，Z=37.69

討 論

羅氏培養(yǎng)法，是鑒定Mtb復(fù)合群的傳統(tǒng)方法，也是金標(biāo)準(zhǔn)，因其操作簡單，經(jīng)濟(jì)，推廣易，已在臨床廣泛應(yīng)用[2-3]。原理是PNB在一定的濃度下(500μg)選擇性抑制Mtb復(fù)合群生長，而不抑制NTM生長，達(dá)到Mtb復(fù)合群確認(rèn)。該方法特異性和靈敏度較高，但檢測期長(4周)，不利于結(jié)核病早診療的原則。

目前國內(nèi)外已應(yīng)用PCR技術(shù)檢測Mtb復(fù)合群[4-5]，LAMP 法是日本學(xué)者 Notomi 在 PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上創(chuàng)建的一種新的基因檢測手段。恒溫擴(kuò)增法和LAMP的檢測原理基本相同，引物均采用基因IS6110作為Mtb復(fù)合群檢測靶標(biāo)序列。Bst聚合酶及特異性引物在恒溫條件下對Mtb DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，測定其生成的產(chǎn)物來判斷結(jié)果。新興LAMP近年已在結(jié)核病防治方面得到廣泛應(yīng)用和研究[6-7]。

恒溫擴(kuò)增法和LAMP，在Mtb復(fù)合群診斷時，均具有靈敏度高，假陰性低，避免非特異性或污染造成的假陽性，(見表1、表2)。二種方法能顯著縮短診斷時間，3小時可得結(jié)果，操作上均需加溫、離心、擴(kuò)增幾個步驟。由表1和表2得出，兩種方法在特異度、靈敏度以及診斷效能都具有完全一致性。本研究顯示，恒溫擴(kuò)增法檢測Mtb復(fù)合群的陽性率38.1%(95%CI: 35.6%-40.6%)，與陳濤等[8]結(jié)果基本一致， 但需在開放性的PCR管中加樣混勻，易產(chǎn)生氣溶膠造成二次污染，還需配備專業(yè)的PCR熒光檢測儀檢測擴(kuò)增曲線；而LAMP陽性率為38.6%(95%CI: 36.1%-41.2%)，與沈會平的結(jié)果基本相同[9]，其操作時加樣到密封的HF反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增，過程完全在封閉的PCR管中進(jìn)行，并與核酸染料SybrGreenⅠ結(jié)合，生成有色反應(yīng)物，肉眼即可判斷結(jié)果，且無需三個變控溫度擴(kuò)增，儀器的需求。因此， LAMP與另二種方法相比，操作快速、方便、簡單、安全、經(jīng)濟(jì)有效，并可現(xiàn)場測定確認(rèn)。進(jìn)一步分析綜合陽性率為38.7%(95%CI: 37.2%-40.1%)，說明本地區(qū)感染Mtb復(fù)合群較為嚴(yán)重，待加強(qiáng)結(jié)核病診治水平，建議各基層防治機(jī)構(gòu)(慢性病防治站) 盡快提升實驗室水平，及早應(yīng)用快速、有效的LAMP分子生物學(xué)檢測方法，為臨床治療提供有力依據(jù)。由于多種原因，筆者沒有對耐多藥的Mtb復(fù)合群專項研究，有待今后工作中完善。

上述三種方法在診斷Mtb復(fù)合群均具有高度的準(zhǔn)確度和特異性，具有同等效能，而LAMP實操比更優(yōu)，更適合于條件落后的基層結(jié)核病實驗室推廣應(yīng)用。

[1] 端木宏謹(jǐn).21世紀(jì)結(jié)核病控制與研究工作展望[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2000,23(1):6-8.

[2] 婁忠子,劉聰暖,賈萬忠,等.分枝桿菌分型三重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī),2016,43(1):8-15.

[3] 車洋,于梅,平國華,等.耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株rpsL 基因特征分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2016,26(3):311-313.

[4] Lee HR,Kim SY,Chang HE,et al.Novel multiplex PCR using dual-primingolig onucleotides for detection and discrimination of the Mycobacterium tuberculosis complex and M.bovis BCG[J].J Clin Microbiol,2010,48(12):4612-4614.

[5] Shah DH,Verma R,Bakshi CS,et al.A multiplex-PCR for the differentiation of Mycobacterium bovis and Mycobacterium tuberculosis[J].FEMS Microbiol Lett,2002,214(1):39-43.

[6] 包維華,劉毅,黃曙海,等.LAMP與RT-PCR法檢測痰結(jié)核分枝桿菌的效果比較[J].廣西醫(yī)學(xué),2012,34(2):160-163.

[7] 楊敏,王慧黨,于潞,等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測牛奶中結(jié)核分枝桿菌條件的優(yōu)化[J].中國畜牧獸醫(yī),2016,43(7):1688-1693.

[8] 陳濤,周琳,周杰,等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法快速檢測結(jié)核分枝桿菌的臨床應(yīng)用評估[J].中國防癆雜志2012,34(7):413-418.

[9] 沈會平,張耀祺,楊堅,等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)快速檢測結(jié)核分枝桿菌核酸[J].臨床檢驗雜志,2011,29(5):378-380.

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.047

肇慶市科技創(chuàng)新計劃項目(No 00189901150419047)

1. 526020 廣東 肇慶，肇慶市結(jié)核病防治所檢驗科 2. 520061 廣東 肇慶，肇慶學(xué)院醫(yī)院檢驗科 3. 526070 廣東 肇慶，肇慶市鼎湖區(qū)人民醫(yī)院二門診部

WHO 2015年制定戰(zhàn)略的目標(biāo)，是在2015-2035年將結(jié)核病死亡率降低95%，將新發(fā)病例減少90%。而我國是全球22個高負(fù)擔(dān)國家之一，僅次于印度，位居世界第二[1]， 近年仍有近50萬人感染耐多藥Mtb。目前結(jié)核病防治診斷主要依賴臨床表現(xiàn)，影象學(xué)和實驗室的診斷，而Mtb復(fù)合群確診以羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法為主要的可靠手段。但Mtb生長緩慢的特性(6-8周)，限制了檢出率，隨著實驗室技術(shù)不斷發(fā)展，出現(xiàn)了熒光定量PCR方法，恒溫擴(kuò)增法，LAMP等分子生物學(xué)檢測方法診斷Mtb復(fù)合群。本研究通過對肇慶市結(jié)核病防治所2015年1月-2016年8月587份BBL MGIT 960培養(yǎng)陽性的培養(yǎng)物，用三種方法進(jìn)行Mtb復(fù)合群檢測，對結(jié)果進(jìn)行比較分析和驗證，進(jìn)一步對分子生物學(xué)診斷Mtb復(fù)合群進(jìn)行比較分析。

2017-02-04]