董理想+倪君

[摘要]銀杏葉片提取物對(duì)多種疾病具有治療效果，并已被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐。黃酮類化合物是銀杏葉片提取物的主要活性成分之一，所以研究銀杏黃酮的合成途徑具有非常重要的意義。該綜述首先回顧了植物黃酮生物合成途徑的總體研究概況，并介紹了目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的銀杏黃酮合成相關(guān)基因；其次，介紹了高通量測(cè)序技術(shù)在銀杏研究中的幾個(gè)實(shí)際應(yīng)用。另外，作為銀杏的重要研究方向之一，該綜述討論了外界條件對(duì)銀杏細(xì)胞、整株及采摘后葉片的黃酮含量及相關(guān)基因表達(dá)的影響，并著重介紹了筆者實(shí)驗(yàn)室的最新實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最后，該綜述對(duì)銀杏黃酮領(lǐng)域未來的研究方向做了展望。

[關(guān)鍵詞]銀杏； 黃酮； 基因

Research progress of flavonoid biosynthesis， regulation mechanism and

influence factors in Ginkgo biloba

DONG Lixiang， NI Jun*

（Key Laboratory of Hangzhou City for Quality and Safety of Agricultural Products， College of Life and

Environmental Sciences， Hangzhou Normal University， Hangzhou 310018， China）

[Abstract]The extract of ginkgo leaves showed positive effects on treatments of many diseases， and has been used clinically worldwide Considering the fact that flavonoids are the main bioactive components in the extract of ginkgo leaves， it is very important to investigate the flavonoid biosynthesis in ginkgo leaves In this paper， we first reviewed the research progress of flavonoid biosynthesis in different plants， and introduced the flavonoid biosynthesis related genes discovered in ginkgo Then， several cases of ginkgo researches using high throughput sequencing technology were described in detail In addition， as an important research area in ginkgo， the changes of flavonoid content and the expression of corresponding genes were discussed Specifically， our latest results were described At last， we prospected the development of research area in flavonoid biosynthesis in ginkgo.

[Key words]Ginkgo biloba； flavonoid； gene

黃酮類化合物（flavonoids）是絕大多數(shù)植物共有的一大類次生代謝產(chǎn)物。比如色彩斑斕的花朵，秋天各種顏色的樹葉、果實(shí)和植物種子，都是由屬于黃酮類的色素造成的。目前已知的黃酮類化合物已經(jīng)超過了6 000種，而且這個(gè)數(shù)字還在持續(xù)上升中[1]。黃酮類化合物的生物合成途徑在不同植物中非常保守，并且是植物學(xué)中研究最深入的領(lǐng)域之一[2]。它們的合成起始于苯基丙酸類合成途徑（phenylpropanoid pathway），查爾酮合成酶（chalcone synthase）被認(rèn)為是第一個(gè)參與黃酮合成的酶，產(chǎn)生的查爾酮?jiǎng)t是所有各種黃酮類化合物的源頭。從查爾酮開始，在后續(xù)各種酶的催化下，形成了不同大類的黃酮類化合物[3]。最后，通過各種基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶的修飾，在黃酮類化合物的骨架上引入糖基化、甲基化或?；揎?，形成了數(shù)量極其龐大的黃酮類化合物[1，4]。

各種黃酮類化合物不僅廣泛參與植物的各項(xiàng)生命活動(dòng)，而且某些種類對(duì)人類很多疾病都具有一定的療效，因此具有廣闊的發(fā)展?jié)摿5]。在已有的各種植物黃酮類制品中，銀杏葉提取物EGB761是最著名的產(chǎn)品之一[6]。銀杏這一古老物種曾經(jīng)一度被認(rèn)為已經(jīng)滅絕，直到后來在中國被重新發(fā)現(xiàn)，因此它又有活化石的美譽(yù)。銀杏的藥用價(jià)值很早就在中國被發(fā)現(xiàn)，并最早記錄在元朝的《食物本草》和《日用本草》中[7]，然而直到1965年才由德國藥物生理學(xué)家真正將銀杏葉提取物用于臨床治療，并最終發(fā)展成商品化的EGB761[6]。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的普及，銀杏黃酮合成的研究進(jìn)入了一個(gè)新階段。本綜述回顧了銀杏黃酮研究的發(fā)展歷史，并結(jié)合最新的研究成果，展望了該領(lǐng)域未來發(fā)展的方向。

1黃酮生物合成途徑的總體研究概況

11擬南芥黃酮合成途徑相關(guān)基因的研究人們很早就在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一類由于種皮缺乏色素沉積而造成透明種皮表型的突變體tt（transparent testa），并將它們的表型用于擬南芥早期遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[8]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，造成這些突變表型的原因是編碼黃酮合成相關(guān)酶的基因發(fā)生了突變。在最早發(fā)現(xiàn)的3個(gè)基因中，編碼查爾酮合成酶（chalcone synthase， CHS）的基因突變?cè)斐闪藅t4表型；查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase， CHI）突變?cè)斐闪藅t5表型；二氫黃酮醇4還原酶（dihydroflavonol 4reductase， DFR）突變?cè)斐闪藅t3表型[910]。利用這些信息，人們第一次得到了黃酮保護(hù)植物免受紫外線傷害的直接證據(jù)：編碼黃酮合成相關(guān)酶的基因突變后，黃酮含量降低，突變體對(duì)紫外敏感[11]。利用這些tt突變體，編碼黃酮合成的許多關(guān)鍵酶基因被克隆出來（表1，圖1）。endprint

往往沒有明顯的表型，所以研究起來就相對(duì)困難得多。例如在最近1個(gè)研究案例中，作者研究了81個(gè)擬南芥品種的黃酮苷含量，發(fā)現(xiàn)某些品種含有1種黃酮苷（flavonol 3Ogentiobioside 7Orhamnoside， F3GG7R），而另一些品種沒有。隨后作者挑選2個(gè)代表品種構(gòu)建重組自交系，最后利用圖位克隆的方法將這個(gè)基因定位出來[18]。由此可見，鑒定這類基因不僅需要更多的工作量，還需要有一定的運(yùn)氣。如果這個(gè)黃酮苷在各個(gè)品種中都有，那就不能用這種構(gòu)建重組自交系的方法來克隆了。由于糖基轉(zhuǎn)移酶研究工作困難重重，所以到目前為止也才鑒定出少數(shù)幾個(gè)[19]。這顯然與植物體內(nèi)大量的黃酮苷種類數(shù)目形成了巨大的反差。說明在黃酮合成這個(gè)巨大的網(wǎng)絡(luò)中還有很多工作需要做。

可能由于鑒定糖基轉(zhuǎn)移酶的工作量很大而意義卻不大，所以目前擬南芥黃酮相關(guān)的工作已經(jīng)逐漸由黃酮合成轉(zhuǎn)向黃酮功能的研究。由于黃酮的抗氧化活性，人們自然想到黃酮可能在植物抵御生物或非生物脅迫中具有一定的功能，因?yàn)檫@些逆境脅迫往往伴隨著植物體內(nèi)活性氧濃度的上升。事實(shí)上也確實(shí)如此，目前已有大量的研究證明，黃酮在植物抵御各種逆境脅迫中發(fā)揮了重要作用[11，2022]。有意思的是，黃酮還在擬南芥其他生命活動(dòng)，比如在生長(zhǎng)素運(yùn)輸中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[23]，但由于這些都不在主題范圍內(nèi)，故不做深入討論。

12其他物種的黃酮合成途徑研究在植物由水生轉(zhuǎn)向陸生的進(jìn)化過程中，要面對(duì)來自陸地的干旱、氧化和紫外線等各種環(huán)境脅迫。因此，最原始的陸生植物——苔蘚，也普遍含有黃酮類化合物來應(yīng)對(duì)來自陸地的各種威脅[24]?？墒怯捎谔μ\類植物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值尚未被充分開發(fā)，再加上它在植物進(jìn)化過程中的特殊地位，所以關(guān)于苔蘚黃酮合成途經(jīng)的研究基本都集中在分子進(jìn)化比較上[25]。另一方面，由于黃酮含量和很多農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)密切相關(guān)，所以經(jīng)濟(jì)作物的黃酮合成途徑被大量研究。

不同于擬南芥和苔蘚等模式植物，經(jīng)濟(jì)作物的黃酮合成途徑研究一般都是以應(yīng)用導(dǎo)向型為主。人們通過研究它們的黃酮合成途徑，期望改善農(nóng)產(chǎn)品的色澤，口感，營養(yǎng)價(jià)值等指標(biāo)，從而獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益。葡萄酒因富含黃酮類化合物而對(duì)人體具有重要的生理保健功效，所以葡萄的黃酮合成研究相對(duì)比較深入。在葡萄中，不僅編碼各種黃酮合成酶的基因已經(jīng)被鑒定并克隆出來，而且調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄因子家族也已被發(fā)現(xiàn)，它們共同組成了一個(gè)調(diào)控葡萄黃酮合成途徑的網(wǎng)絡(luò)[26]。目前，很多葡萄黃酮合成途徑的研究集中于不同環(huán)境因子對(duì)黃酮合成基因的調(diào)控及對(duì)后續(xù)黃酮含量的影響[2728]。研究者期望揭示各種環(huán)境因子影響葡萄黃酮含量的內(nèi)在機(jī)理，并最終改善葡萄酒的品質(zhì)。蘋果是世界上最重要的水果之一，它被廣泛種植并大量消費(fèi)。臨床研究表明，食用蘋果能有效降低某些癌癥，心血管疾病，糖尿病等多種疾病，而黃酮類化合物則是蘋果的重要有效成分之一[29]。已有研究表明，不同品種蘋果的黃酮成分及含量差異很大，而且還隨著不同的栽培條件而有所變化[3031]。另外，蘋果的黃酮合成途徑研究也已經(jīng)較為深入，不僅合成途徑中的關(guān)鍵基因被克隆出來，而且這些基因的表達(dá)情況已經(jīng)被用于解釋蘋果不同的生理現(xiàn)象 [3233]。

2銀杏黃酮合成相關(guān)基因的克隆鑒定

由于銀杏黃酮明確的藥用價(jià)值，其合成途徑的研究具有重要的意義，也取得了較大的進(jìn)展。2004年，第一個(gè)銀杏黃酮合成相關(guān)的基因，查爾酮合成酶基因（GbCHS）被鑒定出來。它編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列和其他物種的CHS序列非常相似，說明它們可能具有類似的功能。與它最接近的是裸子植物的CHS序列，說明了它們?cè)谶M(jìn)化上的親緣關(guān)系[34]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該基因在銀杏中可能有多個(gè)拷貝，因?yàn)橛肎bCHS基因序列作為探針做的Southern雜交出現(xiàn)了多個(gè)條帶[35]。果然，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE），有研究者克隆了第二個(gè)查爾酮合成酶基因，并命名為GbCHS2。這2個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列具有高度的同源性，暗示它們?cè)诠δ苌峡赡芫哂幸欢ǖ娜哂郲36]。作為黃酮合成過程中的重要基因，它的表達(dá)方式自然也是人們感興趣的對(duì)象。為了更好地研究這一點(diǎn)，GbCHS基因的啟動(dòng)子序列被克隆出來，分段接上報(bào)告基因（GUS）轉(zhuǎn)入煙草中。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色，GbCHS基因啟動(dòng)子中的一段重要序列被發(fā)現(xiàn)，它對(duì)于GbCHS基因響應(yīng)各種外界刺激具有重要作用[37]。

查爾酮異構(gòu)酶（CHI）也是黃酮合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶。有研究者利用簡(jiǎn)并引物成功克隆出銀杏中編碼查爾酮異構(gòu)酶的基因，GbCHI。該基因的表達(dá)受紫外線和多種激素的誘導(dǎo)，在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白具有查爾酮異構(gòu)酶的活性，即能夠催化6′羥基查爾酮（6′hydroxychalcone）向柚皮素（naringenin）的轉(zhuǎn)化。在銀杏葉片中該基因的表達(dá)強(qiáng)度與查爾酮異構(gòu)酶的活性，及葉片的黃酮含量呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。這些結(jié)果都說明克隆到的基因確實(shí)是銀杏中編碼查爾酮異構(gòu)酶的基因[38]。利用類似的方法，更多的黃酮合成相關(guān)基因被鑒定出來（表2）。不過這些研究基本都僅限于同源克隆，體外酶活分析，基因表達(dá)和黃酮含量的協(xié)同分析等階段。研究深度較淺，都還沒有用擬南芥突變體互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)來證明它們?cè)隗w內(nèi)的真正功能。

目前，除了上述編碼黃酮合成相關(guān)酶的基因外，還有一個(gè)編碼調(diào)控銀杏黃酮合成的轉(zhuǎn)錄因子被鑒定出來。GbMYBF2在銀杏各處都有表達(dá)，且在根部表達(dá)量最高（根部的黃酮含量最低）。在葉片的生長(zhǎng)過程中，GbMYBF2的表達(dá)量和葉片的黃酮含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果暗示GbMYBF2可能編碼銀杏黃酮合成過程中的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。為了進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)猜測(cè)，該基因被接上過量表達(dá)的啟動(dòng)子，并轉(zhuǎn)入擬南芥。果然，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中，不僅黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)下降，體內(nèi)的黃酮含量也降低了。這說明GbMYBF2確實(shí)在銀杏黃酮合成途徑中擔(dān)任負(fù)調(diào)控因子的角色[43]。

雖然到目前為止很多銀杏黃酮合成相關(guān)的基因已經(jīng)被克隆，但是針對(duì)它們的研究深度都比較淺，所以還沒有發(fā)現(xiàn)銀杏中的新機(jī)制。endprint

3高通量測(cè)序浪潮下的銀杏基因研究

隨著高通量測(cè)序的成本越來越低，很多物種的研究都采用了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的手段，銀杏也不例外。最早的一批轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自銀杏的無菌苗。這次的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到了39 941個(gè)具有蛋白編碼序列的特異轉(zhuǎn)錄片段，其中的24 645個(gè)片段在以前的數(shù)據(jù)庫中有記錄。另外，有50個(gè)片段編碼的蛋白可能參與了銀杏黃酮合成途徑。有意思的是，這次測(cè)序還找到一個(gè)編碼查爾酮異構(gòu)酶的基因，且這個(gè)基因和先前報(bào)道的那個(gè)GbCHI不同，所以將其命名為GbCHI1[44]。同年，另一個(gè)課題組發(fā)表了銀杏果轉(zhuǎn)錄組的成果。他們利用高通量測(cè)序研究銀杏果在發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄組變化。這次研究一共找到了68 547個(gè)基因，其中3 869個(gè)基因的表達(dá)量在銀杏果的發(fā)育過程中發(fā)生明顯變化?？上У氖牵m然這個(gè)研究詳細(xì)討論了很多基因的注釋和表達(dá)情況，但對(duì)于黃酮合成相關(guān)基因卻沒有涉及[45]。由于銀杏雌雄異株，所以有課題組試圖通過研究雌芽，雄芽，雌性大孢子葉球和雄性小孢子葉球之間的轉(zhuǎn)錄組差異來尋找決定銀杏性別的關(guān)鍵基因。雖然最終并沒有找到那個(gè)基因，但是在研究過程中一共得到了108 307個(gè)基因，其中51 953個(gè)基因在公共數(shù)據(jù)庫中找到了注釋。可惜的是，這次的研究和上述一樣，并沒有涉及黃酮合成相關(guān)的基因[46]。

與此同時(shí)，銀杏全基因組測(cè)序工作也開始啟動(dòng)。經(jīng)過競(jìng)爭(zhēng)，最終來自浙江大學(xué)、中國科學(xué)院植物所和深圳華大基因研究院的聯(lián)合團(tuán)隊(duì)率先發(fā)表了銀杏全基因組的測(cè)序結(jié)果[47]。該結(jié)果顯示，銀杏具有1061 Gb的基因組，包含了41 840個(gè)基因。長(zhǎng)期的積累（銀杏是一個(gè)古老的物種，被稱為活化石）和2次全基因組倍增（whole genome duplication， WGD）造成了銀杏巨大的基因組，并含有大量的長(zhǎng)末端重復(fù)序列的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（long terminal repeat retrotransposons， LTRRTs）。另外，該研究還發(fā)現(xiàn)了銀杏黃酮合成途徑中的四類基因發(fā)生了基因倍增事件，它們是CHS，F(xiàn)3H，F(xiàn)LS和DFR。這些倍增的基因可能部分解釋了銀杏體內(nèi)豐富的黃酮含量和較強(qiáng)的抗病性[47]。

4外界條件對(duì)銀杏黃酮含量及相關(guān)基因表達(dá)的影響

相比較于銀杏復(fù)雜的黃酮合成途徑，人們更關(guān)心如何才能提高銀杏體內(nèi)的黃酮含量，所以大量的工作集中到提高銀杏黃酮含量的方法研究上。本實(shí)驗(yàn)室早期的研究關(guān)注于外界刺激對(duì)銀杏細(xì)胞系黃酮含量的影響。水楊酸（salicylic acid， SA）和茉莉酸（jasmonic acid， JA）信號(hào)在真菌激發(fā)子（fungal elicitor）誘導(dǎo)的黃酮合成中起了中介作用，且它們的功能部分互補(bǔ)[48]。另外，臭氧能夠誘導(dǎo)銀杏細(xì)胞的黃酮合成，且該過程依賴于硝酸還原酶介導(dǎo)的NO信號(hào)[49]。

由于細(xì)胞系的結(jié)果并不一定能如實(shí)反映銀杏體內(nèi)真實(shí)的變化，所以更多的工作建立在銀杏樹的生理研究上。銀杏葉片的采摘時(shí)間在制藥行業(yè)中有一定的規(guī)范，有研究者對(duì)不同時(shí)期采摘的銀杏葉片進(jìn)行黃酮含量分析。利用高效液相色譜（HPLC），該研究者發(fā)現(xiàn)5月份采摘的銀杏葉片黃酮含量最高，以后逐月遞減，深秋掉落的葉片黃酮含量最低。另外，該研究還發(fā)現(xiàn)雄樹葉片的黃酮含量一般比來自雌樹的高一些[50]。有意思的是，另一項(xiàng)來自印度的卻研究表明，銀杏葉片的黃酮含量和采摘的季節(jié)并沒有顯著的關(guān)聯(lián)，7月份和11月份采摘葉片的黃酮含量差不多[51]。造成這個(gè)問題的原因可能是不同的氣候條件造成的。印度地處熱帶，常年高溫，沒有分明的四季，所以導(dǎo)致了不同時(shí)期采摘的葉片具有差不多的黃酮含量。所以不同地區(qū)因地制宜地研究銀杏最佳采摘時(shí)間還是有必要的。光照強(qiáng)度也會(huì)對(duì)銀杏葉片的黃酮含量產(chǎn)生影響。有研究者利用玻璃溫室的陽光遮擋，制造出了25%～100%不同的陽光強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在100%陽光強(qiáng)度下，銀杏葉片的黃酮含量最高，同時(shí)銀杏黃酮合成相關(guān)基因（GbPAL， GbCHS， GbF3H和GbFLS）的表達(dá)量也達(dá)到最高。可是在黃酮產(chǎn)量方面，100%的光照強(qiáng)度卻不是最合適的，而是在76%光照強(qiáng)度下達(dá)到最高。因?yàn)樵谶@個(gè)光照強(qiáng)度下，銀杏生物量的增加是最大的。此時(shí)雖然黃酮的含量不是最高，但單位面積的產(chǎn)量卻達(dá)到最高[52]。還有研究者在人工氣候室內(nèi)采用土培盆栽的方法探索了不同溫度和土壤水分對(duì)銀杏葉片黃酮含量的影響。他們發(fā)現(xiàn)雖然低溫能夠提高葉片的黃酮含量，但是由于高溫下銀杏的生物量最大，所以高溫下銀杏單株總黃酮含量卻是最高。另外，土壤水分對(duì)黃酮含量影響不大[53]。有意思的是，另一項(xiàng)研究卻發(fā)現(xiàn)了水分和黃酮含量之間的關(guān)系。根系分區(qū)灌溉技術(shù)（partial rootzoom irrigation）是香港中文大學(xué)的張建華教授發(fā)明并推廣的一項(xiàng)新型節(jié)水灌溉技術(shù)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面具有巨大的應(yīng)用價(jià)值[54]。 有研究者將此項(xiàng)技術(shù)推廣到銀杏黃酮合成領(lǐng)域，并取得了很好的效果。他們發(fā)現(xiàn)，銀杏在根系分區(qū)灌溉技術(shù)處理下，葉片的黃酮含量顯著升高[55]。另外，昆蟲的啃食也能提高銀杏黃酮的含量。有研究表明，昆蟲的啃食會(huì)導(dǎo)致銀杏葉片細(xì)胞的去極化，并伴隨胞內(nèi)鈣離子和雙氧水濃度的升高，同時(shí)銀杏黃酮的含量也出現(xiàn)了顯著升高。有意思的是，并不是所有黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)都是上調(diào)的，比如編碼黃酮醇合酶的基因GbFLS表達(dá)就出現(xiàn)了下調(diào)。目前，造成這種基因表達(dá)和終產(chǎn)物濃度情況不一致的具體原因還不清楚[56]。綜上所述，雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種方法都能提高銀杏樹葉片的黃酮含量，但是由于它們較少涉及到基因?qū)用妫匝芯可疃炔粔?，很難從機(jī)理上進(jìn)行改進(jìn)而進(jìn)一步提高黃酮的含量。

另一方面，由于采摘后的銀杏葉片細(xì)胞仍具有活性，所以適當(dāng)處理采摘后的葉片也可能提高其黃酮含量。這種方法易于進(jìn)行大規(guī)模操作，具有可快速應(yīng)用于制藥工業(yè)的可能性，所以本實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)研究方向就是采摘后處理銀杏葉片以提高其黃酮含量的研究。采摘后的葉片經(jīng)過紫外（UVB）照射處理能夠顯著增加葉片的黃酮含量?；虮磉_(dá)檢測(cè)顯示，銀杏黃酮合成相關(guān)的基因都能夠被紫外照射上調(diào)，且黃酮合成的負(fù)調(diào)控因子GbMYBF2的表達(dá)下調(diào)[57]。這個(gè)結(jié)果符合預(yù)期，因?yàn)橛蓄愃频膶?shí)驗(yàn)得出了相同的結(jié)果[58]。另外，本實(shí)驗(yàn)室還研究了其他環(huán)境因子對(duì)葉片黃酮含量的影響，最后發(fā)現(xiàn)，NaCl處理同樣能夠增加采摘后葉片的黃酮含量?？墒钱?dāng)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)黃酮合成相關(guān)的基因卻是下調(diào)的，并且GbMYBF2表達(dá)上調(diào)。這個(gè)結(jié)果和預(yù)期完全相反。有意思的是，當(dāng)直接用NaCl處理銀杏苗時(shí)，其黃酮含量升高，合成相關(guān)的基因表達(dá)也升高，GbMYBF2表達(dá)降低，這個(gè)結(jié)果又和原先的預(yù)期一致。綜上所述，葉片采摘后的狀態(tài)可能和自然生長(zhǎng)的狀態(tài)有差別，研究者不能簡(jiǎn)單地套用過去的植物生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果來預(yù)測(cè)采摘后銀杏葉片的生理反應(yīng) [57]。endprint

5展望

目前擬南芥黃酮合成途徑的研究已經(jīng)比較清楚，剩下的只有最后一步負(fù)責(zé)各種修飾的基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶編碼基因的鑒定[19]。但是銀杏黃酮合成基因的研究目前還停留在傳統(tǒng)的擬南芥同源基因的克隆層面。這種方法雖然有一定的效果，但是很難找全所有的基因。已經(jīng)有越來越多的證據(jù)表明，不同于擬南芥的單拷貝基因，在銀杏黃酮合成途徑中，每一步的反應(yīng)都可能由一個(gè)基因家族控制。在NaCl處理采摘后銀杏葉片的實(shí)驗(yàn)中，雖然黃酮含量顯著升高，但是黃酮合成基因的表達(dá)卻下降。因此，必然存在另一條還不知道的途徑，而這條途徑則伴隨著黃酮合成的新基因[57]。所以徹底研究銀杏黃酮合成途徑每個(gè)步驟的所有基因成了下一步要完成的目標(biāo)。最近銀杏的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，結(jié)果也已經(jīng)公布[47]。雖然目前還看不到基因注釋的詳細(xì)結(jié)果，但是不久以后，一張更加詳細(xì)的全新銀杏黃酮合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將出現(xiàn)在大家面前。

目前銀杏黃酮的利用還局限于葉片的總黃酮提取物，對(duì)其中某些成分進(jìn)行分離提取的需求還比較少。銀杏葉片目前已經(jīng)被鑒定出含有70多種黃酮，其中的30多種已經(jīng)被分離出來[59]。而在這么多種類的銀杏黃酮中，并不是所有的成分都是具有藥用價(jià)值的。已經(jīng)有研究表明，不同種類的銀杏黃酮對(duì)細(xì)胞具有不同的作用[60]。所以未來的銀杏黃酮研究將朝著精細(xì)化的方向發(fā)展，人們將關(guān)注某些銀杏黃酮的變化而不是總黃酮。所以在未來的實(shí)驗(yàn)中，用HPLC技術(shù)鑒定每種銀杏黃酮對(duì)各種處理的反應(yīng)將逐步取代酸化水解后的總黃酮測(cè)定。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Ferrer J L， Austin M B， Stewart C J， et al. Structure and function of enzymes involved in the biosynthesis of phenylpropanoids[J]. Plant Physiol Biochem， 2008， 46（3）：356.

[2]WinkelShirley B It takes a garden How work on diverse plant species has contributed to an understanding of flavonoid metabolism[J]. Plant Physiol， 2001， 127（4）：1399.

[3]Martens S， Preuss A， Matern U Multifunctional flavonoid dioxygenases：flavonol and anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis thaliana L.[J]. Phytochemistry， 2010， 71（10）：1040.

[4]Bowles D， Isayenkova J， Lim E K， et al. Glycosyltransferases：managers of small molecules[J]. Curr Opin Plant Biol， 2005， 8（3）：254.

[5]Lu M F， Xiao Z T， Zhang H Y. Where do health benefits of flavonoids come from？ Insights from flavonoid targets and their evolutionary history[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2013， 434（4）：701.

[6]De Feudis F V A brief history of EGb 761 and its therapeutic uses[J]. Pharmacopsychiatry， 2003， 36（Suppl 1）：S2.

[7]Tredici P D Ginkgos and peoplea thousand years of interaction[J]. Arnoldia（Boston）， 1991， 51（2）：2.

[8]Koornneef M， van Eden J， Hanhart C J， et al. Linkage map of Arabidopsis thaliana[J]. J Hered， 1983， 74：265.

[9]Chang C， Bowman J L， DeJohn A W， et al. Restriction fragment length polymorphism linkage map for Arabidopsis thaliana[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1988， 85（18）：6856.

[10]Shirley B W， Hanley S， Goodman H M Effects of ionizing radiation on a plant genome：analysis of two Arabidopsis transparent testa mutations[J]. Plant Cell， 1992， 4（3）：333.

[11]Li J， OuLee T M， Raba R， et al. Arabidopsis flavonoid mutants are hypersensitive to UVB irradiation[J]. Plant Cell， 1993， 5（2）：171.

[12]Shirley B W， Kubasek W L， Storz G， et al. Analysis of Arabidopsis mutants deficient in flavonoid biosynthesis[J]. Plant J， 1995， 8（5）：659.endprint

[13]Pelletier M K， Shirley B W Analysis of flavanone 3hydroxylase in Arabidopsis seedlings（Coordinate regulation with chalcone synthase and chalcone isomerase）[J]. Plant Physiol， 1996， 111（1）：339.

[14]Pelletier M K， Murrell J R， Shirley B W， Characterization of flavonol synthase and leucoanthocyanidin dioxygenase genes in Arabidopsis （further evidence for differential regulation of "early" and "late" genes）[J]. Plant Physiol， 1997， 113（4）：1437.

[15]Owens D K， Alerding A B， Crosby K C， et al Functional analysis of a predicted flavonol synthase gene family in Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2008， 147（3）：1046.

[16]Schoenbohm C， Martens S， Eder C， et al. Identification of the Arabidopsis thaliana flavonoid 3′hydroxylase gene and functional expression of the encoded P450 enzyme[J]. Biol Chem， 2000， 381（8）：749.

[17]Devic M， Guilleminot J， Debeaujon I， et al The BANYULS gene encodes a DFRlike protein and is a marker of early seed coat development[J]. Plant J， 1999， 19（4）：387.

[18]Ishihara H， Tohge T， Viehover P， et al Natural variation in flavonol accumulation in Arabidopsis is determined by the flavonol glucosyltransferase BGLU6[J]. J Exp Bot， 2016， 67（5）：1505.

[19]Schffner A R Flavonoid biosynthesis and Arabidopsis genetics：more good music[J]. J Exp Bot， 2016， 67（5）：1203.

[20]Keilig K， LudwigMüller J Effect of flavonoids on heavy metal tolerance in Arabidopsis thaliana seedlings[J]. Bot Stud， 2009， 50（3）：311.

[21]Nakabayashi R， YonekuraSakakibara K， Urano K， et al. Enhancement of oxidative and drought tolerance in Arabidopsis by overaccumulation of antioxidant flavonoids[J]. Plant J， 2014， 77（3）：367.

[22]Schulz E， Tohge T， Zuther E， et al. Flavonoids are determinants of freezing tolerance and cold acclimation in Arabidopsis thaliana[J]. Sci Rep， 2016， 6：34027.

[23]Kuhn B M， Geisler M， Bigler L， et al. Flavonols accumulate asymmetrically and affect auxin transport in Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2011， 156（2）：585.

[24]Markham K R The flavonoids[M] Berlin：Springer， 1988：427.

[25]Liu S， Ju J， Xia G Identification of the flavonoid 3′hydroxylase and flavonoid 3′， 5′hydroxylase genes from Antarctic moss and their regulation during abiotic stress[J] Gene， 2014， 543（1）：145.

[26]Czemmel S， Heppel S C， Bogs J R2R3 MYB transcription factors：key regulators of the flavonoid biosynthetic pathway in grapevine[J] Protoplasma， 2012， 249（2）：109.

[27]MartínezLüscher J， SánchezDíaz M， Delrot S， et al. UltravioletB radiation and water deficit interact to alter flavonol and anthocyanin profiles in grapevine berries through transcriptomic regulation[J] Plant Cell Physiol， 2014， 55（11）：1925.endprint

[28]Downey M O， Dokoozlian N K， Krstic M P Cultural practice and environmental impacts on the flavonoid composition of grapes and wine：a review of recent research[J] Am J Enol Viticult， 2006， 57（3）：257.

[29]Boyer J， Liu R H Apple phytochemicals and their health benefits[J] J Nutr， 2004， 3（1）：5.

[30]Vinson J A， Su X， Zubik L， et al. Phenol antioxidant quantity and quality in foods：fruits[J] J Agric Food Chem， 2001， 49（11）：5315.

[31]Vrhovsek U， Rigo A， Tonon D， et al. Quantitation of polyphenols in different apple varieties[J] J Agric Food Chem， 2004， 52（21）：6532.

[32]Honda C， Kotoda N， Wada M， et al. Anthocyanin biosynthetic genes are coordinately expressed during red coloration in apple skin[J] Plant Physiol Bioch， 2002， 40（11）：955.

[33]HenryKirk R A， McGhie T K， Andre C M， et al. Transcriptional analysis of apple fruit proanthocyanidin biosynthesis[J] J Exp Bot， 2012， 63（15）：5437.

[34]Pang Y， Shen G A， Liu C， et al. Molecular cloning and sequence analysis of a novel chalcone synthase cDNA from Ginkgo biloba[J]. DNA Seq， 2004， 15（4）：283.

[35]Pang Y， Shen G， Wu W， et al. Characterization and expression of chalcone synthase gene from Ginkgo biloba[J]. Plant Sci， 2005， 168（6）：1525.

[36]Xu F， Cheng S Y， Cheng S H， et al. Time course of expression of chalcone synthase gene in Ginkgo biloba[J]. J Plant Physiol Mol Biol， 2007， 33（4）：309.

[37]Li L， Cheng H， Yuan H， et al. Functional characterization of the Ginkgo biloba chalcone synthase gene promoter in transgenic tobacco[J]. Genet Mol Res， 2014， 13：3446.

[38]Cheng H， Li L， Cheng S， et al. Molecular cloning and function assay of a chalcone isomerase gene（GbCHI）from Ginkgo biloba[J]. Plant Cell Rep， 2010， 30（1）：49.

[39]Shen G， Pang Y， Wu W， et al. Cloning and characterization of a flavanone 3hydroxylase gene from Ginkgo biloba[J]. Biosci Rep， 2006， 26（1）：19.

[40]Xu F， Li L， Zhang W， et al. Isolation， characterization， and function analysis of a flavonol synthase gene from Ginkgo biloba[J]. Mol Biol Rep， 2011， 39（3）：2285.

[41]Hua C， Linling L， Shuiyuan C， et al. Molecular cloning and characterization of three genes encoding dihydroflavonol4reductase from Ginkgo biloba in anthocyanin biosynthetic pathway[J]. PLoS ONE， 2013， 8（8）：e72017.

[42]Xu F， Cheng H， Cai R， et al. Molecular cloning and function analysis of an anthocyanidin synthase gene from Ginkgo biloba， and its expression in abiotic stress responses[J]. Mol Cells， 2008， 26（6）：536.endprint

[43]Xu F， Ning Y， Zhang W， et al. An R2R3MYB transcription factor as a negative regulator of the flavonoid biosynthesis pathway in Ginkgo biloba[J]. Funct Integr Genomics， 2014， 14（1）：177.

[44]Han S， Wu Z， Jin Y， et al. RNASeq analysis for transcriptome assembly， gene identification， and SSR mining in ginkgo（Ginkgo biloba L）[J]. Tree Genet Genomes， 2015， 11（3）：37.

[45]He B， Gu Y， Xu M， et al. Transcriptome analysis of Ginkgo biloba kernels[J]. Front Plant Sci， 2015， 6：819.

[46]Du S， Sang Y， Liu X， et al. Transcriptome profile analysis from different sex types of Ginkgo biloba L[J]. Front Plant Sci， 2016， 7：871.

[47]Guan R， Zhao Y， Zhang H， et al Draft genome of the living fossil Ginkgo biloba[J]Gigascience， 2016， 5（1）：49.

[48]Xu M， Dong J， Wang H， et al. Complementary action of jasmonic acid on salicylic acid in mediating fungal elicitorinduced flavonol glycoside accumulation of Ginkgo biloba cells[J]. Plant Cell Environ， 2009， 32（8）：960.

[49]Xu M， Zhu Y， Dong J， et al. Ozone induces flavonol production of Ginkgo biloba cells dependently on nitrate reductasemediated nitric oxide signaling[J]. Environ Exp Bot， 2012， 75：114.

[50]Fan Y， Wang Y， Tan R， et al. Seasonal and sexual variety of Ginkgo flavonol glycosides in the leaves of Ginkgo biloba L[J]. China J Chin Mater Med， 1998， 23（5）：267.

[51]Kaur P， Chaudhary A， Singh R D， et al. Spatial and temporal variation of secondary metabolite profiles in Ginkgo biloba leaves[J]. Chem Biodivers， 2012， 9（2）：409.

[52]Xu Y， Wang G， Cao F， et al. Light intensity affects the growth and flavonol biosynthesis of Ginkgo（Ginkgo biloba L）[J]. New Forest， 2014， 45（6）：765.

[53]汪貴斌，郭旭琴，常麗，等. 溫度和土壤水分對(duì)銀杏葉黃酮類化合物積累的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2013， 24（11）：3077.

[54]Marris E Agronomy：five crop researchers who could change the world[J]. Nature， 2008， 456（7222）：563.

[55]Wang L， Shi H， Wu J， et al. Alternative partial rootzone irrigation enhances leaf flavonoid accumulation and water use efficiency of Ginkgo biloba[J]. New Forest， 2016， 47（3）：377.

[56]Mohanta T K， Occhipinti A， Zebelo S A， et al. Ginkgo biloba responds to herbivory by activating early signaling and direct defenses[J] PLoS ONE， 2012， 7（3）：e32822.

[57]Ni J， Hao J， Jiang Z， et al. NaCl induces flavonoid biosynthesis through a putative novel pathway in postharvest Ginkgo leaves[J]. Front Plant Sci， 2017， 8：920.

[58]Sun M， Gu X， Fu H， et al. Change of secondary metabolites in leaves of Ginkgo biloba L in response to UVB induction[J]. Innov Food Sci Emerg， 2010， 11（4）：672.

[59]Liu X G， Wu S Q， Li P， et al. Advancement in the chemical analysis and quality control of flavonoid in Ginkgo biloba[J]. J Pharm Biomed Anal， 2015， 113：212.

[60]Xie H， Wang J R， Yau L F， et al. Quantitative analysis of the flavonoid glycosides and terpene trilactones in the extract of Ginkgo biloba and evaluation of their inhibitory activity towards fibril formation of betaamyloid peptide[J]. Molecules， 2014， 19（4）：4466.

[責(zé)任編輯丁廣治]endprint