馬致潔 張祎 董捷鳴 于小紅 趙小梅 浦仕彪

[摘要]該文運(yùn)用代謝組學(xué)的技術(shù)手段尋找與姜黃素干預(yù)抑郁模型大鼠相關(guān)的潛在標(biāo)志物，從而探究姜黃素用于抗抑郁的作用機(jī)制。選取健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組，采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（CUMS）刺激造模，造模2周后灌胃姜黃素（200 mg·kg-1）、文拉法辛（40 mg·kg-1）、空白組和模型組同時(shí)灌等體積的1% CMCNa生理鹽水，每天1次，連續(xù)2周。采集大鼠血清并采用LC/MSITTOF方法對(duì)各組血清代謝差異進(jìn)行表征，利用多元統(tǒng)計(jì)分析方法篩選出可能的潛在生物標(biāo)志物并分析其可能的代謝通路。在分別給予姜黃素和文拉法辛后，CUMS模型組大鼠的抑郁各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著性改善（P<005），但姜黃素和文拉法辛組之間則無(wú)明顯差異；通過(guò)PCA和PLSDA分析，經(jīng)姜黃素或文拉法辛干預(yù)后，CUMS模型組大鼠體內(nèi)的小分子代謝物水平體現(xiàn)出恢復(fù)正常的趨勢(shì)，而且姜黃素組尤為明顯；通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)手段，從中篩選得到11個(gè)與姜黃素抗抑郁功效相關(guān)的生物標(biāo)志物，同時(shí)涉及到7條代謝通路。研究表明姜黃素具有確切的抗抑郁作用，其在宏觀和微觀層面均有體現(xiàn)，可與陽(yáng)性藥物文拉法辛相比；姜黃素在體內(nèi)可能是通過(guò)影響甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯互變及醚脂類代謝等發(fā)揮抗抑郁功效，今后還需進(jìn)一步探索。

[關(guān)鍵詞]姜黃素； 抗抑郁； 代謝組學(xué)； 生物標(biāo)志物； CUMS模型

Preliminary screening of biomarkers for curcumin′s antidepressant

effect based on metabonomics method

MA Zhijie1，2， ZHANG Wei1， DONG Jieming2， YU Xiaohong2， ZHAO Xiaomei2， PU Shibiao1*

（1 College of Pharmaceutical Science， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China；

2. Beijing Friendship Hospital， Capital Medical， Beijing 100050， China）

[Abstract]To screen potential biomarkers of curcumin related to treating depression rats by using metabolomics means， so as to explore the antidepressant action mechanism of curcumin The healthy male SD rats were randomly divided into four groups Chronic unpredictable mild stress （CUMS） stimulation was conducted for modeling for 2 weeks， and then curcumin （200 mg·kg-1） or venlafaxine （40 mg·kg-1） was given by gavage administration The blank group and model group rats were given with the same volume of 1% CMCNa normal saline， once per day for two weeks The rats serum for each group was collected and LC/MSITTOF method was used to characterize the metabolic differences Also multivariate statistical analysis was used to screen possible potential biomarkers and analyze the possible metabolic pathways After administration of curcumin and venlafaxine respectively， the depression indexes of CUMS model rats were all improved significantly （P<005）， but there were no significant differences between curcumin and venlafaxine groups In PCA and PLSDA analysis after curcumin or venlafaxine intervention on CUMS model group rats， the small molecule metabolites level reflects a normal trend， and particularly for the curcumin group Through metabonomics technology， 11 biomarkers associated with curcumin antidepressant effect were screened， and at the same time seven metabolic pathways were involved The results showed that curcumin had antidepressant effects， which was evident in both macro and micro levels， comparable with positive drug of venlafaxine The antidepressant effect of curcumin may be associated with the glycerol phospholipid metabolism， linoleic acid metabolism， pentose and glucuronic acid ester and ether lipid metabolism， but still need further exploration in the future.endprint

[Key words]curcumin； antidepressant； metabonomics； biomarkers； CUMS model

姜黃為姜科植物姜黃Curcuma longa L的干燥根莖。主產(chǎn)于中國(guó)、印度、日本等國(guó)家，是臨床常用中藥。姜黃素（curcumin）則是從姜科植物姜黃屬姜黃、莪術(shù)、郁金等根莖中提取得到的1種天然黃色色素，為小分子植物酸性多酚，其分子式為C21H20O6，相對(duì)分子質(zhì)量 36837。近年來(lái)大量的研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗嘔吐、抗纖維化、抗人類免疫缺陷病毒保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用，其藥理藥效十分廣泛[1]。近年來(lái)，PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)上收錄的有關(guān)姜黃素藥用價(jià)值的文獻(xiàn)數(shù)量也迅速增多，姜黃素成為醫(yī)療保健領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)之一，具有廣闊的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用前景。

研究顯示，姜黃素具有抗抑郁作用，但是抗抑郁的作用機(jī)制仍不清楚[2]。慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激模型是1種經(jīng)典抑郁癥動(dòng)物模型，其理論依據(jù)與人類抑郁癥中慢性、低水平的應(yīng)激源導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生并加速抑郁癥發(fā)展的機(jī)制更為接近[3]。代謝組學(xué)是研究機(jī)體代謝產(chǎn)物變化的1種新的系統(tǒng)生物學(xué)方法，其通過(guò)揭示新陳代謝動(dòng)態(tài)進(jìn)程中代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，較全面了解病理變化過(guò)程及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)、病理機(jī)制研究及藥物療效評(píng)價(jià)中展現(xiàn)了其特色和優(yōu)勢(shì)[46]。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，采用慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激模型評(píng)價(jià)姜黃素的抗抑郁作用，同時(shí)采用LC/MSITTOF方法表征姜黃素干預(yù)抑郁模型大鼠血清內(nèi)源性代謝物的變化差異，通過(guò)主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別（PLSDA）分析，篩選姜黃素抗抑郁作用的內(nèi)源性小分子生物標(biāo)志物，并結(jié)合代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)，探討可能的作用機(jī)制和通路，為進(jìn)一步闡明姜黃素抗抑郁作用機(jī)制提供參考。

1材料與方法

11儀器與試藥高效液相色譜離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（LCMSITTOF，日本島津Shimadzu）；radient A10 MillQ超純水器（美國(guó) Millipore 公司）；冷凍離心機(jī)（Sigma，德國(guó)）；微量分析天平（Mettler Toledo AL204 瑞士）；渦旋混勻器（HYQ 2121A）；自制曠場(chǎng)行為測(cè)試箱（長(zhǎng)寬高為100 cm×100 cm×80 cm）、秒表、電擊儀、烘箱、冰水游泳桶等。色譜柱為Waters XBridgeC18（21 mm×150 mm，35 μm）離子源為ESI±；毛細(xì)管電壓為3 500 V；掃描范圍m/z 50～1 000；碰撞能為7 eV；錐孔能為5 eV；脫溶劑氣流量為60 L·min-1；脫溶劑氣溫度為180 ℃。

甲醇（色譜級(jí)，F(xiàn)isher Scientific）、去離子水經(jīng)（182 MΩ）Millipore MilliQ系統(tǒng)（Millipore Co，美國(guó)）超純水器凈化，其他試劑均為市售分析純。姜黃素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，鹽酸文拉法辛膠囊（25 mg/粒）購(gòu)自成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

12動(dòng)物分組與給藥SD大鼠32只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（180±20） g左右，雄性，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)SCXK軍2014004）。大鼠飼養(yǎng)于屏障動(dòng)物房，室溫（20±2） ℃，相對(duì)濕度60%～70%，通風(fēng)良好、環(huán)境安靜，室內(nèi)保持12 h照明，12 h黑暗，并定期消毒。將SD大鼠隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組、CUMS模型組、姜黃素（200 mg·kg-1）干預(yù)組，鹽酸文拉法辛（40 mg·kg-1）組，每組8只。除空白組外，所有動(dòng)物前2周只造模不給藥，后2周邊造模邊給藥，給藥組分別灌胃相應(yīng)的藥物，空白組和模型組灌胃等量1% CMCNa生理鹽水；其中按照給藥設(shè)定劑量，姜黃素和鹽酸文拉法辛藥物均采用相應(yīng)體積的1% CMCNa生理鹽水進(jìn)行溶解。

13造模方法慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激（CUMS）程序進(jìn)行抑郁造模，造模過(guò)程與參考文獻(xiàn)[79]的方法并加以改進(jìn)。模型組和給藥組給予的刺激因素包括禁食、禁水、4 ℃冰水游泳、50 ℃熱應(yīng)激、夾尾、電擊足底、潮濕墊料和鼠籠傾斜45 °、束縛應(yīng)激、陌生物品、噪音刺激。每日隨機(jī)給予1種刺激，保證在整個(gè)造模過(guò)程中每種刺激累計(jì)使用2～3次，順序隨機(jī)，應(yīng)激持續(xù)28 d。

14體質(zhì)量和糖水偏愛(ài)試驗(yàn)造模第0，7，14，21，28天分別測(cè)定大鼠體質(zhì)量；糖水偏愛(ài)試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[10]，在動(dòng)物造模前1周對(duì)其進(jìn)行糖水偏愛(ài)訓(xùn)練，造模第0，7，14，21，28天分別測(cè)定純水和糖水消耗量，以糖水偏愛(ài)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，糖水偏愛(ài)率=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

15曠場(chǎng)試驗(yàn)分別在造模開(kāi)始前1天和開(kāi)始后第14，28天將單只大鼠放在自制的曠場(chǎng)

箱（長(zhǎng)寬各80 cm，高40 cm）中央，敞箱底分為16個(gè)方格，用黑漆涂滿內(nèi)壁，記錄大鼠5 min內(nèi)的活動(dòng)：觀察指標(biāo)包括中央格停留時(shí)間（自大鼠被放入中央格至大鼠3只爪子跨離開(kāi)該格的時(shí)間，用s計(jì)）、水平格數(shù)（以穿越底面方格數(shù)為其水平得分，穿越1個(gè)格子計(jì)為1分）、垂直運(yùn)動(dòng)（兩前腿離地或爬墻壁計(jì)為1次）、理毛時(shí)間和糞便。并在徹底清潔敞箱后進(jìn)行下只動(dòng)物的測(cè)定[11]。

16樣品采集與處理于末次給藥后，眼眶靜脈取血，分離血清后置于-80 ℃冰箱，檢測(cè)前將大鼠血清于-80 ℃冰箱中取出，復(fù)融，取250 μL加入到15 mL EP管中，再加入750 μL的甲醇溶液，混勻，靜置，4 ℃下冷凍離心，1萬(wàn) r·min-1，10 min，取上清，并用022 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣。

17數(shù)據(jù)處理與分析數(shù)據(jù)以±s表示。運(yùn)用SPSS 180軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）統(tǒng)計(jì)處理，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<005作為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的界限。代謝組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Mzmine 25軟件進(jìn)行色譜峰識(shí)別，再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP11軟件，標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別（PLSDA）分析。接著運(yùn)用variable influence in the projection（VIP）方法來(lái)預(yù)測(cè)各個(gè)數(shù)據(jù)對(duì)模型的貢獻(xiàn)值，VIP>1說(shuō)明具有明顯的貢獻(xiàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為可能的潛在標(biāo)志物。再采用Oneway ANOVA的方法，根據(jù)P<005的原則，排除沒(méi)有顯著性差異的數(shù)據(jù)。通過(guò)這一系列步驟之后，將具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)在Human Metabolome Database（HMDB）、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行匹配，篩選潛在的生物標(biāo)志物；最后在Metabo Analyst 30數(shù)據(jù)庫(kù)中分析可能的代謝通路變化。endprint

2結(jié)果

21行為學(xué)實(shí)驗(yàn)以體質(zhì)量、糖水偏愛(ài)率和曠場(chǎng)行為作為CUMS造模的行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，本研究中，與正常對(duì)照組相比，第28天數(shù)據(jù)顯示：模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢、糖水偏愛(ài)率低、穿格數(shù)和直立次數(shù)明顯偏少（P<005或P<001），表明造模過(guò)程中慢性溫和不可預(yù)知的刺激造成大鼠的食欲下降、快感缺乏、運(yùn)動(dòng)和探索能力下降，造模成功。連續(xù)給予姜黃素干預(yù)后，與模型組相比，大鼠體質(zhì)量、糖水偏愛(ài)、穿格和直立次數(shù)均增高（P<005），但與鹽酸文拉法辛組相比較，各項(xiàng)指標(biāo)則無(wú)明顯差異（表1）。

22血清PCA分析通過(guò)PCA主成分分析，結(jié)果顯示第28天時(shí)各組大鼠分布在不同的區(qū)域中，正常對(duì)照組和模型組分別分布于對(duì)立的2個(gè)象限中，而鹽酸文拉法辛組和姜黃素大鼠則分布在上述2組之間的中心區(qū)域內(nèi)（圖1）。由此可見(jiàn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，隨著造模措施的持續(xù)進(jìn)行，模型組大鼠體內(nèi)的小分子代謝物水平出現(xiàn)了顯著性的變化，而通過(guò)分別給予鹽酸文拉法辛和姜黃素的干預(yù)措施后，體內(nèi)的小分子代謝物則體現(xiàn)出向正常水平恢復(fù)的趨勢(shì)。再者，姜黃素組相比于文拉法辛組，要更接近于正常組一些。

23血清PLSDA分析PLSDA方法是在PCA分析的基礎(chǔ)上，增加了有監(jiān)督性的分級(jí)干預(yù)，旨在放大組間差異，以便于尋找潛在的生物標(biāo)志物。其中ScorePlot圖中也分別展現(xiàn)出了各組大鼠在第28天時(shí)的分布區(qū)域，與PCA分布圖大體相似；loadingplot則進(jìn)一步展現(xiàn)出了擬合模型中的各個(gè)小分子代謝物在各組間的分布水平；模型驗(yàn)證圖則可以驗(yàn)證PLSDA模型的擬合準(zhǔn)確度與預(yù)測(cè)率（圖2～4）。

24生物標(biāo)志物篩查通過(guò)偏最小二乘判別分析方法（PLSDA）進(jìn)行分析，選擇VIP>1的潛在標(biāo)志物在HMDB，metlin，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒別。其中，共初步篩選出11個(gè)潛在的生物標(biāo)志物（表2）。在篩選得到的潛在生物標(biāo)志物中，1和7為溶血磷脂酰乙醇胺類物質(zhì)，2為磷酯類物質(zhì)，3為神經(jīng)節(jié)苷脂類物質(zhì)，4，5，6，8，11為溶血卵磷脂類物質(zhì)，9為磷脂酰絲氨酸類物質(zhì)，10為脫氧膽酸類物質(zhì)。其中，治療藥物姜黃素和鹽酸文拉法辛通過(guò)上調(diào)或下調(diào)CUMS大鼠體內(nèi)生理水平出現(xiàn)異常的生物標(biāo)志物，使之恢復(fù)至正常水平或處于向正常水平的恢復(fù)過(guò)程中。

25生物通路分析將所篩選得到的潛在的生物標(biāo)志物輸入至Metabo Analyst 30數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行通路分析，結(jié)果顯示這些潛在的生物標(biāo)志物共涉及到7條通路，分別是甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α亞油酸代謝、醚脂類代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯互變、淀粉和蔗糖代謝和花生四烯酸代謝（圖5）。

3討論

抑郁癥是1種情志障礙性疾病，嚴(yán)重危害身體健康。究其發(fā)病機(jī)制目前尚未十分明確，臨床中針對(duì)于抑郁癥的診斷也存在一定的困難[12]?，F(xiàn)代科學(xué)研究中有使用代謝組學(xué)的技術(shù)手段探討抑郁癥的發(fā)病機(jī)理以及治療靶點(diǎn)，通過(guò)分析抑郁癥機(jī)體內(nèi)的小分子代謝物含量水平的變化，篩選出具有一定診斷價(jià)值的生物標(biāo)志物，進(jìn)而作為臨床中用于診斷抑郁癥的潛在金標(biāo)準(zhǔn)[13]。而姜黃素作為經(jīng)典方劑逍遙散中獨(dú)特味藥姜黃的主要作用成分之一，目前已有大量的研究文獻(xiàn)針對(duì)其抗抑郁功效進(jìn)行了報(bào)道，然而其確切的發(fā)生作用機(jī)制也未十分明確，尤其是姜黃素發(fā)揮抗抑郁作用過(guò)程中單個(gè)靶點(diǎn)或多個(gè)靶點(diǎn)，以及通過(guò)影響何種代謝通路發(fā)揮功效等焦點(diǎn)，需要我們進(jìn)一步的研究證實(shí)[14]。因此，本文以陽(yáng)性藥物文拉法辛作為對(duì)照藥，觀察姜黃素作用于CUMS模型抑郁癥大鼠中的作用，并篩選與姜黃素產(chǎn)生作用相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，進(jìn)而分析這些生物標(biāo)志物所涉及到的一系列代謝通路。

通過(guò)PCA和PLSDS的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析手段，分析結(jié)果顯示：姜黃素組與文拉法辛組均表現(xiàn)出向正常大鼠恢復(fù)中的趨勢(shì)，而且姜黃素組大鼠尤為明顯。結(jié)合兩組在抑郁癥相關(guān)指標(biāo)的變化水平，可以認(rèn)為姜黃素和文拉法辛均具有一定的抗抑郁功效，且在某種程度中，姜黃素的作用水平稍強(qiáng)于文拉法辛，這在PCA和PLSDA的分布圖中可以清晰地展現(xiàn)出來(lái)。當(dāng)然這種現(xiàn)象也會(huì)受到不同藥物的給藥濃度設(shè)定以及給藥時(shí)間周期所限，但不可否定的是，姜黃素的抗抑郁作用不弱于陽(yáng)性藥物文拉法辛。

再者，通過(guò)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)VIP值和單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)，選擇VIP>1以及P<005的變量作為潛在的生物標(biāo)志物在相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行鑒定。最終篩選出11個(gè)生物標(biāo)志物，這些標(biāo)志物與姜黃素發(fā)揮抗抑郁功效的過(guò)程密切相關(guān)。其中，涉及到磷脂類、脂質(zhì)類、膽酸類以及神經(jīng)節(jié)苷脂類等，這些物質(zhì)作為體內(nèi)的小分子代謝物，在細(xì)胞合成、膽酸代謝以及神經(jīng)因子調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用[15]。

同時(shí)，在這些已鑒定生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Metabo Analyst 30開(kāi)放性數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路分析，結(jié)果顯示按照相關(guān)性排序，甘油磷脂代謝和亞油酸代謝排在前面；按照影響程度排序，戊糖和葡萄糖醛酸酯互變、醚脂類代謝和甘油磷脂代謝排在前面。在中醫(yī)上[16]，歷代醫(yī)家多認(rèn)為抑郁癥之病因在于情志不舒、氣機(jī)郁滯，導(dǎo)致氣血不和、陰虛火旺和心神失養(yǎng)；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)者對(duì)于抑郁癥的認(rèn)識(shí)也日益深入，可能涉及到腦、肝、膽、心、脾、腎等體內(nèi)多個(gè)器官和系統(tǒng)，不能一概而論。因此，姜黃素發(fā)揮抗抑郁的功效很有可能是通過(guò)作用于體內(nèi)多條生理通道而實(shí)現(xiàn)，并不是單一的靶點(diǎn)，但限于當(dāng)前技術(shù)手段以及科學(xué)認(rèn)知水平，后續(xù)的深入探索需要有志者攜手實(shí)現(xiàn)。

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[責(zé)任編輯張燕]endprint