李楚燕，程 瑜，胡 章，楊 萍，廖銘能，李思東

（廣東海洋大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，廣東 湛江 524088）

殼聚糖/海藻酸鈉/活性肽復(fù)合膜的制備與性能研究*

李楚燕，程 瑜，胡 章*，楊 萍，廖銘能，李思東*

（廣東海洋大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，廣東 湛江 524088）

以殼聚糖和海藻酸鈉高分子為基質(zhì)原料，采用層層自組裝技術(shù)形成聚電解質(zhì)復(fù)合多層膜，并包裹深海魚蛋白活性肽，考察復(fù)合膜的厚度、溶脹度、透氣性、抗拉伸強(qiáng)度、累積釋放度等基本性能。結(jié)果表明，制備復(fù)合膜的最佳條件為殼聚糖（分子量50kDa）與海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比2∶1。在此條件下，制備復(fù)合膜層數(shù)為7層時(shí)，其厚度為0.041mm、透氣性63.96%、溶脹度為179.92%，斷裂拉伸率為12.45%，3h累計(jì)釋放度為11.58%，顯示出優(yōu)越的生物醫(yī)用膜性能，這將為開發(fā)一種新型的生物創(chuàng)傷醫(yī)用膜提供參考。

殼聚糖；海藻酸鈉；活性肽；層層組裝技術(shù)；創(chuàng)傷修復(fù)

皮膚損傷是日常生活常見的問題，如今市面上存在的外用性創(chuàng)傷醫(yī)療用品，基本是以化學(xué)物質(zhì)為主要的有效成分，添加到醫(yī)用膠布上。長時(shí)間使用會(huì)造成傷口不透氣，使用不當(dāng)容易導(dǎo)致傷口發(fā)炎，且防菌效果不佳，吸水性能較差，使皮膚處于浸泡狀態(tài)，傷口愈合緩慢，更有甚者減慢了原有的愈合速度。

殼聚糖（chitosan）亦被稱為殼多糖、脫乙酰甲殼素，是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基多糖。殼聚糖具有優(yōu)秀的生物相容性、無免疫原性、可生物降解和廣譜抗菌性等特點(diǎn)，應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、功能材料等領(lǐng)域。目前，被公認(rèn)是一種非常具有發(fā)展?jié)摿Φ奶烊桓叻肿硬牧蟍1-3]。殼聚糖在醫(yī)用敷料方面的應(yīng)用研究成績卓著，已被廣泛用于人造工程皮膚、可吸收的術(shù)后縫線、藥物載體等方面[4,5]。與其他抑制劑相比，殼聚糖具有抗菌譜廣、抑制活性高、殺滅率高的優(yōu)點(diǎn)[6]，因而能更加有效地抑制細(xì)菌的繁殖和生長。

海藻酸鈉一種來源海洋褐藻的天然高分子材料，安全無毒，溫和無刺激，其溶解性、粘性、穩(wěn)定性等性能優(yōu)良，廣泛用于藥物制劑、化妝品及食品等領(lǐng)域[7]。

生物活性肽是指來源于生物體且對生命活動(dòng)有益或具有促進(jìn)生理作用的功能肽化合物。研究表明，水產(chǎn)蛋白肽具有生物相容性、低免疫性原性和可降解性，以及來源豐富等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[8]。

本研究以殼聚糖和海藻酸鈉大分子為基質(zhì)原料，采用層層自組裝技術(shù)形成聚電解質(zhì)復(fù)合多層膜，并包裹深海魚膠原蛋白肽，制備得到殼聚糖/海藻酸鈉/活性肽生物復(fù)合膜，通過對復(fù)合膜的厚度、溶脹度、透氣性、抗拉伸強(qiáng)度等性能檢測，優(yōu)化制備復(fù)合膜的操作參數(shù)，探討制備高性能復(fù)合膜的最優(yōu)工藝條件，以期為開發(fā)一種新型創(chuàng)傷生物醫(yī)用膜提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、材料與儀器

海水羅非魚（湛江東風(fēng)水產(chǎn)市場）；殼聚糖（CS）（分子量5萬Da，脫乙酰度≥95%，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司）；海藻酸鈉（AR天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；冰乙酸、聚乙二醇400等試劑均為分析純。

紫外分光光度計(jì)UV2800（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；索尼數(shù)碼照相機(jī)（W800，索尼（中國）有限公司）。

1.2 魚肉蛋白肽的制備

取一定量的羅非魚肉，按料液比為1∶2.5（g/V）的比例加入水，將混合物加熱，至50℃時(shí)加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，酶解5h后，升溫至100℃滅活10min，冷卻，離心，清液經(jīng)50nm陶瓷膜微濾，得濾液，減壓濃縮，噴霧干燥制成粉狀。

1.3 殼聚糖/海藻酸鈉/活性肽復(fù)合膜的制備[9]

殼聚糖膜液 稱取殼聚糖2g和魚蛋白肽1g溶于0.5%冰乙酸水溶液，加入0.25%聚乙二醇400，50℃水浴加熱并磁力攪拌至殼聚糖完全溶解，靜置脫氣。

海藻酸鈉膜液 稱取海藻酸鈉1g和深海魚肽1g，溶于蒸餾水中，加入0.25%聚乙二醇400，磁力攪拌至海藻酸鈉完全溶解，靜置脫氣。

凝固液 室溫下，將5g無水硫酸鈉置于燒杯中，加入100mL蒸餾水，攪拌均勻，再加入3gCaCl2，攪拌均勻后把沉淀物過濾得到凝固液。

往潔凈的培養(yǎng)皿中倒入一定量的殼聚糖溶液，流延均勻，反應(yīng)30min后，用去離子水洗滌游離的殼聚糖分子，而后加入海藻酸鈉溶液，30min后用去離子水洗滌，重復(fù)上述步驟,可制備一定層數(shù)的殼聚糖/海藻酸鈉層層自組裝多層膜，將膜置于真空干燥箱中55℃烘干后，置于凝固浴中交聯(lián)30min，脫膜，晾干，薄膜保存在冰箱內(nèi)待用。

1.4 殼聚糖/海藻酸鈉/活性肽復(fù)合膜的表征

1.4.1 膜的厚度 制備的復(fù)合膜層數(shù)分為3層、5層、7層、9層，若殼聚糖有n層，則海藻酸鈉為n-1層。各選取5張光滑、平整的緩釋膜，用螺旋測微器分別測定膜的4個(gè)頂點(diǎn)和1個(gè)中心點(diǎn)，取平均值作為膜的厚度d（mm）。

1.4.2 透氣率的測定 根據(jù)關(guān)麗[10]等的實(shí)驗(yàn)方法測定復(fù)合膜的透氣性能，取4個(gè)潔凈的稱量瓶，加入無水CaCl2（2g）粉末，稱重，其中3個(gè)瓶口用樣品復(fù)合膜密封，另1個(gè)不封膜作對照，然后，把4個(gè)瓶都置入裝有飽和食鹽水的密閉容器中，24h后將瓶子取出，把復(fù)合膜取下，并再次稱重，計(jì)算透氣率。平行操作3次，計(jì)算平均值。公式如下：

透氣率=樣品瓶吸水量/對照瓶吸水量×100%

1.4.3 溶脹度 取膜2cm×3cm的小片，精確稱量后放入生理鹽水中，37℃的恒溫水浴浸泡24h后取出，用濾紙小心吸干表面水分，稱重。平行操作3次，取平均值。溶脹度（Swelling ratio,SR）的計(jì)算公式如下[11]：

式中 SR：溶脹度，%；ma和mb分別為膜溶脹前、后的質(zhì)量，g。

1.4.4 抗拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率的測定[12]將長為5cm，寬為1cm的薄膜以對折方式懸掛于玻璃棒上，上端1cm處用手握緊，下端夾掛可以加砝碼的小托盤。連托盤質(zhì)量一起為300g開始，每分鐘放置小砝碼50g，測量平衡后的膜長度并記錄總重量。以復(fù)合膜斷裂時(shí)的總重量為抗張強(qiáng)度，以斷裂時(shí)的長度與原長度（1.5cm）的比值計(jì)算斷裂伸長率。平行操作3次，取平均值。

1.4.5 活性肽累積釋放度的測定 精密稱取一定質(zhì)量的活性肽，配成0.1mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于紫外可見分光光度計(jì)掃描200～400nm的吸光度，確定活性肽的最大吸收波長。在最大吸收波長下繪制活性肽的濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取藥膜3片，分別投入3個(gè)燒杯中。在0.5、1、1.5、2、3h時(shí)分別精密取樣2mL，同時(shí)向燒杯中補(bǔ)加緩沖溶液2mL。取出的2mL放于10mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻。取空白膜，同法操作作為對照，紫外分光光度標(biāo)準(zhǔn)曲線法求出溶液中活性肽的濃度，根據(jù)如下公式分別計(jì)算活性肽的體外累計(jì)釋放度（Cumulative release percentage,CRP）[13]。

式中 CRP%：累計(jì)釋放百分率；Cj：第 j時(shí)刻緩沖溶液中藥物的濃度，μg·mL-1；V總：釋放體系緩沖溶液總體積，100mL-1；Ci：第 i時(shí)刻緩沖溶液中藥物的濃度，μg·mL-1；V取：每次從釋放體系中取出的體積。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合膜的外觀形態(tài)

所制備復(fù)合膜呈圓形，質(zhì)地均勻，表面光滑，透明，柔韌性比較好，見圖1。

圖1 復(fù)合膜的外觀形態(tài)Fig.1 Appearance of the composite film

2.2 復(fù)合膜的厚度和透氣率

制備的復(fù)合膜層數(shù)分為3層、5層、7層、9層，不同層數(shù)復(fù)合膜的厚度和透氣率見表1。

表1 不同層數(shù)復(fù)合膜的厚度和透氣率Tab.1 Thickness and permeability of the composite filmswith different layers

膜的層數(shù)越多，其平均厚度越厚，但并非呈線性關(guān)系，當(dāng)膜由7層增加到9層時(shí)，厚度急劇增加。膜的透氣率與平均厚度呈反比例關(guān)系，當(dāng)膜由7層增加至9層時(shí)，透氣率急劇降低。由此可見，復(fù)合膜7層時(shí)對透氣率有著重要的轉(zhuǎn)折作用。皮膚需要呼吸，作為生物醫(yī)用膜材料，創(chuàng)傷膜貼在皮膚表面，應(yīng)具備一定的透氣性能，有助于創(chuàng)面的正常有氧呼吸和新陳代謝，促進(jìn)組織的修復(fù)和傷口的愈合[14]。而7層復(fù)合膜透氣性達(dá)63.96%、透氣性相對較好。

2.3 復(fù)合膜的溶脹度和抗拉伸性能

復(fù)合膜的溶脹度和斷裂拉伸率結(jié)果見圖2。

圖2 不同層數(shù)復(fù)合膜的溶脹度和抗拉伸強(qiáng)度Fig.2 Swelling ratio and tensile rate of the composite films with different layers

由圖2可知，復(fù)合膜溶脹度隨著膜的增厚呈降低趨勢；而復(fù)合膜的抗拉伸性能則正好相反。通過比較，7層殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合膜各項(xiàng)基本性能更優(yōu)，其厚度平均值為0.041mm，膜輕薄的外形在臨床上可以給與使用者更舒適的感覺。7層復(fù)合膜因結(jié)構(gòu)疏松，水分子容易通過，溶脹度為179.92%，抗拉伸率為12.45%。

復(fù)合膜的抗拉伸性能取決與膜材料的交聯(lián)程度。帶有相反電荷的陽離子殼聚糖大分子與陰離子海藻酸鈉大分子通過靜電吸引力相互作用，并且在含有-SO42-和Ca2+凝固浴里，未參與反應(yīng)的殼聚糖、海藻酸鈉分子分別與-SO42-、Ca2+反應(yīng)30min，使復(fù)合膜呈現(xiàn)出交聯(lián)程度極高、納米線性交錯(cuò)的牢固結(jié)構(gòu)，科學(xué)上稱之為“蛋盒結(jié)構(gòu)”。但是過度交聯(lián)會(huì)使膜變脆，力學(xué)性能降低，這是由于過度交聯(lián)使殼聚糖/海藻酸鈉間分子作用力受到破壞，影響分子鏈的緊密排列，降低膜的抗拉強(qiáng)度。

2.4 復(fù)合膜的體外釋放度

復(fù)合膜中魚蛋白活性肽的釋放曲線見圖3。

圖3 復(fù)合膜中活性肽累計(jì)釋放曲線Fig.3 Curves of the active peptides released from the composite films

從曲線中切線的斜率可以判斷出不同層數(shù)復(fù)合膜中活性肽在溶液中釋放速度是先快后慢，0.5h內(nèi)釋放最快。復(fù)合膜表層的活性肽最先透過殼聚糖層釋放，內(nèi)部的則透過擴(kuò)散作用慢慢釋放出來。數(shù)據(jù)表明，復(fù)合膜層數(shù)越多其緩釋期越長，緩釋性能越好，由于復(fù)合膜層數(shù)越多載藥量就越高，活性肽被不同程度的裹在海藻酸鈉層，交聯(lián)后復(fù)合膜中高分子鏈空間縮小，越靠近復(fù)合膜中心的活性肽就越難釋放。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，藥物緩釋最長可達(dá)180h[15]。復(fù)合膜3、5、7和9層中活性肽3h累計(jì)釋放度分別為14.21%、12.05%、11.58%和6.46%，復(fù)合膜中活性肽的累計(jì)釋放度從3層到7層差異性不是很明顯，而7層與9層的累計(jì)釋放度出現(xiàn)較大的轉(zhuǎn)折。由此可見，復(fù)合膜7層表現(xiàn)出合適的累計(jì)釋放性能。

3 結(jié)論

利用層層自組裝技術(shù)制備的殼聚糖/海藻酸鹽復(fù)合膜外觀透明光滑，輕薄柔韌，操作條件簡單，成本要求低。本文采用殼聚糖（分子量50kDa）與海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比2∶1，在55℃條件下干燥，成膜后用含有-SO42-和Ca2+的凝固浴浸泡交聯(lián)30min，所制備的復(fù)合膜透氣性、溶脹度、抗拉伸能力基本符合臨床上創(chuàng)傷膜的要求。通過比較，7層復(fù)合膜具有更加良好的基本性能，其機(jī)械強(qiáng)度、透氣保濕能力、穩(wěn)定的藥物釋放能力，在作為新型生物醫(yī)用敷料方面有可觀的探究價(jià)值和使用價(jià)值。

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Research on the preparation and properties of chitosan-alginate-activated-peptide com posite film s*

LIChu-yan,CHENG Yu,HU Zhang*,YANG Ping，LIAOMing-neng,LISi-dong*
（Department of Applied Chemistry,College of Chemistry and Environment,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China）

In order to prepare chitosan alginate-peptide composite films from chitosan and alginate,polyelectrolytemultilayer compositemembraneswere formed by layer-by-layer self-assembly technique and the fish protein peptideswere packed.Basic properties of the compositemembranes including thickness,degree of swelling,permeability,tensile strength and the accumulative release percentage were detected.The results showed that the optimum conditionswere as follows:themass ratio of chitosan （molecularweight50kDa）and sodium alginate 2∶1 and 7layers of the films.Under the conditions,the composite filmswere prepared with thickness 0.041mm,swelling ratio 179.92%,permeability 63.96%,tensile rate 12.45%and the accumulative release percentage 11.58%.It will provide the references for developing a novel trauma biomedicalmembrane.

chitosan;alginate;activated peptide;layer-by-layer self-assembly technique;wound healing

S667.1

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170409

2017-02-18

廣東省自然科學(xué)基金（2016A030308009）；廣東海洋大學(xué)“創(chuàng)新強(qiáng)校工程”項(xiàng)目（2015KTSCX053，GDOU2013050221）

李楚燕（1993-），女，廣東人，本科學(xué)士，助理工程師，研究方向?yàn)橹扑幑こ獭?/p>