程玉鵬，馬愛(ài)萍，王洪月，寧 愿，李天聰，李弘琨

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；2.哈爾濱師范大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150025）

龍膽愈傷組織中葉綠素的含量測(cè)定*

程玉鵬1,2，馬愛(ài)萍1，王洪月1，寧 愿1，李天聰1，李弘琨1

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；2.哈爾濱師范大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150025）

為了提高龍膽愈傷組織中葉綠素的提取率，現(xiàn)采用分光光度法測(cè)定不同提取液對(duì)其影響。結(jié)果表明，隨著提取液組分的不同，葉綠素吸收光譜極其相似，其含量和穩(wěn)定性卻有顯著變化。當(dāng)溶劑中水量減少時(shí)，葉綠素的提取速率及葉綠素提取液的穩(wěn)定性顯著升高。在3種提取液中，葉綠素a的穩(wěn)定性不如葉綠素b。丙酮；無(wú)水乙醇為2∶1的無(wú)水混合液為較佳的提取液，可用于大批量樣品中葉綠素的提取測(cè)定。

龍膽愈傷組織；葉綠素；含量測(cè)定

龍膽（Gentianae Radix et Rhizoma）為龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬（Gentiana）植物[1]。近年來(lái)對(duì)龍膽的研究主要集中在藥用價(jià)值及臨床應(yīng)用等方面[2]，而龍膽組織培養(yǎng)方面的報(bào)道頗少，更未見其組培體系中葉綠素含量測(cè)定的相關(guān)論著。葉綠素不但是植物葉片的主要光合色素，也是植物生理研究中的重要指標(biāo)[3]，在龍膽愈傷組織中，葉綠素也同樣具有不可替代的作用。因此，本文著重研究龍膽愈傷組織中葉綠素含量變化。

測(cè)定葉綠素含量的方法主要有傳統(tǒng)的分光光度法和活體葉綠素儀法，之后又有人采用光聲光譜法。其中，應(yīng)用最為廣泛的是分光光度法[4]。但由于所用的提取葉綠素的溶劑不同，又有許多種測(cè)定方法，用的較普遍的是Arnon法。由于該法提取麻煩，提取速度慢，工作量大，葉綠素易受光氧化，測(cè)定值偏低等原因，不適合大批量樣品的測(cè)定[5]。本試驗(yàn)在前人的研究基礎(chǔ)上，以Arnon法作對(duì)照，采用丙酮與乙醇的混合液作為提取液，提出了提取液中含水量對(duì)葉綠素含量測(cè)定有顯著的影響這一見解，解釋了常規(guī)的Arnon法測(cè)定值偏低的根本原因。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

DHP-9160電熱恒溫培養(yǎng)箱（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；UV BlueStar A（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；AE240電子分析天平（Mettler Toledo）；具塞刻度試管（50m L），漏斗，滴管，濾紙，試管架。

龍膽愈傷組織（哈爾濱師范大學(xué)王臣老師友情贈(zèng)送的種子萌發(fā)誘導(dǎo)而得）。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 提取液的配置 用丙酮、無(wú)水乙醇和蒸餾水分別按 12∶6∶0，12∶6∶2，12∶0∶3 的比例配成A，B，C 3種混合提取液。

1.2.2 葉綠素的浸提 分別于試管中加入20m L提取液。把愈傷組織切成1mm小塊，混勻。分別準(zhǔn)確稱取3.0g放入盛有提取液的試管中，用塞封口，置于25℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下直接浸提。分別在浸提 1、2、4、8、12、16、20、24、48、72、96、120 h進(jìn)行取樣測(cè)定。當(dāng)用肉眼觀察愈傷組織完全變白時(shí)，即說(shuō)明浸提完全，定容至25m L容量瓶中，搖勻，即得待測(cè)樣品。

1.2.3 分光光度計(jì)法測(cè)定葉綠素含量 取一定量的葉綠素待測(cè)溶液，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，將續(xù)濾液置于厚1cm的比色皿中，用相應(yīng)提取液作參比，在UV BlueStar A分光光度計(jì)上測(cè)定645nm和663nm處的光密度值。再用Arnon法公式計(jì)算葉綠素含量。公式如下：

Ca=12.7D663-2.69D645

Cb=22.9D645-4.68D663

Ct=Ca+Cb=20.2D645+8.02D663

式中 Ct：總?cè)~綠素濃度；Ca、Cb：葉綠素 a、b 的濃度，mg·L-1。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 用spss 22.0進(jìn)行所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取液中葉綠素的吸收光譜掃描

如圖1所示，3種不同葉綠素提取液在波長(zhǎng)500～700nm范圍內(nèi)吸收光譜基本相似，且最大吸收波長(zhǎng)約在660nm，說(shuō)明所用提取液提取的葉綠素溶液化學(xué)性質(zhì)基本相同，符合Arnon公式的計(jì)算要求，可以采用該公式計(jì)算相應(yīng)的葉綠素含量。

圖1 龍膽愈傷組織在不同提取液中吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of chlorophyll in different extraction agents in gentian callus（Note:A,B,C respectively represent acetone:absolute ethanol:distilled water-12∶6∶0,12∶6∶2,12∶0∶3）

2.2 不同提取液對(duì)葉綠素提取率的影響

用不同提取液對(duì)龍膽愈傷組織進(jìn)行提取，結(jié)果表明，48h內(nèi)3種提取液中葉綠素含量持續(xù)上升（見圖2）。無(wú)水丙酮與乙醇混合液提取的葉綠素含量較高于含10%水的混合液提取率，但顯著高于80%丙酮提取液提取的葉綠素含量。龍膽愈傷組織浸提2h后，采用提取液A提取的葉綠素含量最高為2.11 mg·g-1，其次是提取液 B 組 1.87mg·g-1，第三是 C 組80%丙酮為 1.71m·g-1。從浸提 4、8、16、24和 48h后看，A組葉綠素提取效果與另外2種提取液比，有顯著性差異（p＜0.05）。

圖2 不同提取液對(duì)龍膽愈傷組織中葉綠素提取效果的影響Fig.2 Effects of differentextraction agents on the chlorophyll content in gentian callus

2.3 不同提取液對(duì)葉綠素穩(wěn)定性的影響

連續(xù)監(jiān)測(cè)120h后發(fā)現(xiàn)，不同提取液對(duì)龍膽愈傷組織中葉綠素穩(wěn)定性的影響也不同（見表1）。

表1 不同提取液對(duì)葉綠素穩(wěn)定性的影響（mean±SD，n=3）Tab.1 Effects of differentextraction agents on on the stability of chlorophyllin gentian callus（Mean±SD,n=3）

在經(jīng)過(guò)48h持續(xù)上升后，葉綠素含量出現(xiàn)不同程度的下降，尤其是提取液C組80%丙酮葉綠素含量下降最多，這表明提取液中含水量越多，葉綠素越不穩(wěn)定。葉綠素提取液放置120h后，葉綠素a下降37.93%～28.82%，葉綠素b下降30.63%～25.31%，葉綠素a與葉綠素b比值下降10%左右，據(jù)此可推測(cè)葉綠素b比葉綠素a穩(wěn)定。

3 結(jié)論

由本試驗(yàn)結(jié)果看，選用丙酮和無(wú)水乙醇混合提取液提取葉綠素的效果較好，比例以2:1較佳。傳統(tǒng)的80%丙酮法由于含水量過(guò)高，導(dǎo)致葉綠素極不穩(wěn)定性，提取速度慢，測(cè)定值偏低，應(yīng)慎重采用。

龍膽中龍膽苦苷的生物合成途徑較為復(fù)雜，主要通過(guò)細(xì)胞質(zhì)中MVA途徑或者在質(zhì)體中通過(guò)MEP途徑合成萜類前體物質(zhì)IPP，然后轉(zhuǎn)化為GPP[6]。葉綠體屬于質(zhì)體中一種，其中葉綠素含量高低可能會(huì)影響龍膽苦苷合成途徑的具體走向，同時(shí)也為次生代謝產(chǎn)物研究、人工栽培馴化及建立繁育基地緩解野生藥用資源匱乏和擴(kuò)大新藥源的有效途徑提供技術(shù)平臺(tái)。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2015版一部）［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015.95.

［2］ Chang-Liao W L,Chien C F,Lin L C,et al．Isolation of gentiopicroside from Gentianae Radix and its pharmacokinetics on liver ischem ia/reperfusion rats［J］.JEthnopharmacol,2012,141（2）:668-673.

［3］ 王愛(ài)玉,張春慶,等.玉米葉綠素含量快速測(cè)定方法研究［J］.玉米科學(xué),2008,16（2）:97-100.

［4］ 曾建敏,姚恒,等.烤煙葉片葉綠素含量的測(cè)定及其與SPAD值的關(guān)系［J］.分子植物育種,2009,7（1）:56-62.

［5］ 薛香,吳玉娥.小麥葉片葉綠素含量測(cè)定及其與SPAD值的關(guān)系［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,49（11）:2701-2702.

［6］ 王彩云,張曉東，等.龍膽苦苷生物合成途徑研究進(jìn)展［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42（3）:4-10.

Chlorophyll content determ ination in gentian callus*

CHENG Yu-peng1,2,MA Ai-ping1,WANG Hong-yue1,NING Yuan1,LITian-cong1,LIHong-kun1
（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;2.Harbin Normal University,Harbin 150025,China

To study the effects of different extraction agents on the chlorophyll content in gentian callus by UV-vis spectrophotometry.The results indicated that chlorophyll absorption spectrum was similar,however,chlorophyll content and stability had significant effects with different extraction agents.As water content of extraction agents increasing,the stability and the extraction rate of chlorophyll significantly decreased.Chlorophyll b wasmore stable than Chlorophyll a.The better extraction that acetone:absolute ethanol（2:1）is used for the content determination of chlorophyll in bulk samples.

gentian callus;chlorophyll;content determination

R284

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170425

2017-01-16

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（yjscx2016046）

程玉鵬（1966-），男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥生物技術(shù)應(yīng)用研究。