楊洪蕓 黃巧麗 劉振亮 劉鑫鑫 盧 毅 崔 萌 孫立彥

(泰山醫(yī)學院，山東 泰安 271016)

一株泰山黃精內(nèi)生真菌的分離及其抗氧化活性初步研究*

楊洪蕓 黃巧麗 劉振亮 劉鑫鑫 盧 毅 崔 萌 孫立彥

(泰山醫(yī)學院，山東 泰安 271016)

目的 藥用植物內(nèi)生真菌是一類重要的微生物資源，本研究從泰山黃精根莖中分離純化內(nèi)生真菌，并對其抗氧化性進行研究。方法 采用組織貼片培養(yǎng)分離法進行內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)，采用DPPH法和鐵氰化鉀還原力法測定抗氧化性。結果 從黃精根莖中分離純化到1株內(nèi)生真菌HJG3。在測試濃度范圍內(nèi)，對DPPH自由基清除率及其還原能力與濃度均呈明顯的量效關系，其IC50值為14.0262 mg/ml， EC50值為1.8475 mg/ml。結論 泰山黃精中有內(nèi)生真菌存在，其內(nèi)生真菌HJG3有一定抗氧化性，是篩選天然生物活性成分的潛在資源。

泰山黃精；內(nèi)生真菌；抗氧化活性

內(nèi)生真菌是指生活史的全部或某一階段生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有造成明顯病害的真菌[1]。第一株內(nèi)生真菌是1898年由Vogl 從黑麥草Lolium perenne L.種子種分離獲得，到20世紀80年代，有關植物內(nèi)生真菌的研究得到重視，對內(nèi)生真菌的研究廣泛開展起來[2]。內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生與宿主相似或相同的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，這些活性產(chǎn)物具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等生物活性。從內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中尋找抗菌、抗氧化和抗腫瘤活性物質(zhì)已成為人們研究熱點[3]。最近從蒺藜[4]、南北五味子[5]、寧夏枸杞[6]等藥用植物植物中分離的內(nèi)生真菌則可合成抗氧化活性物質(zhì)。

黃精Polygonatum sibiricum Delar ex Redoute, 又名黃蔓精、老虎姜、雞頭參、雞頭精等，是雙子葉百合科植物，是泰山四大名藥之一[7]。黃精作為常用補益藥，有著兩千多年的藥用歷史，具有補氣養(yǎng)陰、潤肺、健脾和益腎功效，臨床上常用于治療肺虛燥咳、脾胃氣虛和精血不足等，也可用于治療糖尿病和肺結核等病，同時又是數(shù)十種滋補性中醫(yī)復方或中成藥的重要組分[8-9]。

由于黃精市場需求量高，長期以來被人類過度采挖，自然繁殖率低，使得黃精的野生資源越來越匱乏[10]。目前，對黃精內(nèi)生真菌的研究僅見李艷玲等抑菌活性研究和汪瀅等抗菌代謝產(chǎn)物研究[10-11]。未見黃精內(nèi)生真菌的抗氧化活性研究報道。本課題組對泰山黃精根莖進行了內(nèi)生真菌分離并對分離得到的一株內(nèi)生真菌進行了抗氧化活性研究，希望能為黃精資源的綜合開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1植物材料 黃精根莖健康組織采自泰山四大名藥種植基地，24 h內(nèi)處理。

1.1.2培養(yǎng)基和主要試劑 真菌分離培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 ml)。真菌種子發(fā)酵培養(yǎng)基： PD培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 ml)。固體發(fā)酵培養(yǎng)基：大米培養(yǎng)基。

主要試劑：2，6-二叔丁基對甲苯酚BHT(國藥集團化學試劑有限公司)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH(Sigma公司)；鐵氰化鉀(天津市博迪化工有限公司)；維生素 C(中國藥品生物制品檢驗所)；瓊脂粉(天津市承大化學試劑研發(fā)中心)；磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉(天津市博迪化工有限公司)等。

1.1.3儀器 UV-2550 紫外分光光度計(島津制作所)； MJX-320多段編程霉菌培養(yǎng)箱(寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司)；SW-CG-RF超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；FC-104電子分析天平(上海恒平科學儀器有限公司)等。

1.2試驗方法

1.2.1內(nèi)生真菌分離純化與保存[12-13]內(nèi)生真菌的分離采用組織塊法，黃精根莖用自來水沖洗，然后依次用75%乙醇漂洗1 min，5.0%的次氯酸鈉漂洗5 min，75%乙醇漂洗30 s，無菌水漂洗5 次以進行表面消毒。用無菌刀片將材料切成5～10 mm的片段，貼于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5～7 d，同時，將表面消毒的植物組織片段不經(jīng)剪切直接在培養(yǎng)基表面輕抹，相同條件下培養(yǎng)作為對照，培養(yǎng)3 d后對照培養(yǎng)基中無真菌長出，證明表面消毒徹底，分離得到的真菌是植物內(nèi)生真菌。每培養(yǎng)皿接4個組織塊，觀察材料切口處長出菌絲(菌落)，采用尖端菌絲挑取法取切口處菌絲，轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)、純化，純化后轉(zhuǎn)接到PDA斜面上編號并4 ℃保存。

1.2.2制備樣品粗提物 制備HJG3種子發(fā)酵液(25 ℃，120 rpm，5 d)，在大米固體培養(yǎng)基上25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)20 d，用乙酸乙酯浸提真空濃縮得其粗提物，用于抗氧化實驗研究。

1.2.3抗氧化方法[14-15]

1.2.3.1DPPH自由基清除率的測定 DPPH溶液的配制：用無水乙醇配置0.12 mg/ml DPPH母液，避光保存，備用。用時無水乙醇稀釋3倍，得0.04 mg/ml DPPH溶液。樣品溶液的配制：用無水乙醇配制濃度梯度為8 mg/ml、4 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml樣品溶液。對照品溶液的配制：用無水乙醇配制濃度梯度為0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml、0.0625 mg/ml、0.03125 mg/ml、0.015625 mg/ml的陽性對照Vc和BHT。自由基清除率的測定：各取不同濃度的樣品溶液0.5 ml于試管中，再加入0.04 mg/ml DPPH 自由基溶液3.5 ml，混勻， 25 ℃水浴黑暗反應30 min，靜置10 min后，取上清液于517 nm 處測其吸光度As；另各取不同濃度的樣品溶液0.5 ml于試管中，分別加入無水乙醇3.5 ml，25 ℃水浴黑暗反應30 min，靜置10 min后，取上清液于517 nm處測其吸光度Ab；以 0.04 mg/ml DPPH自由基溶液3.5 ml和無水乙醇0.5 ml反應作為參比，測其吸光度Ao。每個濃度組平行測定三次，取平均值，結果以自由基清除率E表示，E(%)=[Ao-( As-Ab)]/Ao×100%。

1.2.3.2鐵氰化鉀還原力的測定 樣品溶液的配制：用無水乙醇配制濃度梯度為8 mg/ml、4 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml、0.0625 mg/ml的樣品溶液。陽性對照Vc溶液的配制：用無水乙醇配制濃度梯度為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/ml的Vc溶液。還原力的測定：精確移取1 ml不同濃度的樣品溶液，依次加入磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH6.6)2.5 ml，鐵氰化鉀溶液(30mmol/L)2.5 ml，混勻，50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷卻至室溫，再加入2.5 ml三氯乙酸(600 mmol/L)，混勻，離心(3000 r/min)10 min，取上清液2.5 ml，加超純水2.5 ml，三氯化鐵(6 mmol/L)0.5 ml，混勻，室溫反應10 min，700 nm處測吸光度。注：用Vc作陽性對照，以1 ml無水乙醇代替樣品作空白。所有測定平行3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1內(nèi)生真菌的分離純化

對黃精根莖部位內(nèi)生真菌進行分離，分離純化獲得內(nèi)生真菌菌株HJG3。保存于泰山醫(yī)學院藥學院綜合實驗室。

2.2抗氧化活性實驗

2.2.1DPPH自由基清除率 依據(jù)1.2.3.1方法，得到樣品HJG3和陽性對照品(Vc、BHT)不同濃度下對DPPH自由基的清除率(E)，并以濃度(C)為橫坐標，自由基清除率(E)為縱坐標，得到HJG3、Vc、BHT對DPPH自由基的清除效果曲線，見圖1。從圖1可見，HJG3粗提物在0.03125～64 mg/ml濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基清除率與質(zhì)量濃度呈良好量效關系。陽性對照Vc在0.125 mg/ml后對DPPH自由基清除率基本趨于穩(wěn)定，BHT在 0.50 mg/ml后對DPPH自由基清除率基本趨于穩(wěn)定，且Vc和BHT對DPPH自由基清除率均能達96%?？梢?，HJG3對DPPH自由基有一定的清除效果，但弱于Vc和BHT。根據(jù)圖1，在有效濃度范圍內(nèi)，建立濃度C與自由基清除率E的線性關系，得回歸方程，并計算 IC50(E為50%時的濃度)。結果見表2。

圖1 HJG3、Vc和BHT對DPPH自由基的清除效果曲線

樣品線性方程R2IC50值/mg·ml-1HJG3Y=2.4944X+15.0130.997114.0262VcY=1391X+5.89511.00000.0317BHTY=340.97X+0.43860.99990.1454

2.2.2鐵氰化鉀還原力的測定 依據(jù) 1.2.3.2方法，測定HJG3和陽性對照品(Vc 、BHT)不同濃度下在700 nm吸光度。并以濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，得到HJG3、Vc、BHT還原力曲線，結果見圖2。從圖2可見，Vc在 0～0.25 mg/ml范圍內(nèi)，其吸光值隨濃度增大不斷增大；BHT在0～1.0 mg/ml范圍內(nèi)，其吸光值隨濃度增大不斷增大，在1.0～8.0 mg/ml范圍內(nèi)BHT吸光值略有下降趨勢；HJG3在0～8.0 mg/ml范圍內(nèi)，其吸光值與濃度接近線性關系，在最高濃度8.0 mg/ml時，吸光值最大，還原力最強，但在相同濃度下，其還原力弱于Vc和BHT。

圖2 HJG3、Vc 、BHT還原力曲線

依據(jù)圖2，在有效濃度范圍內(nèi)建立濃度C與吸光度A的線性關系，得回歸方程，并計算EC50(A 為 0.5 時的樣品濃度)，結果見表3。

表3 HJG3、Vc和BHT還原力線性方程及EC50值

3 討 論

本實驗采用組織塊分離法得到一株黃精內(nèi)生真菌HJG3，并用DPPH法和鐵氰化鉀還原力法測定了HJG3乙酸乙酯粗提物的抗氧化活性。結果表明，黃精根莖中含有內(nèi)生真菌，且HJG3粗提物有一定抗氧化活性，其抗氧化活性弱于陽性對照Vc和BHT。本實驗僅對黃精內(nèi)生真菌HJG3抗氧化活性進行了初步研究，希望能為黃精內(nèi)生真菌相關研究和黃精的綜合開發(fā)利用提供一定參考資料。

綜上所述，黃精內(nèi)生真菌 HJG3乙酸乙酯粗提物有一定抗氧化活性，但其抗氧化活性弱于Vc和BHT。

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Isolation of an endophytic fungus from polygonatum sibiricum and preliminary studies on its antioxidant

YANG Hong-yun HUANG Qiao-li LIU Zhen-liang LIU Xin-xin LU Yi CUI Meng SUN Li-yan

(Taishan Medical University, Taian 271016, China)

Objective:Endophytic fungi in medicinal plants produce a variety of bioactivity compound.In this study, endophytic fungi were isolated from rhizoma of Polygonatum sibiricum, of which the antioxidant activity was studied. Methods:The cultural method of plant tissue paster on solid medium was used for isolating endophytic fungus from rhizoma of Polygonatum sibiricum.DPPH method and Potassium ferricyanide reduction force measurement were used for the determination of antioxidant activity of endophytic fungus HJG3 crude extrat. Results:One strain of endophytic fungus HJG3 was obtained from rhizoma of Polygonatum sibiricum. In the tested concentration range of HJG3 crude extract, the scavenging DPPH ability and the reducing power of endophytic fungus HJG3 had obvious dose-effect relationships with the concentration. The IC50was 14.0262 mg/ml, EC50was 1.8475 mg/ml.Conclusions:There were endophytic fungi in Polygonatum sibiricum. The crude extract of endophytic fungus HJG3 from Polygonatum sibiricum had certain antioxidant activity, which could be used as the potential resource for screening natural bioactivity constituents.

polygonatum sibiricum;endophytic fungi;antioxidant activity

山東省自然科學基金項目(ZR2011CQ011)；泰安市科學技術局項目(2015NS2123)；泰醫(yī)高層次培育課題(2015GCC14)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(201510439014，201510439083)。

楊洪蕓(1992—)，女，中藥學專業(yè)2013級本科生。黃巧麗，女，生藥學專業(yè)2016級碩士生，并列第一作者。

崔萌，E-mail: 15698122269@163.com。孫立彥，碩士生導師，E-mail: hhhyyy1982@163.com。

R285

A

1004-7115(2017)10-1081-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.10.001

2017-07-23)