周福波+翟鳳國+楊旭東+張羽飛

[摘要] 目的 觀察中藥川貝含藥血清對支氣管平滑肌細(xì)胞（BSMC）增殖，管道形成及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）表達(dá)的影響。 方法 卵蛋白（OVA）復(fù)制哮喘小鼠模型，制備川貝含藥血清。體外培養(yǎng)BSMC，隨機(jī)分為空白血清組，低劑量組和高劑量組。檢測BSMC增殖率，管道形成長度，VEGF及VEGF mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 與空白血清組比較，低劑量組和高劑量組顯著降低BSMC增殖，管道形成長度，VEGF和VEGF mRNA的表達(dá)（P < 0.05）。 結(jié)論 中藥川貝含藥血清可抑制BSMC增殖，管道形成長度，其機(jī)制可能與其抑制VEGF的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 川貝；哮喘；支氣管平滑肌細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（b）-0013-04

Effects of Bulbus Fritillariae Cirrhosae medicated serum on bronchial smooth muscle cells and vascular endothelial growth factor

LI Houzhong1 LIU Li2 HUANG Wei3 ZHOU Fubo1 ZHAI Fengguo1 YANG Xudong1 ZHANG Yufei4

1.Pharmacology Teaching and Research Section， Mudanjiang Medical University， Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China； 2.Department of Recovery， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University， Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China； 3.Academic Administration， Mudanjiang Medical University， Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China； 4.Medical Research Center， Mudanjiang Medical University， Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Bulbus Fritillariae Cirrhosae medicated serum on the proliferation of the bronchial smooth muscle cells （BSMC）， the tube formation and the expressions of vascular endothelial growth factor （VEGF） in BSMC. Methods The murine were sensititized and challenged with ovalbumin （OVA） to establish asthma model and Bulbus Fritillariae Cirrhosae medicated serum was prepared. The BSMC were cultured in vitro and randomly divided into the blank serum group， the low dose group and the high dose group. The proliferations of BSMC， the lengths of the tube formation， the expressions of VEGF and VEGF mRNA were detected. Results Compared with the blank serum group， the proliferations of BSMC， the lengths of the tube formation， the expressions of VEGF and VEGF mRNA of the low dose group and the high dose group were increased significantly （P < 0.05）. Conclusion Bulbus Fritillariae Cirrhosae medicated serum can inhibit the proliferations of BSMC and the lengths of the tube formation， and the possible mechanisms may be related to reduce the expressions of VEGF.

[Key words] Bulbus Fritillariae Cirrhosae medicated serum； Asthma； Bronchial smooth muscle cells； Vascular endothelial growth factor

支氣管哮喘簡稱哮喘，是一種呼吸系統(tǒng)的常見的慢性炎癥疾病，其病理特點表現(xiàn)為氣道炎癥導(dǎo)致持續(xù)性氣道高反應(yīng)性及可逆性氣流阻塞。而氣道重塑是哮喘的重要特征，與哮喘的反復(fù)發(fā)作和遷延不愈密切相關(guān)[1-2]。目前臨床上常用的抗炎藥，如糖皮質(zhì)激素，白三烯受體拮抗藥等，能迅速控住氣道炎癥，效果良好，但是仍然存在一些弊端，如停藥后的復(fù)發(fā)，長期用藥導(dǎo)致全身或局部的不良反應(yīng)等[3-4]。endprint

川貝為臨床常用中藥，有化痰止咳、清熱散結(jié)、潤肺之功效，多用于熱痰、燥痰、肺虛勞嗽、久嗽、痰少咽燥、痰中帶血等[5]。本研究前期實驗表明，川貝對哮喘模型小鼠具有很好的保護(hù)作用[6-8]。本研究旨在前期研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討觀察川貝含藥血清對支氣管平滑肌細(xì)胞（BSMC）增殖和管道形成及VEGF的影響，探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性BALB/C小鼠30只，6～8周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物合格證號為：P00102008，實驗動物使用許可證號：SYXK（黑）2008-033。本實驗通過哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員批準(zhǔn)。

1.1.2 中藥川貝粉的制備 中藥川貝粉由牡丹江醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實驗室制備。制備后的細(xì)粉用潔凈的塑料袋分裝成1 kg/袋備用。參照唐德才等[9]主編的《中藥學(xué)》所載成人所用劑量為3～6 g/d，根據(jù)動物體表面積等效劑量計算方法，計算小鼠給藥劑量18.0 mg/kg為高劑量組，9.0 mg/kg為低劑量組。臨用時，分別稱取川貝粉18 mg，9 mg各溶于生理鹽水5 mL制成混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物血清制備 將18只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組，高劑量組和低劑量組，每組各6只。小鼠預(yù)先禁食12 h后，高劑量組，低劑量組分別按照18.0 mg/kg，9.0 mg/kg劑量給予川貝粉灌胃給藥，正常組給予等體積的生理鹽水，每天 2次，連續(xù)3 d。末次給藥后，無菌條件下自心臟采血，離心血清（3000 r/min，4℃，20 min），血清經(jīng)56℃、30 min滅活，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后分裝，于-20℃冷藏備用。

1.2.2 模型建立 健康清潔級BALB/C小鼠12只，采用OVA制備哮喘小鼠模型。共制備成功10只。

1.2.3 BSMC分離培養(yǎng) 小鼠哮喘模型建立后，處死小鼠，取出肺組織，分離肌層剪碎，用0.25%胰蛋白酶，38.5℃水浴消化2 h左右。1000 r/min離心5 min后，棄上清。加入含10% 胎牛血清的RPMI1640的培養(yǎng)基，在20%O2、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天換液1次，14 d左右90%細(xì)胞融合后，傳代培養(yǎng)，實驗選用2～5代細(xì)胞。

1.2.4 BSMC分組及干預(yù) 按1×104個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分別給予中藥川貝低、高劑量含藥血清。另設(shè)空白血清對照組，給予正常組血清干預(yù)，各組設(shè)6個復(fù)孔。同時換用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.5 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）檢測BSMC增殖率 分組及給藥情況同1.2.4。每孔加入MTT溶液（5 g/L））20 μL，培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min。Rayto RT-6100酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定OD值。Graphpad 5.0計算抑制率。抑制率（%）=（1-OD給藥組/OD空白血清組）×100%，取6孔平均值。

1.2.6 管道形成實驗 分組及給藥情況同1.2.4。冰上預(yù)冷微量移液槍頭和96孔板。在每個孔內(nèi)緩慢加入50 μL Matrigel膠，然后培養(yǎng)30 min。BSMC用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至1×105個細(xì)胞/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)18 h。每個孔取上、下、左、右、中5個區(qū)域。每個區(qū)域隨機(jī)取1張圖片，在奧林巴斯倒置相差顯微鏡觀察并采集圖像，通過隨機(jī)攜帶的cellsens standard 軟件圖形軟件計算管道形成的總長度（單位mm）。取6孔平均值。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）分析 分組及給藥情況同1.2.4。提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳。當(dāng)電泳完成后，電轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入鼠抗人VEGF多克隆抗體（1∶1000稀釋）孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2000稀釋）二抗孵育2 h。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對各組條帶進(jìn)行計值及統(tǒng)計分析。每份樣品設(shè)6個平行孔。

1.2.8 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）分析 分組及給藥情況同1.2.4。Trizol試劑提取總RNA，檢測RNA純度，按照RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成單鏈的cDNA。cDNA 產(chǎn)物保存在-20℃。利用PubMed查找相關(guān)基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設(shè)計引物。RT-PCR反應(yīng)體系：體積為25 μL；反應(yīng)程序為：94℃變性45 s，55℃退火40 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。每個樣本以內(nèi)參基因GAPDH調(diào)整。取目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物各5 μL，擴(kuò)增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀測定擴(kuò)增產(chǎn)物條帶灰度并計算兩者的比值作為基因的相對表達(dá)量。每份樣品檢測6次。引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川貝含藥血清對BSMC增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，與空白血清組比較，低劑量組和高劑量組的OD值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 川貝含藥血清對BSMC管道形成長度的影響

管道形成實驗結(jié)果顯示，空白血清組可見較多管狀結(jié)構(gòu)，并且互相連接呈現(xiàn)出三維網(wǎng)狀的特征結(jié)構(gòu)，低劑量組和高劑量組可見多數(shù)的散在的BSMC，僅見極少數(shù)的線狀結(jié)構(gòu)，未見明顯的管腔結(jié)構(gòu)（圖1）。經(jīng)計算，與空白血清組比較，低劑量組和高劑量組的管道形成長度顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖2。endprint

2.3 川貝含藥血清對BSMC VEGF相對表達(dá)的影響

Western blot分析結(jié)果顯示，與空白血清組比較，低劑量組和高劑量組的BSMC VEGF的相對表達(dá)顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖3。

2.4 川貝含藥血清對BSMC VEGF mRNA相對表達(dá)的影響

RT-PCR分析結(jié)果顯示，與空白血清組比較，低劑量組和高劑量組的BSMC VEGF mRNA的相對表達(dá)顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖4。

3 討論

長期以來，研究者一直將氣道炎癥作為哮喘發(fā)生機(jī)制的研究重點，然而氣道重塑在哮喘的發(fā)病過程中具有同樣的重要作用。氣道重塑以氣道慢性炎癥為發(fā)生基礎(chǔ)，為炎癥慢性發(fā)展的必然結(jié)果，被認(rèn)為是哮喘防治的新靶點[10-11]。氣道重塑是慢性哮喘的重要病理特征。哮喘小鼠支氣管黏膜下、肺泡壁、肺間質(zhì)膠原大量沉積，氣道壁明顯增厚，氣道阻力增加，從而肺纖維化進(jìn)程加劇，最終導(dǎo)致肺功能降低[12]。在氣道受累組織可以發(fā)現(xiàn)BSMC的體量增加，包括BSMC的數(shù)目明顯增多，體積顯著增大，這個過程可以增強(qiáng)氣道重塑過程[13-14]。本研究證實，川貝含藥血清可有效抑制BSMC的增殖，提示川貝含藥血清可抑制哮喘的氣道重塑。

本研究在證實川貝含藥血清可有效抑制BSMC的增殖的同時，也證實了川貝含藥血清還具有抑制BSMC管道形成的能力。目前對于管道形成能力的機(jī)制研究提示，VEGF是重要影響因素[15]。研究表明，在哮喘患者氣道VEGF呈高表達(dá)，并且其表達(dá)的水平與氣道壁的厚度呈正相關(guān)，這提示在哮喘氣道重塑過程中VEGF發(fā)揮了重要作用[16-17]。也有研究表明，VEGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加微血管通透性、促進(jìn)血管生成和成熟的功能，是作用最強(qiáng)的促血管生長因子，且VEGF參與哮喘氣道重塑中平滑肌細(xì)胞增殖，是氣道重塑的指標(biāo)之一[18-20]。哮喘模型小鼠經(jīng)VEGF受體抑制劑治療后，支氣管平滑肌增厚程度顯著減輕，改善氣道重塑狀態(tài)。本研究也證實，川貝含藥血清可顯著降低VEGF和VEGF mRNA的表達(dá)。以上結(jié)果提示，川貝含藥血清抑制哮喘氣道重塑的機(jī)制可能與其抑制VEGF的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，中藥川貝含藥血清可有效抑制BSMC增殖和管道形成，從而改善氣道重塑狀態(tài)，其機(jī)制可能與其抑制VEGF的表達(dá)有關(guān)。至于是否存在其他機(jī)制，如是否與基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）有關(guān)，本研究將繼續(xù)探討。

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（收稿日期：2017-06-11 本文編輯：李岳澤）endprint