徐鳳丹　+王優(yōu)　吳文燊　謝松敏

[摘要] 目的 觀察高氧暴露對新生小鼠肺部炎性反應及纖維化的影響。 方法 新生2日齡昆明小鼠40只，隨機分為空氣組（n = 20）及高氧組（n = 20），分別在空氣或（60±5）%氧氣中飼養(yǎng)。每天檢測小鼠狀態(tài)，隔天記錄小鼠體重情況。在實驗第3、7、14、21天，每組各取5只小鼠處死，觀察肺組織外觀、計算肺組織濕/干重比值；HE染色觀察肺組織病理結構；天狼星紅染色觀察肺組織膠原纖維情況。 結果 ①實驗過程中兩組均未出現小鼠死亡；高氧組小鼠高氧暴露后第7天開始體重明顯低于空氣組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。②高氧暴露后第7天開始，小鼠肺濕重/干重比值均高于空氣組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。③高氧組肺部結構隨高氧暴露時間的增加逐漸出現典型支氣管肺發(fā)育不良（BPD）樣表現：肺泡呈不規(guī)則結構，腔隙較大，部分肺泡融合，整體數量減少，部分區(qū)域有炎性不張；高氧暴露后第14、21天，高氧組輻射狀肺泡計數（RAC）低于空氣組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。④高氧暴露后第7、14、21天，高氧組肺部膠原面積較空氣組顯著增加。 結論 持續(xù)高氧暴露可成功制作BPD小鼠模型；持續(xù)高氧暴露后可導致新生小鼠肺部炎性反應及纖維化增加，可能是BPD發(fā)生的重要機制。

[關鍵詞] 支氣管肺發(fā)育不良；新生小鼠；高氧暴露；炎性反應；纖維化

[中圖分類號] R722.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（b）-0021-04

Effects of hyperoxia on pulmonary inflammation and fibrosis in newborn mice

XU Fengdan1，2 WANG You1 WU Wenshen2 XIE Songmin2

1.Department of Pediatrics， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Dongguan 523808， China； 2.NICU， Dongguan Eighth People's Hospital， Guangdong Province， Dongguan 523235， China

[Abstract] Objective To observe the effects of hyperoxia exposure on pulmonary inflammatory response and fibrosis in new born mice. Methods 40 Kunming mice aged 2 days were randomly divided into air group （n = 20） and hyperoxia group （n = 20）， reared in air or （60±5）% oxygen respectively. The mice were examined daily and the weight was recorded the next day. At the 3rd， 7th， 14th， 21st day of the experiment， 5 mice of each group were sacrificed respectively， then the appearance of lung tissue， lung wet/dry weight ratio were observed； the pathological structure of lung tissue was examination by HE staining； collagen fiber of lung tissue was examination by Sirius red staining. Results ①No mouse died in the two groups during the experiment. The weight of mousein hyperoxia group was significantly was lower than that of air group at the 7th day after exposured to oxygen， the difference was statistically significant （P < 0.01）. ②The ratio of lung wet/dry weight in hyperoxia group was higher than that in air-group begin the 7th day after hyperoxia exposured， the difference was statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. ③In hyperoxia group， with the time of exposured to oxygen increasing， lung structure showed typical BPD： alveoli showed irregular structure， interstitial was large， partial alveoli fused， alveolar count decreased， partial region occured inflammatory closed； at the 14th， 21st day after hyperoxia exposured， RAC in hyperoxia group was lower than air group， the difference was statistically significant （P < 0.01）. ④Compared with air group， collagen area in hyperoxia-group increased at yhe 7th， 14th， 21st day after hyperoxia exposured. Conclusion BPD micemodels were successfully produced by sustained hyperoxia exposure. Sustained hyperoxia exposure may increase lung inflammation and fibrosis in neonatal mice， which may be an important mechanism for the development of BPD.endprint

[Key words] Bronchopulmonary dysplasia； Newborn rats； Hyporoxia； Inflammation； Fibrosis

支氣管肺發(fā)育不良（BPD），又稱新生兒慢性肺?。–LD），于1976年由Northway等[1]首次提出，是早產兒常見的慢性疾病，是吸氧和機械通氣治療早產兒后最常見的并發(fā)癥[2]。隨著醫(yī)療水平的提高，盡管早產兒存活率增加，但BPD發(fā)病率有逐年增加的趨勢，然而目前BPD的發(fā)病機制仍未完全明確，也缺乏有效防治方法[3-4]。成功建立動物BPD模型是臨床研究BPD發(fā)病機制的重要基礎，本文通過高氧暴露方法制作了BPD小鼠模型，并對肺組織炎性反應及纖維化情況進行了初步觀察，為進一步探討B(tài)PD發(fā)病機制及防治方法提供良好的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2日齡新生昆明小鼠40只，平均體重為（2.18±0.18）g，雌雄不限，購自軍事醫(yī)學科學院（動物合格證號：0026757）。

1.2 儀器及試劑

自制封閉聚乙烯高氧飼養(yǎng)箱、醫(yī)用氧氣瓶及氧氣（北京東方醫(yī)用氣體有限公司）、KY-2F型控氧儀（浙江省建德市新安江分析儀器二廠）、鈉石灰（上海五四化學試劑有限公司）、全自動組織脫水機（Thermo Excelsior ES）、BMJ-Ⅲ型包埋機（常州市中威電子儀器有限公司）、組織切片機、YD-AB型生物組織攤烤片機（金華市益迪醫(yī)療設備廠）、載玻片及蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）、倒置顯微鏡（尼康E100型）。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養(yǎng)及動物模型的建立 40只2日齡新生昆明小鼠，隨機分組，空氣組20只，高氧組20只。高氧組置于自制密封養(yǎng)殖箱中飼養(yǎng)，箱內氧濃度維持（60±5）%，底部鋪墊鈉石灰以吸附CO2，保持箱內溫度22～26℃，濕度50%～60%，CO2濃度<0.5%。母鼠與新生小鼠共處哺乳，每日交換2組母鼠。空氣組置于動物飼養(yǎng)房內。根據日齡增加、小鼠生長及營養(yǎng)狀況的進展，及時分箱并隨時調整飼料、飲用水添加量。在第3、7、14、21天每組各取5只小鼠處死，檢測相應指標。

1.3.2 肺濕重/干重比值 小鼠處死后立即取左上肺，稱取濕重。隨后置于60℃烘干機中72 h，干燥后稱取干重，計算濕重/干重比值。

1.3.3肺組織HE染色病理學觀察 取左下肺組織，固定于4%多聚甲醛中備用，后經20%蔗糖脫水過夜。肺組織石蠟包埋后進行切片，切片厚度為4 μm，常規(guī)方法進行HE染色，將染色處理后的肺組織切片置于200倍光學顯微鏡下，觀察病理改變。從細支氣管的中心部位至最近的纖維隔或胸膜做垂直連線，對該直線上的肺泡進行計數。每個小鼠取3個切片閱讀，每張切片計數5次，取平均值作為小鼠輻射狀肺泡計數（RAC）。

1.3.4 肺組織天狼星紅染色 肺組織石蠟切片脫蠟、蒸餾水水合，流水沖洗10 min，0.2%磷鉬酸液處理1～5 min，0.1%苦味酸天狼星紅染色90 min，0.01 mol/L鹽酸洗2 min，70.0%酒精漂洗45 s，封片。顯微鏡下觀察紅色膠原分布情況。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 15.0對數據進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

實驗過程中兩組均未出現小鼠死亡現象。高氧組小鼠處理后7 d開始與對照組差異逐漸增大，表現為體重下降，毛發(fā)蓬松、光澤差，反應變差，離氧時間長則表現為少動，呼吸急促，口唇及趾端發(fā)紺，至高氧環(huán)境中則活動增多，至第21天時兩組間差異更明顯?？諝饨M體重增長良好，活潑好動，毛發(fā)有光澤。兩組體重變化見表1，圖1～2。

2.2 肺濕重/干重比值

高氧組肺組織外觀較蒼白，水腫明顯（圖3）；從高氧處理后第7天開始，高氧組肺濕重/干重比值均高于空氣組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）（表2）。

2.3 肺組織HE染色病理學觀察

2.3.1 石蠟切片HE染色 空氣組肺泡間隔相對均勻，高氧組肺部結構隨高氧暴露時間延長逐漸出現典型BPD樣表現：早期肺泡間隔增厚，可見出血和炎性細胞浸潤，后期肺泡呈不規(guī)則結構，腔隙較大，部分肺泡融合，整體數量減少，部分區(qū)域有炎性不張，提示成功建立了高氧誘導BPD模型（圖4）。

2.3.2 RAC 空氣組RAC隨日齡逐漸增加，而高氧組RAC隨高氧暴露時間延長而逐漸減少?？諝饨M及高氧組處理后第3、7天RAC比較差異無統計學意義，高氧組處理后第14、21天低于空氣組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表3。

2.4 肺組織天狼星紅染色觀察肺纖維化情況

高氧組膠原纖維隨高氧暴露時間延長而逐漸增多，分布廣泛。圖像分析結果顯示：第7、14、21天時高氧組膠原面積均較空氣組顯著增加（圖5，封三）。

3 討論

近年來，隨著新生兒危重癥救治水平的提高，早產兒、尤其是小早產兒存活率明顯提高，然而BPD的發(fā)病率也呈現上升趨勢[5]。BPD患兒病死率較高，疾病負擔重[6]，存活者因心肺功能異常其生活質量差，甚至部分發(fā)生腦癱和神經發(fā)育延遲，預后不良[7-11]。目前BPD尚無有效防治方法，因此，亟待探討其發(fā)病機制，為臨床防治BPD提供實驗依據。BPD是一種多因素疾病，其確切發(fā)病機制仍未完全明確，研究顯示與肺發(fā)育不成熟、高氧損傷、感染、炎性反應、纖維化及機械應力損傷等有關。新生鼠的肺發(fā)育相當于胎齡28周人肺的發(fā)育情況，因此對新生鼠肺發(fā)育的研究可為人類早產兒肺發(fā)育及肺部疾病提供研究基礎[12]。BPD動物模型建立的方法很多，常用的有高氧誘導、博萊霉素肺內注射、內毒素誘導及機械通氣誘導等，目前高濃度氧吸入是使用最早、最經典的制作方法[13]。研究發(fā)現，單一的高氧暴露可復制出典型的BPD病理改變[14]。目前高氧暴露的氧濃度可分為80%～100%的高濃度氧和60%～70%的中濃度氧兩種，實驗發(fā)現，80%～100%的高濃度氧造模時間短，但對肺損傷重，死亡率達40%，而60%～70%中濃度氧雖然造模時間較長，但死亡率低，更接近于臨床實際[15]。本研究以2日齡新生小鼠為對象，飼養(yǎng)于（60±5）%的持續(xù)高氧環(huán)境中，結果顯示能成功制作BPD的新生小鼠模型且死亡率低，為進一步探討B(tài)PD的病理改變及發(fā)病機制提供了良好的動物模型。endprint

肺發(fā)育成熟的重要標志是體積大、數目少的囊泡向體積小、數目多的肺泡轉化。BPD患兒的尸檢發(fā)現，其肺組織的主要病理改變?yōu)榉闻莼系K，從而推測BPD的病理特征為肺組織從囊泡期向肺泡期發(fā)育阻滯[16-18]。本研究結果顯示，高氧組新生小鼠肺部結構隨日齡增加逐漸出現典型BPD樣表現：早期肺泡間隔增厚，后期肺泡呈不規(guī)則結構，腔隙較大，部分肺泡融合，整體數量減少，與空氣組比較，高氧組高氧暴露后第7天RAC即明顯降低，至高氧暴露后第21天差異更明顯，符合BPD患兒的肺組織病理改變。肺組織中可見出血和炎癥細胞浸潤明顯，部分區(qū)域有炎性不張，也提示高氧暴露可使炎性反應明顯增加，在BPD的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。本實驗發(fā)現，與對照組比較，高氧組小鼠生后第7天開始體重下降明顯，至第21天時兩組間差異更明顯，考慮與高氧組肺泡數量減少，肺間隔增厚，影響氣體交換過程，提供的氧氣滿足不了機體生長的需求，導致機體生長發(fā)育受限。

有研究發(fā)現，肺纖維化是BPD的主要病理表現之一，而膠原沉積是肺纖維化的重要原因，故可將肺膠原檢測作為衡量肺纖維化的主要標志。膠原在正常肺發(fā)育過程中可于血管壁呈現高表達，但在BPD患者肺泡壁表達則明顯增加，本實驗采用天狼星紅染色顯示肺組織纖維化情況，結果亦證實持續(xù)高氧暴露可使肺泡壁膠原明顯增加，符合既往研究[19-20]結果。

綜上所述，本研究通過高氧暴露成功建立了新生小鼠BPD模型，并發(fā)現炎性反應及纖維化在BPD發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

[參考文獻]

[1] Northway WH Jr，Rosan RC，Porter DY. Pulmonary disease following respiratory therapy of hyaline-membrane disease.Bronchopulmonary dysplasia [J]. N Engl J Med，1967，276（7）：357-368.

[2] Ali Z，Schmidt P，Dodd J，et al. Bronchopulmonary dysplasia： a review [J]. Arch GynecolObstet，2013，288（2）：325-333.

[3] Rudloff I，Cho SX，Bui CB，et al. Refining anti-inflammatory therapy strategies for bronchopulmonary dysplasia [J]. J Cell Mol Med，2017，21（6）：1128-1138.

[4] Bassker D. Inhalation or instillation of steroids for the prevention of bronchopulmonary dysplasia [J]. Neonatology，2015，107（4）：358-359.

[5] Glass HC，Costarino AT，Stayer SA，et al. Outcomes for extremely premature infants [J]. Anesth Analg，2015，120（6）：1337-1351.

[6] Johnson TJ，Patel Air，Jegier BJ，et al. Cost of morbidities in very low birth weight infants [J]. J Pediatr，2013，162（2）：243-249.

[7] Wong PM，Lees AN，Louw J，et al. Emphysema in young adult survivors of moderate-to-severe bronchopulmonary dysplasia [J]. Eur Respir J，2008，32（2）：321-328.

[8] Greenough A. Long-term pulmonary outcome in the preterm infant [J]. Neonatology，2008，93（4）：324-327.

[9] Khemani E，McElhinney DB，Rhein L，et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia：clinical features and outcomes in the surfactant era [J]. Pediatrics，2007，120（6）：1260-1269.

[10] Mourani PM，Ivy DD，Rosenberg AA，et al. Left ventricular diastolic dysfunction in bronchopulmonary dysplasia [J]. J Pediatr，2008，152（2）：291-293.

[11] Anderson PJ，Doyle LW. Neurodevelopmental outcome of bronchopulmonary dysplasia [J]. SeminPerinatol，2006，30（4）：227-232.

[12] Cherukupalli K，Larson JE，Rotschild A，et al. Biochemical，clinical，and morphologic studies on lungs of infants with bronchopulmonary dysplasia [J]. Pediatr Pulmonol，1996， 22（4）：215-229.endprint

[13] 紀衛(wèi)華，富建華，薛辛東.上皮鈉通道在高氧致新生大鼠支氣管肺發(fā)育不良早期肺水腫發(fā)生中的作用[J].中國綜合臨床，2013，29（2）：204-208.

[14] Yla-Herttuala S. An update on angiogenic gene therapy：vascular endothelial growthfactor and other directions [J]. Curr Opin Mol Ther，2006，8（4）：295-300.

[15] Warner BB，Stuart LA，Papes RA，et al. Functional and pathological effects ofprolonged hyperoxia in neonatal mice [J]. Am J Physiol，1998，275（1 Pt 1）：L110-L117.

[16] 早產兒支氣管發(fā)育不良調查協作組.早產兒支氣管肺發(fā)育不良發(fā)生率及高危因素的多中心回顧調查分析[J].中華兒科雜志，201l，49（9）：655-622.

[17] Erritt TA，Deming DD，Boynton BR. The new broncho？鄄pulmonary dysplasia：challenges and commentary [J]. Sem？鄄inFetal Neonatal Med，2009，14（6）：345-357.

[18] Jobe AH，Bancalari E. Bronehopulmonary dysplasia [J]. Am J Respir Crit Care Med，2001，163（7）：1723-1729.

[19] Ponticos M，Holmes AM，Shi-wen X，et al. Pivotal role of connective tissue growth factor in lung fibrosis：MAPK-dependent transcriptional activationoftypeI collagen [J]. Arthritis Rheum，2009，60（7）：2142-2155.

[20] Farkas L，Gauldie J，Voelkel NF，et al. Pulmonary hyper？鄄tension and idiopathic pulmonary fibrosis：a tale of angio？鄄genesis，apoptosis，and growth factors [J]. Am J Respir Cell MolBiol，2011，45（1）：1-15.

（收稿日期：2017-06-13 本文編輯：蘇 暢）endprint