北京市醫(yī)療器械檢驗所（101111）吳曉麗 劉曦

測量不確定度的定義為表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)。在理化檢測中，對各類影響因素進行分析，評定其不確定度，不僅能幫助檢測人員確定檢測結(jié)果的可信程度，確保檢測結(jié)果的準確可靠，還能有助于識別出測定過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，重點關(guān)注關(guān)鍵環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，有效提高檢測工作的質(zhì)量[1]。因此對測定方法進行不確定度評估是必要的。

膠原蛋白的特殊組織結(jié)構(gòu)賦予其良好的止血及促進傷口愈合及組織修復功能，并具有高生物可降解性、高生物可吸收性、低抗原性等功能，這使其在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域具有良好及廣泛的應用前景，廣泛應用于止血、創(chuàng)面愈合、骨缺損、神經(jīng)修復等方面，被視為在科研和臨床應用中最有用途的生物材料之一[2][3]。

附表1 蛋白質(zhì)含量重復性測定數(shù)據(jù)

本文以國家計量規(guī)范及相關(guān)文獻作為理論和方法指導[4-8]，對凱氏定氮法測定膠原蛋白海綿中蛋白質(zhì)含量的不確定度進行了評估，最終得出檢測結(jié)果的擴展不確定度值。

1 原理

參考《中華人民共和國藥典》2015版四部通則蛋白質(zhì)含量測定法第一法凱氏定氮法[9]中鎢酸沉淀法對膠原蛋白海綿中蛋白質(zhì)含量進行測定。通過測定供試品的總氮含量以及經(jīng)鎢酸沉淀去除蛋白質(zhì)的供試品濾液中的非蛋白質(zhì)氮含量，計算出蛋白質(zhì)的含量。

2 儀器與試劑

硫酸標準滴定溶液（0.100mol/L）,容量瓶（100mL），滴定管（25mL、分度0.1mL），吸管（2mL、5mL、10mL和25mL），分析天平（0.01mg），定氮蒸餾裝置，硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、濃硫酸、硼酸、鎢酸鈉：均為分析純。試驗用水：Milli-Q純水機制備的超純水。

3 試驗過程

3.1 測定總氮含量樣品的消化 精密稱取樣品m1（精確至0.0001g），置凱氏定氮瓶中，加入0.3g硫酸銅、3g硫酸鉀和20mL硫酸消化至澄明，呈藍綠色，繼續(xù)消化1h，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用超純水定容。

3.2 測定非蛋白氮含量樣品的消化 精密稱取樣品m2，加水14mL、10%鎢酸鈉溶液2mL、0.33mol/L硫酸溶液2mL，搖勻，靜置30分鐘過濾，取濾液5mL，置凱氏定氮瓶中，加入0.3g硫酸銅、3g硫酸鉀和20mL硫酸消化至澄明，呈藍綠色，繼續(xù)消化1h，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用超純水定容。

3.3 測定 準確吸取10mL用于總氮含量測定的樣品試液加入定氮蒸餾裝置中進行蒸餾，接收液用0.005mol/L硫酸滴定液進行滴定至溶液顏色為灰紫，記錄所消耗的硫酸滴定液體積v1（mL）。將用于非蛋白氮含量測定的樣品試液移入定氮蒸餾裝置中，重復以上蒸餾、滴定步驟，記錄所消耗的硫酸滴定液體積v2（mL）。將空白對照溶液移入定氮管內(nèi)，重復以上蒸餾、滴定步驟，用空白試驗進行校正，記錄所消耗的硫酸滴定液體積v0（mL）。

4 建立數(shù)學模型

式中：x—樣品中蛋白質(zhì)含量，%；v1—樣品總氮含量測定溶液消耗的硫酸滴定液體積，mL；v2—樣品非蛋白氮含量測定溶液消耗的硫酸滴定液體積，mL；v0—空白對照溶液消耗的硫酸滴定液體積，mL；C—硫酸滴定液濃度（C(1/2H2SO4)），mol/L；n1—用于總氮含量測定的樣品稀釋倍數(shù)；n2—用于非蛋白氮含量測定的樣品稀釋倍數(shù)；m1—用于總氮含量測定的樣品質(zhì)量，mg；m2—用于非蛋白氮含量測定的樣品質(zhì)量，mg；14.01—氮的相對原子質(zhì)量；F—5.55，換算系數(shù)（1g氮相當于5.55g蛋白質(zhì)）。

5 不確定度的來源與量化

式中：urel(x)—膠原海綿中蛋白質(zhì)含量的相對不確定度；urel(f)—樣品重復性測定產(chǎn)生的相對不確定度；urel(A)—測定樣品與空白時所用器具產(chǎn)生的相對不確定度；urel(c)—硫酸標準滴定溶液產(chǎn)生的相對不確定度；urel(m)—天平稱量產(chǎn)生的相對不確定度。

6 不確定度分量的評定

6.2.2 移液管引入的不確定度UrelV)測定樣品與空白時用到2mL移液管、5mL移液管、10mL移液管和25mL分度吸管，按均勻分布，各個移液管的相對標準不確定度見附表2。

附表2 移液管的不確定度

7 擴展不確定度分析

8 結(jié)論

由評定結(jié)果可以看出，膠原海綿中蛋白質(zhì)含量測量結(jié)果的不確定度主要來自于樣品的稱量、移取、稀釋和重復性測定，其他部分的不確定度已隨機化，對測量結(jié)果的不確定度影響很小，均放在測量重復性不確定度中考慮。在實際工作中，應對影響測量結(jié)果的各種主要因素嚴格控制，以減少測量結(jié)果的不確定度，提高測量結(jié)果的可信度。樣品的稱量、移取、稀釋和重復性測定是凱氏定氮法測定膠原蛋白海綿中蛋白質(zhì)含量不確定度的主要因素，在試驗中使用的玻璃儀器均為A級，不能通過提高器具的精密度改善結(jié)果，但可以通過下列措施對上述不確定度主要因素進行優(yōu)化，可使測定結(jié)果更加可靠。①使用自動化凱氏定氮儀器對樣品進行消化和滴定，將有效控制試驗過程中產(chǎn)生的隨機誤差，降低由試驗重復性引起的不確定度。②在試驗方法允許的前提下，通過優(yōu)化樣品的取樣量和滴定管的體積，降低天平稱量產(chǎn)生的相對不確定度Urel(m)和滴定管引入的相對不確定度Urel(B)，從而降低本方法的不確定度。