段巨濤，張琦

電轉(zhuǎn)法介導(dǎo)沉默ABCE1基因?qū)θ四懩野┘?xì)胞基因表達(dá)及增殖能力的抑制作用

段巨濤1，張琦2

目的：研究電轉(zhuǎn)法沉默ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子E1（ABCE1）基因表達(dá)后對人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞基因表達(dá)及增殖能力的抑制作用。方法：構(gòu)建靶向ABCE1基因的載siRNA質(zhì)粒（ABCE1-siRNA）以及陰性對照質(zhì)粒（NC-siRNA），分別設(shè)置ABCE1-siRNA組、NC-siRNA組及空載組，于體外電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)染至人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞，形成ABCE1-GBC-SD、NC-siRNA-GBC-SD、Ctrl-GBC-SD細(xì)胞。分別采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）、蛋白印跡（Western blotting）檢測電轉(zhuǎn)后細(xì)胞中ABCE1基因mRNA與蛋白的表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀檢測GBC-SD細(xì)胞周期及凋亡，CCK-8法測定GBC-SD細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果：成功構(gòu)建靶向ABCE1基因的載siRNA質(zhì)粒。與對照組相比，電轉(zhuǎn)后ABCE1-GBC-SD細(xì)胞中ABCE1基因mRNA（0. 45±0.06）和蛋白表達(dá)水平（0.65±0.10）顯著降低（P＜0.05）；ABCE1-GBC-SD組細(xì)胞的生長速度減慢（P＜0.05），細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期，S期的細(xì)胞數(shù)減少；與空載組相比，ABCE1-GBC-SD組細(xì)胞凋亡率(16.80±3.58)顯著升高（P＜0.01）。結(jié)論：體外電轉(zhuǎn)沉默ABCE1基因的表達(dá)后能夠抑制膽囊癌細(xì)胞的基因表達(dá)及增殖能力。

膽囊癌;ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子E1;電轉(zhuǎn)法；細(xì)胞增殖

膽囊癌是膽道系統(tǒng)中較為常見的惡性腫瘤，其地區(qū)分布不均，男女比例約為1∶2，女性明顯多于男性[1]，因早期癥狀不明顯，大多數(shù)的患者于中晚期方能確診，預(yù)后相對差。目前膽囊癌的綜合治療方案有多樣，但由于膽囊癌易局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此臨床醫(yī)生仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子E1(ATP-binding cassetteE1,ABCE1)與多數(shù)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移有密切關(guān)聯(lián)[2]。目前國內(nèi)外關(guān)于研究ABCE1基因抑制與膽囊癌細(xì)胞生物學(xué)特性的的文獻(xiàn)較少見報道。本文研究將設(shè)計、合成靶向ABCE1的載siRNA基因（ABCE1-siRNA）電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)染至人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞，沉默膽囊癌GBC-SD細(xì)胞ABCE1基因后，分析膽囊癌GBC-SD細(xì)胞的生物學(xué)行為的特性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞購自大連寶生物公司，rAAV-hTERT及空載rAAV由本元正陽基因技術(shù)股份有限公司提供；L-DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。RT-PCR兩步法試劑盒購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生化有限公司，耐熱性TaqDNA聚合酶購自杭州博日。CCK-8試劑盒購自北京博奧森公司。細(xì)胞周期檢測試劑盒購自美國Becon Dickinson公司。流式細(xì)胞儀(美國Bio-Rad公司)；RNA提取試劑Trizol、L質(zhì)粒提取試劑盒(GibcoBRL公司)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)；CCK-8(美國Becon Dickinson公司產(chǎn)品)；PCR引物序列(由上海閃晶生物公司設(shè)計并合成)。

1.2 靶向ABCE1的siRNA設(shè)計與合成根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]所設(shè)計的ABCEABCE1-siRNA序列,正義序列5'-ATCCGCTACAGCGAGTACGTTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAAACGTACTCGCTTAGCTTTTTTG-3'，反義序列：5'-AATFCAAAAAAGCTACAGCGAGTACGTTTACCCCATCTGTGGCTTCACAGGTAAACGTACTCGCTGTAGCG-3'；無同源性的陰性對照序列（negative control siRNA，NC-siRNA）正義序列：5'-GATCCGCGAGACCTCAGTATGTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAACATACTGAGGTCTCGCTTTTTTG-3'，反義序列：5'-AATTCAAAAAAGCGAGACCTCAGTATGTTACCCATCTGTGGCTTCACAGGTAACATACTGAGGTCTCGCG-3'。

1.3 ABCE1-siRNA電轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞取對數(shù)生長期的GBC-SD細(xì)胞，制成單細(xì)胞的懸液，PBS洗滌、胰酶消化、離心后，加入電轉(zhuǎn)液，重懸GBC-SD細(xì)胞，離心800 g，5 min,洗滌GBC-SD細(xì)胞3次,離心后重懸于電轉(zhuǎn)液中，移入電擊杯，加入10 μg ABCE1-siRNA質(zhì)粒，混勻，放置于冰上0.5 h后，行電穿孔（電壓450 V/cm，電容25 μF，時間0.9 ms），轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞命名為ABCE1-GBC-SD細(xì)胞（實驗組），室溫下放置0.5 h，將細(xì)胞移入加有DMEM培養(yǎng)基（含10%小牛血清，1%雙抗）的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，同時空載體電轉(zhuǎn)染作為對照（細(xì)胞命名為Ctrl-GBC-SD細(xì)胞），同時NC-siRNA電轉(zhuǎn)染作為陰性對照組，于轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行RNA干擾效應(yīng)的檢測。

1.4 RT-PCR檢測ABCE1 mRNA的表達(dá)分別收集ABCE1-GBC-SD、NC-siRNA-GBC-SD、Ctrl-GBC-SD組細(xì)胞1.5×107個，PBS沖洗3次，以TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴增。ABCE1上游引物：5'-TTGGTTGTGGGAAGTCGT-3'，下游引物：5'-GCTTATGTAGTTAATGGGAGGT-3'，擴增產(chǎn)物為415 bp。GAPDH引物序列：上游引物：5'-GAGTCAACGGATTGGTCGT-3'，下游引物：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'，擴增產(chǎn)物為185 bp。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)。PCR的產(chǎn)物通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，用UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus 7.0軟件分析各條結(jié)果，用ABCE1/GAPDH的比值表示ABCE1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 Westem blotting檢測ABCE1蛋白的表達(dá)收集每組生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞1×107個，細(xì)胞棄培養(yǎng)液后PBS沖洗3次，提取總蛋白，通過BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，吸取50 μg總蛋白，行10%SDS-PAGE電泳，通過電轉(zhuǎn)移(40 V 150 min的轉(zhuǎn)印條件)印跡到PVDF膜上，封閉5%脫脂奶粉FIBS液中，于37℃下孵育2 h。一抗孵育：加入1∶1000稀釋的ABCE1多克隆一抗，4℃過夜，TBST洗膜5次，5 min/每次，二抗孵育：加入1∶5000 HRP標(biāo)記的二抗,于37℃孵育2 h PBS洗滌，采用ECL法檢測。通過GDSS000凝膠自動成像系統(tǒng)攝像。Image-Pro Plus 8.0軟件分析條帶灰度值，以ABCE1/GAPDH代表ABCE1的相對表達(dá)量。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測GBC-SD細(xì)胞周期收集各組GBC-SD細(xì)胞，調(diào)整GBC-SD細(xì)胞密度至1×106個/L，經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌2次,細(xì)胞沉淀用70%冰乙醇4℃混勻備用，洗滌細(xì)胞，PBS調(diào)整細(xì)胞密度至1× 106/mL，與含50 μg/mL RNA酶的Tris-HCl緩沖液（pH7.4）共同孵育30 min。1 μg/mL碘化丙啶進(jìn)行GBC-SD細(xì)胞的DNA染色，室溫避光保存30 min后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡，實驗重復(fù)3次。

1.7 CCK8法檢測GBC-SD細(xì)胞的增殖收集指數(shù)生長期細(xì)胞的3組細(xì)胞(實驗組、空白對照組、陰性對照組)，以l×103密度接種在96孔板中，用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基200 μL，每組設(shè)6個復(fù)孔，于37℃，5%CO2，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8)20 μL，于培養(yǎng)箱溫育4 h后，以不加細(xì)胞空白孔為對照組。用CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔490 nm處的吸光值(A)。細(xì)胞吸光度A值平均值作為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件包處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間連續(xù)變量比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABCE1-siRNA轉(zhuǎn)染抑制GBC-SD細(xì)胞中ABCE1 mRNA的表達(dá)RT-PCR檢測結(jié)果（見圖1）顯示，與對照組相比較，實驗組ABCE1 mRNA的表達(dá)為（0.45±0.06），明顯少于空白對照組(0.69± 0.07)和陰性對照組(0.71±0.09)（P＜0.05）?？瞻讓φ战M和陰性對照組比較ABCE1 mRNA的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。表明ABCE1-siRNA轉(zhuǎn)染能夠有效抑制GBC-SD細(xì)胞中ABCE1 mRNA的表達(dá)。2.2 siRNA抑制ABCE1蛋白的表達(dá)ABCE1蛋白檢測結(jié)果見圖2，與陰性對照組(0.97±0.12)和空白對照組(0.98±0.11)比較，實驗組ABCE1蛋白表達(dá)(0.65±0.10)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）?？瞻讓φ战M和陰性對照組比較，ABCE1蛋白的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。表明了ABCE1-siRNA轉(zhuǎn)染能夠有效抑制GBC-SD細(xì)胞中ABCE1蛋白的表達(dá)。

圖2 ABCE1-siRNA轉(zhuǎn)染抑制GBC-SD細(xì)胞后ABCE1蛋白的表達(dá)

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測ABCE1-GBC-SD細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀分析結(jié)果示，與空白對照組和陰性對照組比較，實驗組G0/G1期細(xì)胞與S期細(xì)胞分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；空白對照組和陰性對照組間G0/G1期與S期細(xì)胞分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明了ABCE1-siRNA將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，見表1。

表1 各組細(xì)胞周期分布及凋亡率（%）

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測ABCE1-GBC-SD細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞儀分析顯示，實驗組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；空白對照組和陰性對照組凋亡率無顯著性差異（P＞0.05），見表1。

2.5 CCK-8法檢測ABCE1-GBC-SD細(xì)胞增殖降低

依CCK-8法檢測結(jié)果繪制的生長曲線顯示，實驗組組較對照組曲線明顯降低（見圖3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

圖3 CCK-8法檢測ABCE1-GBC-SD細(xì)胞增殖率

表2 Absorbance at 490 nm（±s，n=6)

表2 Absorbance at 490 nm（±s，n=6)

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與陰性對照組比較，bP＜0.05

組別空白對照組陰性對照組實驗組48 h 0.6±0.040.6±0.060.6±0.0472 h 1.8±0.151.7±0.111.4±0.12a、b 96 h 2.5±0.162.4±0.121.8±0.11a、b 120 h 2.9±0.132.8±0.142.2±0.10a、b

3 討論

由于膽囊癌早期無特異性臨床表現(xiàn)，患者確診時多已至晚期，據(jù)統(tǒng)計，膽囊癌全國平均死亡率為0.45/（10萬），位于全國惡性腫瘤的第19位，消化道腫瘤的第6位[4]。近年來，我國膽囊癌發(fā)病率有所上升[5]。目前治療膽囊癌的綜合治療手段多種多樣，但膽囊癌手術(shù)切除率低，僅有10%的患者有手術(shù)機會[6-7]。手術(shù)療效也不甚理想，術(shù)后5年生存率不到5%[8]。對放化療效果不明顯，發(fā)生周圍重要組織及臟器浸潤與轉(zhuǎn)移早，預(yù)后差，膽囊癌術(shù)后經(jīng)綜合治療后的再次部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是臨床醫(yī)生面臨的巨大難題。因此，尋找有效預(yù)防和治療膽囊癌的方法具有極為重要臨床意義及社會價值。

目前隨著人類基因組計劃圓滿的完成以及不斷的發(fā)展的功能基因科學(xué)研究表明[9]，基因調(diào)控參與了多種腫瘤細(xì)胞（如肝癌、肺癌、前列腺癌等）的增殖、侵襲及遷移，因此在基因角度有效的抑制腫瘤發(fā)展的作用成為新的研究焦點，醫(yī)學(xué)界研究人員非常重視此方面的研究[10]。目前研究表明抑制惡性腫瘤細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移的關(guān)鍵[11]。位于常染色體4q31上的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子E1基因編碼相對分子量約為68 kDa的蛋白質(zhì)，屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子基因亞家族的成員之一，于人體各組織器官中持續(xù)表達(dá)，全長cDN A序列的編碼為599個氨基酸，參與腫瘤細(xì)胞的增殖分化、侵襲、遷移以及蛋白質(zhì)的合成，主要通過抑制細(xì)胞內(nèi)核糖核酸酶L(RNase-L)的活性來抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用[12]。相關(guān)研究表明，在正常細(xì)胞內(nèi)RNase L由于2-5寡聚核苷酸含量(2-5A/RNase L)的增加而被激活，激活后的RNase L具有特異性抑制68kDa蛋白、抑制蛋白質(zhì)合成、降解RNA、阻止細(xì)胞增生失控、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。理論上通過阻斷腫瘤細(xì)胞中ABCE1的表達(dá)能有效抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)展，成為在基因治療方面有效治療惡性腫瘤的新方法[12-13]。研究表明[11-13]在結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、直腸癌的細(xì)胞中存在ABCE1基因過度表達(dá)的情況。ABCE1基因沉默后影響腫瘤細(xì)胞增殖凋亡。但其對膽囊癌的生物學(xué)行為是否有影響國內(nèi)外文獻(xiàn)報道較少見。

近些年來相關(guān)實驗研究中獲得高效又較為理想的轉(zhuǎn)染方法是外源DNA在高壓電場電脈沖的作用下可由細(xì)胞膜瞬間出現(xiàn)的微小孔洞通過并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[14-15]。本研究將設(shè)計及合成靶向ABCE1的siRNA序列（ABCE1-siRNA）以及陰性對照序列（NC-siRNA）電穿孔法轉(zhuǎn)染至人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞，分別形成ABCE1-GBC-SD、NC-siRNA-GBC-SD細(xì)胞通過RT-PCR、Western blotting發(fā)現(xiàn)檢測電轉(zhuǎn)后細(xì)胞中ABCE1 mRNA與蛋白的表達(dá)受到阻斷，檢驗證實其靶向沉默ABCE1基因的效果，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡，CCK-8增殖實驗測定人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示ABCE1-GBC-SD細(xì)胞中ABCE1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，ABCE1-GBC-SD細(xì)胞的生長速度明顯減慢，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞數(shù)減少，ABCE1-GBC-SD細(xì)胞的增殖能力顯著下降，凋亡率明顯升高。

本研究結(jié)果表明在體外人膽囊癌組織中沉默ABCE1基因能抑制腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)及增殖能力，為下一步體內(nèi)實驗奠定基礎(chǔ)。

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Effect of ABCE1 Gene Silencing by Electroporation on Proliferation and Migration of Human Gallbladder Cancer Cells GBC-SD

DUAN Ju-tao,ZHANG Qi Nankai Clinical Medicine College of Tianjin Medical University,Tianjin(300100),China

ObjectiveTo study the effect of ATP-binding cassette E1(ABCE1)gene silencing by electro?poration on the survival and cell cycle of human gallbladder cancer cells GBC-SD.MethodsThe siRNA against ABCE1 was constructed and transfected into GBC-SD cells by electroporation in vitro.The expression of ABCE1 was detected by RT-PCR and Western blot.Flow cytometry was used to detect the cell cycle distribu?tion and apoptosis.The effects of ABCE1 gene silencing by electroporation on proliferation of GBC-SD cell line were evaluated by CCK-8 assay.ResultsCompared with the control group,the mRNA(0.45±0.06)and pro?tein levels(0.65±0.10)were significantly decreased in the experimental group when ABCE1 gene was silenced by electroporation.The cell cycle was arrested at Go/G1phase and cell number in S phase was decreased in GBC-SD cell line(P＜0.05).The cell growth inhibition ratio in the experimental group was significantly higher than that in the control group and blank group(P＜0.01).Compared with the control group and the blank group, CCK-8 proliferation experiment showed that GBC-SD cell proliferation was inhibited significantly in the experi?mental group(P＜0.05).ConclusionABCE1 is involved in the progression of gallbladder cancer.Inhibiting the expression of ABCE1 by electroporation can decrease gene expression and proliferation ability of tumor cells in vitro.

Gallbladder cancer;ATP-binding cassette E1;electroporation;cell proliferation

R735.8

A

1007-6948(2017)05-0523-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.05.016

1.天津醫(yī)科大學(xué)南開臨床醫(yī)學(xué)院（天津300100） 2.天津市南開醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所（天津300100）

張琦，E-mail:zhangqi8501@126.com

（收稿：2016-11-26 修回：2017-07-20）

（責(zé)任編輯 王豐）